專利名稱：來自棉花恢復系中含有26S rRNA序列的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個來自棉花恢復系中含有26S核糖體RNA(rRNA)序列的新基因。該基因是通過抑制差減雜交的方法獲得來自棉花恢復系的EST序列之后，以該EST序列設(shè)計引物再做5’和3’RACE，從而獲得其全長cDNA序列。該基因的3’端含有26S rRNA序列，5’端是一個全新的序列。由于該基因來源于陸地棉(Gossypium hirsutum)恢復系Y18R，并且編碼392個氨基酸的蛋白質(zhì)，因此將其命名為GH18Rorf392。該基因可用于棉花育性相關(guān)功能的研究。
背景技術(shù)：
棉花具有十分明顯的雜種優(yōu)勢，利用棉花雜種優(yōu)勢已成為一種提高產(chǎn)量、品質(zhì)和抗病性的有效途徑。由于棉花胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，簡稱CMS)在雜交優(yōu)勢利用中所占的地位，最初遺傳育種工作者致力于收集選育不同作物的各種雄性不育種質(zhì)，為生產(chǎn)應用和理論研究打下了基礎(chǔ)。20世紀60年代以來，Meyer等人先后培育了具有異常棉(Gossypium.anomalum)、亞洲棉(G.arboreum)、哈克尼西棉(G.harknessii)胞質(zhì)雄性不育系，并實現(xiàn)了三系配套。但存在恢復系狹窄、可育性不穩(wěn)定、以及雜種優(yōu)勢不明顯等問題。2005年中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所郭三堆課題組的“轉(zhuǎn)抗蟲基因三系雜交棉分子育種體系”成果通過了國家鑒定，成功地創(chuàng)建了高產(chǎn)量、高純度、高效率、大規(guī)模、低成本、能夠直接應用的轉(zhuǎn)抗蟲基因三系雜交棉常規(guī)育種與分子育種相結(jié)合的新體系。
核恢復基因(nuclear restorer gene for fertility，簡稱Rf基因)在CMS中所起的作用是不容忽視的。在Rf基因存在的核背景下，與CMS相關(guān)的線粒體DNA的突變表型可得到有效校正，花粉敗育現(xiàn)象得到抑制，因而育性得以恢復。這就顯示只有在真正了解恢復基因與線粒體CMS相關(guān)基因相互作用的情況下，才能完整地解釋CMS分子機理，并進一步促進CMS在農(nóng)業(yè)上的應用(徐秉芳，2000，植物生理學通訊，36(6)573-580)。然而，有關(guān)細胞質(zhì)雄性不育線粒體基因組的研究已有很多論述，相比之下涉及核恢復基因的工作相當零散，其中有一部分是在研究不育線粒體基因組時附帶提及的。歸納起來有關(guān)恢復基因的工作主要包括兩個方面一是對比不育系在引入恢復基因前后，線粒體不育基因表達樣式的差異，從而間接地探討恢復基因調(diào)控線粒體CMS基因表達的機理；二是直接探討核恢復基因的分子本質(zhì)，嘗試克隆恢復基因，以解釋其恢復育性的功能。
國內(nèi)外對恢復基因的研究有報道稱恢復基因調(diào)控線粒體CMS基因的表達。細胞質(zhì)雄性不育可以自然發(fā)生，但更常見的是由于雜交使不親和的核質(zhì)共處一體，造成不育。針對特定的不育系，通常存在一至幾個恢復育性的核基因(Schnable PS，Wise RP，1999，Trends PlantScience，3175-180)。一般來說，恢復基因是與不育基因不連鎖的顯性基因，已證明一些恢復基因可通過改變線粒體不育相關(guān)基因的表達而減弱、消除其毒害效應，以恢復花粉育性。已有的研究實例表明，恢復基因可能影響線粒體不育基因的轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性(Young E，HansonM，1987，Cell，5041-49；Moneger F et al，1994，EMBO Journal，138-17)、轉(zhuǎn)錄后加工(Tang HV et al，1996，The Plant Journal，10123-133；Dill CL et al，1997，Genetics，1471367-1379；Landgren M et al，1996，Plant Molecular Biology，32879-890)、RNA編輯(Leon P et al，1998，Annual Review Plant Physiology Plant Molecular Biology，49453-480)、翻譯后加工(Abad AD et al，1995，Plant Cell，7271-285)，甚至影響線粒體基因的組成形式(He S et al，1995，Genetics，139955-962)。
克隆恢復基因是一項重要且頗具挑戰(zhàn)性的工作，這一方面是由于沒有同源序列和蛋白序列的資料，而常用的一些基因克隆策略難以運用；另一方面是因為其基因表型需要通過與胞質(zhì)不育因子相互作用才能顯現(xiàn)出來，這使突變體的分析更加復雜化，因此克隆恢復基因必須在技術(shù)手段上進行大膽嘗試。
