專利名稱：用全息視頻顯微術(shù)的自動實時粒子表征和三維速度計量的制作方法
用全息視頻顯微術(shù)的自動實時粒子表征和三維速度計量本工作通過許可證No.DMR-0606415 受National Science Foundation 的支持。美國政府依據(jù)該National Science inundation許可證享有一定權(quán)益。交叉參考相關(guān)專利申請本申請要求于2009年1月16日遞交的美國臨時申請No. 61/145，402、2008年 6月19日遞交的美國臨時申請No.61/073，959、2007年10月30日遞交的美國臨時申請 No. 61/001, 023 和 2008 年 10 月 30 日遞交的 PCT 申請 No. PCT/US2008/081794 的優(yōu)先權(quán)。 這些申請的內(nèi)容本文全文引用，供參考。
背景技術(shù)：
膠體粒子，尤其是球的這種表征，在工業(yè)化學(xué)、物理和生物醫(yī)藥應(yīng)用的許多方面中，是重要和盛行的事情。重要功能性的多樣化正在被尋找以實行各種表征，包含1)基于小球的分子結(jié)合化驗，2)流場測量，3)全息圖中自動的粒子圖像檢測，和4)粒子特性的實時分析。例如，相干照明習(xí)慣上還沒有被廣泛用于粒子圖像速度計量，因為產(chǎn)生的全息圖像難以定量地解讀。因此，熒光產(chǎn)量的測量已經(jīng)被用于實行用單色全息成像的基于小球的分子結(jié)合化驗。然而，這樣的方法要求以常規(guī)化驗的熒光標記，該常規(guī)化驗要求數(shù)萬小球以消除非特殊熒光芽孢(fluorospore)結(jié)合和非故意漂白的膺像。近來已經(jīng)證實，即便在粒子沿光軸相互吸附時，膠體粒子的全息視頻顯微術(shù)圖像能夠被用于按三維定位粒子的中心。更早把唯象模型用于觀察散射圖樣證實，獲得的跟蹤分辨率可與用常規(guī)粒子成像方法獲得的相當。在這些研究中，與常規(guī)成像方法相比，相干照明的主要優(yōu)點是極大地擴展工作距離和焦深。然而，這些方法是低效的，不允許進行任何實時分析且甚至不能夠?qū)嵭写罅勘碚?如上面列舉的四點)。因此，上述表征迄今尚無可能，還沒有商品化的可行性或問題依然沒有明顯解決。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供多種表征方法和系統(tǒng)，使用全息視頻顯微術(shù)，按自動、 實時方式分析諸如球體的膠體粒子。


圖IA示出聯(lián)機全息視頻顯微鏡的例子；圖IB是被放大的圖IA圍繞樣本部分；干涉圖樣被示出在圖IC(I)中，而圖1C(2)示出使圖IC(I)擬合到Lorenz-Mie理論的推算， 以獲得各種不同的測量；圖2示出在、的相對誤差和處理速度，用于按照本發(fā)明進行的擬合到用一維查閱表(正方形)和單準確度GPU加速擬合(圓)測量的2.2 μ m直徑石英球體的全息圖像；插入的圖像示出典型的201X201像素全息圖，而誤差是相對于單線程CPU(中央處理單元) 上獲得的加倍準確度結(jié)果計算的，該CPU的處理速度用虛線表示，而光滑曲線是對眼睛的指導(dǎo)。
圖3A和:3B分別是三個膠體球體的原來的和變換的全息圖像；圖3A中重疊的線段表示由三個代表像素投出的“選票”，而圖:3B中的強度是按選票數(shù)量的比例畫的，黑代表0 而白代表800選票，重疊的表面圖示出中間球體的變換(標尺條表示ΙΟμπι)；圖4示出水中1.5μπι直徑石英球體的全息圖估算的均方根誤差，作為半徑Aap、 折射率Δηρ、和軸向位置的函數(shù)，圖中曲線表示被八％參數(shù)化的最小誤差路徑；圖5Α示出全息粒子圖像速度計量，是通過500個膠體球體的維度流軌測量的，這些球體沿壓力驅(qū)動流在微流體通道向下流動，每一球體代表在全息快照(snapshot)的一個場中粒子位置，而來自場序列的特性被鏈接成有灰度級的流軌，該灰度級表明粒子被測量速度的范圍；圖5B示出沿豎直方向的Poi seui 11 