到目前為止，已克隆的植物恢復基因有玉米(Zea mays L.)的Rf2基因(Cui et al，1996，Science，2721334-1336)、矮牽牛(Petunia hybrida L.)的Rf基因(Bentolila et al，2002，)、蘿卜(Raphanus sativus L.)的Rfo和Rfk基因(Koizuka et al，2003，The Plant Journal，34407-415)以及水稻(Oryza sativa L.)的Rf-1基因(Komori et al，2004，The Plant Journal，37315-325)等。
但是還未見到克隆出棉花育性恢復基因的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一個來自棉花恢復系中含有26S rRNA序列的新基因GH18Rorf392。該基因的全長為2039bp(如序列表SEQ ID NO1所示)，其含有一個1176bp的開放閱讀框(ORF)結(jié)構(gòu)(如序列表SEQ ID NO2所示)。該基因是通過抑制差減雜交的方法獲得來自棉花恢復系的EST序列之后，以該EST序列設(shè)計引物再做5’和3’RACE，從而獲得其全長cDNA序列。目前在國內(nèi)外尚未見到有類似報道。
本發(fā)明中的全長DNA序列整合到質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌中保藏，該菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心獲得保藏編號CGMCCNo.2068，分類命名是Escherichia coli。
本發(fā)明的另一個目的是提供一個新的來自棉花恢復系中含有26S rRNA序列的新基因GH18Rorf392所表達的蛋白質(zhì)(如序列表SEQ ID NO2所示)。它具有392個氨基酸(如序列表SEQ ID NO2所示)。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明。
附圖表說明

圖1為運用抑制差減雜交的方法中第二次PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2為根據(jù)SSH序列設(shè)計引物進行RT-PCR驗證的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為根據(jù)SSH序列設(shè)計引物進行快速擴增cDNA末端(RACE)的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為用Pst I和Not I雙酶切鑒定連接克隆子的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖5為拼接完整的GH18Rorf392全長基因序列中用設(shè)計的引物進行第一次PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖6為拼接完整的GH18Rorf392全長基因序列中用設(shè)計的引物進行第二次PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式
實施例1運用抑制差減雜交的方法獲得來自棉花恢復系的基因片斷1用于抑制差減雜交的棉花材料的培育與取材棉花品種為中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所郭三堆課題組培育的Y18R×P30A雜交F1代自交F2代材料。F1代自交材料播種后根據(jù)雄蕊形態(tài)學判斷其育性，然后分別摘取可育和不育材料現(xiàn)蕾3～5天的幼蕾。用解剖刀切去苞葉，液氮速凍幼蕾，-70℃保存。
2 RNA的制備采用改良的熱硼酸法提取陸地棉品種Y18R×P30A雜交F1代自交F2代材料現(xiàn)蕾3～5天幼蕾的總RNA，用于抑制差減雜交、RT-PCR、5’與3’RACE。
3用抑制差減雜交(SSH)獲取來自棉花恢復系基因的EST序列SSH按照ClontechPCR-SelectTMcDNA Subtractive Kit說明書進行操作。用T/A克隆法構(gòu)建差減cDNA文庫將PCR擴增后的正向差減cDNA片段(圖1)回收，與pGM-T載體連接，16℃過夜，將連接體系轉(zhuǎn)化受體菌DH5a，于X-gal/IPTG Amp瓊脂平板上挑取白色克隆，點種于盛有液體LB培養(yǎng)基的96孔板中，培養(yǎng)過夜，加15％甘油，置于液氮中速凍，-70℃保存菌種。得到了含173個獨立克隆的差減cDNA文庫。然后采用自動測序法對差減cDNA文庫進行測序。測序結(jié)果為主要是兩種序列，這兩種序列基本平均分配，個別為空載體序列。對這兩個序列進行分析發(fā)現(xiàn)，其為反向互補序列。該片段大小為340bp。
4用RT-PCR驗證所得到差減序列的特異性根據(jù)所得差減序列設(shè)計一對引物，分別以Y18R、P30A、F2可育與不育材料3～5天幼蕾的RNA為模板，進行RT-PCR驗證(圖2)。結(jié)果表明，Y18R和F2可育材料中擴增出300bp的特異片斷，而P30A與F2不育材料中則沒有該片斷。從而驗證了所得到差減序列的特異性。
實施例2來自棉花恢復系基因GH18Rorf392全長cDNA序列的獲得1來自棉花恢復系GH18Rorf392基因5’端cDNA的獲得在用SSH片斷與GeneRacerTMRNA Oligo序列組成引物對進行棉花育性恢復相關(guān)基因5’RACE時，從棉花F2代可育幼蕾總RNA中擴增到1500bp的特異條帶(圖3)。用刀片切下含該條帶的膠片，將膠片轉(zhuǎn)移至S.N.A.P.TM柱中，離心過柱獲得該片斷。將該片斷與pCR4-TOPO載體溫和地混勻，在室溫溫育連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α-T1感受態(tài)細胞，50μg/mL卡那篩選。將獲得的轉(zhuǎn)化子用Pst I和Not I雙酶切鑒定，確為插入1500bp條帶(圖4)。測序后獲得GH18Rorf392基因5’端cDNA序列，利用GenBank的blast軟件進行核苷酸序列查詢，發(fā)現(xiàn)該5’端cDNA序列為新序列。將含有該序列的載體命名為pCR4-TOPO-GH18Rorf392 5’。
2來自棉花恢復系GH18Rorf392基因3’端cDNA的獲得以及其中26S核糖體RNA部分序列的發(fā)現(xiàn)在用SSH片斷與Oligo(dT18)組成引物對進行來自棉花恢復系GH18Rorf392基因3’RACE時，從棉花F2代可育幼蕾總RNA中擴增到800bp的特異條帶(圖3)。用刀片切下含該條帶的膠片，將膠片轉(zhuǎn)移至S.N.A.P.TM柱中，離心過柱獲得該片斷。將該片斷與pCR4-TOPO載體溫和地混勻，在室溫溫育連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α-T1感受態(tài)細胞，50μg/mL卡那篩選。將獲得的轉(zhuǎn)化子用Pst I和Not I雙酶切鑒定，確為插入800bp條帶(圖4)。測序后獲得棉花育性恢復相關(guān)基因3’端cDNA序列，利用GenBank的blast軟件進行核苷酸序列查詢，發(fā)現(xiàn)該3’端cDNA序列的主體部分是26S核糖體RNA的部分序列，并且具有98％以上的同源性。將含有該序列的載體命名為pCR4-TOPO-GH18Rorf392 3’。
3來自棉花恢復系GH18Rorf392基因5’端和3’端全長cDNA的獲得及其開放閱讀框(ORF)的確定由于所得GH18Rorf392基因5’端cDNA與其3’端cDNA之間有交叉重復的序列，因此將GH18Rorf392基因5’端cDNA與其3’端cDNA的序列相互拼接之后，獲得GH18Rorf392基因5’端和3’端的全長cDNA序列。然后確定GH18Rorf392基因的ORF，編碼392個氨基酸。利用GenBank的blastp軟件進行蛋白序列查詢，發(fā)現(xiàn)這個蛋白序列為新序列，但是這個蛋白序列的后部具有個氨基酸的相同序列，它們與具有同源性。
實施例3通過設(shè)計引物進行PCR、回收擴增片斷、再擴增、電泳回收、連接和轉(zhuǎn)化以獲得完整的全長基因序列1設(shè)計引物進行PCR在實施例2中通過5’端和3’端的RACE分別獲得了含有GH18Rorf392基因5’端和3’端cDNA序列的載體，為了獲得含有GH18Rorf392基因完整全長cDNA序列的載體，因此設(shè)計一對引物5’端正向和5’端反向拼接，其中5’端反向拼接引物的前一半序列為pCR4-TOPO-GH18Rorf392 5’插入片斷中末端所特有的序列，5’端反向拼接引物的后一半序列為pCR4-TOPO-GH18Rorf392 3’插入片斷中前端所特有的序列。同時設(shè)計另一對引物3’端正向拼接和3’端反向，其中3’端正向拼接引物的前一半序列為pCR4-TOPO-GH18Rorf392 5’插入片斷中末端所特有的序列，3’端正向拼接引物的后一半序列為pCR4-TOPO-GH18Rorf392 3’插入片斷中前端所特有的序列。以pCR4-TOPO-GH18Rorf392 5’為模板，以5’端正向和5’端反向拼接為一對引物進行PCR；以pCR4-TOPO-GH18Rorf392 3’為模板，以3’端正向拼接和3’端反向為一對引物進行PCR；分別擴增到1200bp和800bp的片斷(圖5)。
2回收擴增片斷、再擴增切下第一次擴增到的含有1200bp和800bp片斷的膠片，分別過柱回收，將這兩個回收的第一次擴增產(chǎn)物片斷等量混合后作為模板，以5’端正向和3’端反向為一對引物做第二次PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到最終連接到一起的完整基因序列(2039bp，圖6)。