e流分布圖，是從圖5A數(shù)據(jù)以不在陰影區(qū)的粒子與通道的上和下玻璃壁交互作用得到的(虛線曲線是與預(yù)期的拋物線流動分布圖的擬合)；圖6A(1)用于水中商品化聚苯乙烯球形粒子連續(xù)樣本的作為折射率和觀察的大小的函數(shù)的流動粒子的分布；圖6A(2)是圖6A(1)用于粒子大小的2D橫截面，而圖6A(3) 用于折射率，兩個圖都是按其他參數(shù)的平均值；圖6B(1)和圖6BQ)示出作為平均速度函數(shù)的流軌平均半徑和折射率；圖7(A)示出以亮圓表示的結(jié)合生物素化聚苯乙烯(biotinylated polystyrene) 球體的抗生物素蛋白的檢測，以暗圓表示的原始球體中被測量粒子半徑的概率分布具有用脫醣抗生物素蛋白培育后的球體樣本的對應(yīng)分布(虛線曲線是對眼睛的指導(dǎo))；圖7(B)是與箭頭指示的概率再分布等價的粒子折射率分布，該箭頭從原始樣本中低密度的尾部指向有涂層樣本中的峰；和圖8示出用于實施本發(fā)明的方法的計算機系統(tǒng)的示意方塊圖。
具體實施例方式為實施本發(fā)明而構(gòu)造的全息顯微鏡100在圖IA中被示意示出。樣本110以準直并線偏振的光束120照明，該光束來自工作在真空波長λ = 632. 8nm(Uniphase 5mff)的 He-Ne激光器。其他激光器波長，諸如λ = 537nm也能夠被采用(5W的Coherent Verdi)。 被樣本110散射的光130與照明光束120的未被散射部分干涉，以在顯微鏡100的焦平面或成像平面125中形成聯(lián)機全息圖。得到的外差散射圖樣(見圖IC(I))被顯微鏡的物鏡 145 (Zeiss S Plan Apo 100X油浸，數(shù)值孔徑1.4)放大，并被以IX視頻目鏡投影到視頻攝像機135(或?qū)σ恍嵤├嵌嗯_攝像機)(NEC TI-324AII)，該攝像機以101 μ m/像素的系統(tǒng)放大率每33ms記錄Ims的曝光。如在下文所描述，這種散射的或干涉的圖樣，被擬合到Lorenz-Mie理論的推算(見圖ICO))。該視頻信號或者作為30幀/s的未壓縮數(shù)字視頻流被記錄在商品化數(shù)字視頻記錄器(Pioneer H520S)上，供離線分析，或者用Arvoo Picasso PCI-25Q幀捕獲器直接數(shù)字化，以得到8比特圖像A(r)。用以前記錄的背景圖像B (r)規(guī)格化每一圖像，消除因反射和光序列中不完善產(chǎn)生的寄生干涉條紋，并提供用于分析的實值陣列a(r) =a(r)/B(r)0在我們的實施方案中，在640/480陣列中每一像素粗略地包含5比特信息。我們用普遍化的Lorenz-Mie散射理論的結(jié)果解讀a (r)中的數(shù)據(jù)。顯微鏡焦平面中的電場，是入射平面波五0(0 =和由于圍繞中心 的球體產(chǎn)生的散射圖樣Es(r) =u0(rp)fs(k(r-rp))的疊加。這里k = 2 π ηω/λ是光在折射率 介質(zhì)中的
波數(shù)。在規(guī)格化之后，
權(quán)利要求
1.一種用全息顯微術(shù)表征樣本的參數(shù)的方法，包括的步驟有從存儲介質(zhì)提供樣本的圖像數(shù)據(jù)；把Lorenz-Mie分析應(yīng)用于來自樣本的圖像數(shù)據(jù)，以表征樣本的性質(zhì)并產(chǎn)生樣本的參數(shù)的信息特征；和同時地實時確定樣本粒子的大小、位置和折射率。
2.按權(quán)利要求1定義的方法，其中提供圖像數(shù)據(jù)的步驟，包含產(chǎn)生偏振光束并使該光束散射離開樣本，以產(chǎn)生全息圖。
3.按權(quán)利要求1定義的方法，其中該Lorenz-Mie分析包含使用圖形處理單元，通過以圖像數(shù)據(jù)的并行處理執(zhí)行Lorenz-Mie分析。
4.按權(quán)利要求3定義的方法，還包含步驟變換圖像數(shù)據(jù)，以確定圖像數(shù)據(jù)中物體數(shù)量的第一估算和在平面中物體大致的χ、y位置；使用被變換的數(shù)據(jù)，確定每一物體軸向位置 (ζ)的第一估算以及每一物體的大小和成分的第一估算；其中Lorenz-Mie分析確定樣本的位置、大小和折射率的第二估算，其中以用結(jié)果更新存儲介質(zhì)和輸出該結(jié)果供顯示與用戶操作中的至少一個步驟，該第二估算具有比第一估算更高的精度。