3回收完整基因片斷、連接并轉(zhuǎn)化用刀片切下含2039bp條帶的膠片，將膠片轉(zhuǎn)移至S.N.A.P.TM柱中，離心過柱獲得該片斷。將該片斷與pCR4-TOPO載體溫和地混勻，在室溫溫育連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α-T1感受態(tài)細胞，50μg/mL卡那篩選。將獲得的轉(zhuǎn)化子用Pst I和Not I雙酶切鑒定，確為插入2000bp條帶(圖4)。
PCR引物表

來自棉花恢復系中含有26S rRNA序列的基因_ST25SEQUENCE LISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所<120>來自棉花恢復系中含有26S rRNA序列的基因<130>來自棉花恢復系中含有26S rRNA序列的基因<160>2<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>2039<212>DNA<213>Gossypium hirsutum Y18R<220>
<221>CDS<222>(745)..(1920)<400>1ggaaagggtt cctaaggggg agactagggg gaaatatgat gtgtcaaact attttcgtgc 60ttgaaactat ttgatgctta ctattcttga aatccataca tgtcctaagc ctcactacgt120tacaagtcga aaagctctat atgatctaag tagactattc acagttcgaa atcatactga180ataaacgtat ttacgactat ttgtattcta ctagattatc aaattaattg tataatttac240tgatagattc ttacacttga gacccttaat acttgtatgt tttgtaatat actgaactta300ggtgtctagt atcaaaagtg gtaagttagt tatatctcat gccaagatta tatatgagta360tgaaatgcct attcgtgtgc tccaaagcta acacttgtac tatacttgtt caatgagtgt420cttttcgttt attgtttcta tttgtgttgc ttgaggacaa gcaatgactt aagtgtgggg480gagtttgatc tgtcataatt tagtgtagca aattaaacta gttttcatac tttagaagct540taagcatgag cattttagtt aagttttaat tacatttttg taagtattag ttaagttaat600aaagtgtgta attcgagtcc tttattgacc ttaggggctg aatgaggcct aaggttgagc660taatatactt tatgagtgtg caggagacca ttagaaggca tattaactcg ataatggttg720ctagattgca acacggagca tggg atg tca caa cat agg aag aag aat cag 771Met Ser Gln His Arg Lys Lys Asn Gln1 5
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權(quán)利要求
1一個基因全長cDNA序列，它具有如序列表SEQ ID NO1所示的第1位至第2039位的核苷酸序列，其核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的第1位至第2039位的核苷酸序列具有至少80％以上的同源性，并同時具有相同功能的類似物。
2如1中DNA序列的開放閱讀框所編碼的一種蛋白質(zhì)，它具有序列表SEQ ID NO2所示的第1位至第392位的氨基酸序列，其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的第1位至第392位的氨基酸序列具有至少85％以上的同源性。
3如1中DNA序列具有的棉花育性相關(guān)功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個來自棉花恢復系中含有26S核糖體RNA(rRNA)序列的新基因。該基因是通過抑制差減雜交的方法獲得來自棉花恢復系的EST序列之后，以該EST序列設(shè)計引物再做5’和3’RACE，從而獲得其全長cDNA序列。該基因的3’端含有26S rRNA序列，5’端是一個全新的序列。由于該基因來源于陸地棉(Gossypium hirsutum)恢復系Y18R，并且編碼392個氨基酸的蛋白質(zhì)，因此將其命名為GH18Rorf392。該基因可用于棉花育性相關(guān)功能的研究。
文檔編號C07K14/415GK101092626SQ20071011047
公開日2007年12月26日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日
發(fā)明者郭三堆, 吳巧雯, 宋洋, 張銳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所, 郭三堆