5.按權(quán)利要求1定義的方法，其中該樣本包括至少一個粒子。
6.按權(quán)利要求1定義的方法，其中參數(shù)表征包含確定基于小球的分子結(jié)合特性的步馬聚ο
7.按權(quán)利要求1定義的方法，其中參該數(shù)表征包含自動粒子檢測。
8.按權(quán)利要求1定義的方法，其中該Lorenz-Mie分析包含確定沿線段R= /r~rp/的 Lorenz-Mie功能性散射函數(shù)&(10·)和內(nèi)插，以獲得函數(shù)fs (k (r_rp))，從而降低處理時間和提供樣本的實時分析。
9.按權(quán)利要求8定義的方法，其中該樣本包括粒子，而該Lorenz-Mie分析方法實時確定該粒子的大小、形狀、成分和取向中的至少之一。
10.按權(quán)利要求9定義的方法，其中該粒子包括球，從而能實現(xiàn)粒子半徑的快速變化特性的實時確定。
11.按權(quán)利要求1定義的方法，其中該偏振光束包括該光的單一波長。
12.按權(quán)利要求1定義的方法，其中該光束包括多個相干光波長。
13.按權(quán)利要求1定義的方法，還包含實行Lorenz-Mie分析和在處于未處置狀態(tài)的粒子與已經(jīng)經(jīng)歷處置的另一個粒子的圖像數(shù)據(jù)之間比較的步驟，從而使存在于被處置粒子與未處置粒子上的分子層能夠?qū)崟r表征。
14.按權(quán)利要求13定義的方法，其中該實時表征從折射率和粒子半徑的組選出。
15.按權(quán)利要求12定義的方法，其中有關(guān)聯(lián)的多個全息圖由樣本和多個相干光波長之間的交互作用形成，從而能夠確定樣本對相干光的不同波長的不同響應(yīng)，并分析該不同響應(yīng)以識別樣本的參數(shù)。
16.一種用于物體的全息顯微術(shù)的表征參數(shù)的方法，包括的步驟有從存儲介質(zhì)接收圖像數(shù)據(jù)；變換該圖像數(shù)據(jù)以確定圖像數(shù)據(jù)中物體數(shù)量的第一估算和在平面中物體大致的χ、y 位置；使用被變換的數(shù)據(jù)，確定每一物體的軸向位置(ζ)的第一估算以及每一物體的大小和成分的第一估算；和對每一物體應(yīng)用圖像數(shù)據(jù)的Lorenz-Mie分析，以確定每一物體的分辨率位置、大小和成分的第二估算，其中以用結(jié)果更新存儲介質(zhì)和提供該結(jié)果供顯示與供用戶解讀中的至少一個步驟，該第二估算具有比第一估算更高的精度。
17.一種用全息顯微術(shù)表征樣本的參數(shù)的系統(tǒng)，包括全息顯微鏡，包含激光器光束源和物鏡，該激光器光束從樣本散射并與激光器光束未散射部分交互作用，以提供全息散射圖樣；圖像收集裝置，用于從全息顯微鏡收集散射圖樣的圖像數(shù)據(jù)特征；和計算機系統(tǒng)，包含計算機和計算機軟件，該計算機軟件被計算機執(zhí)行以分析圖像數(shù)據(jù)， 該計算機軟件包含Lorenz-Mie方法學(xué)，而該軟件被圖形處理單元執(zhí)行，以提供樣本的參數(shù)特征的基本上實時的輸出。
18.按權(quán)利要求17定義的系統(tǒng)，其中該參數(shù)同時地包含該樣本的樣本粒子大小、樣本粒子位置、樣本粒子折射率和樣本粒子的基于小球的分子結(jié)合特性中的至少兩個。
全文摘要
一種聯(lián)機全息顯微鏡，能夠被用于在逐幀基礎(chǔ)上分析視頻流，以跟蹤個別膠體粒子的三維運動。該系統(tǒng)和方法能夠提供實時納米分辨率，并同時測量粒子大小和折射率。通過應(yīng)用Lorenz-Mie分析與選定硬件及軟件的組合，該分析能夠以近乎實時完成。有效的粒子識別方法以足夠精度使初始位置估算自動化，使全息跟蹤和表征能夠?qū)崿F(xiàn)無人看管。
文檔編號G06T1/00GK102365543SQ201080009712
公開日2012年2月29日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者D·G·戈里爾, F·C·張, 肖可 申請人:紐約大學(xué)