專利名稱：測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白，特別是一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，以下簡稱為FRET)測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法。
背景技術(shù)：
FRET是一種無輻射的能量轉(zhuǎn)移過程，是處于激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)(供體)通過長程的偶極子—偶極子的相互作用把能量轉(zhuǎn)移給另一個分子(受體)，導(dǎo)致供體熒光的淬滅和受體發(fā)光的增強(qiáng)的過程。參見G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements usingfluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713。為了便于FRET的發(fā)生，實驗中需要合理的控制供體與受體的濃度之比，然而在活細(xì)胞內(nèi)測量供體與受體的濃度之比是比較困難的事情，目前青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，簡稱為CFP蛋白)和黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，簡稱為YFP蛋白)是最常用的FRET供體-受體對，測量活細(xì)胞內(nèi)CFP與YFP濃度之比是迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下一種測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，更確切地說是利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白(cyan fluorescentprotein，簡稱為CFP)和黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，簡稱為YFP)濃度之比的方法。
推導(dǎo)三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)CFP與YFP濃度比的公式表觀熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率Eapp可以表述如下式參見M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gatedca2+channels revealed by FRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985Eapp＝E×Db＝[1-SCFP(DA)before/SCFP(DA)after](1)這里，E指FRET效率，Db指發(fā)生FRET的CFP分子數(shù)與總的CFP分子數(shù)的比例，SCFP(DA)before和SCFP(DA)after指YFP熒光蛋白被漂白前后，CFP熒光蛋白的平均熒光強(qiáng)度。
同時，表觀的FRET效率Eapp又可以表述如下參見T.Zal，N.R.Gascoigne，Photobleaching-Corrected FRET Efficiency Imaging of Live Cells.Biophys.J.86(2004)3923-3939，Eapp=FCFC+G×CFP---(2)]]>這里，CFP指CFP通道的平均熒光強(qiáng)度，F(xiàn)C為凈FRET值，其表達(dá)式如下參見G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713，F(xiàn)C＝FRET-a×YFP-b×CFP(3)這里，F(xiàn)RET指FRET通道的平均熒光強(qiáng)度，YFP指YFP通道的平均熒光強(qiáng)度，CFP指CFP通道的平均熒光強(qiáng)度。a和b分別為YFP和CFP熒光漏到FRET通道內(nèi)的比例系數(shù)，表述如下參見G.W.Gordon，G.Berry，X.H.Liang，B.Levine，B.Herman，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescencemicroscopy.Biophys.J.74(1998)2702-2713，a＝IFRET(Y)/IYFP(Y)(4)b＝IFRET(C)/ICFP(Y)(5)這里IFRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IYFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IFRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，ICFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。
有效的FRET效率EEFF可以表述如下參見M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca2+channelsrevealed by FRET in single living cells.Neuron 31(2001)973-985，EEFF=E×Ab=(FR-1)×ϵYFP(440)ϵCFP(440)---(6)]]>FR=FRET-b×CFPa×YFP---(7)]]>這里，E指FRET效率，Ab指發(fā)生FRET的受體與總的受體的比例，εYFP(440)/εCFP(440)指在440nm波長光激發(fā)時YFP與CFP的吸收系數(shù)之比，其值為0.09參見M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T Yue，Preassociation of calmodulinwith voltage-gated ca2+channels revealed by FRET in single living cells.Neuron31(2001)973-985。將式(6)與式(1)相除可以得到，EEFFEapp=E×AbE×Db=[DA]/[A][DA]/[D]=[D][A]---(8)]]>
這里，[DA]，[A]和[D]分別表示供體-受體復(fù)合體、受體和供體的濃度。同時，將式(6)和式(2)相除又可以得到，EEFFEapp=(FR-1)×ϵYFP(440)ϵCFP(440)FCFC+G×CFP---(9)]]>把式(7)的FR帶入式(9)，可以得到EEFFEapp=(FC+G×CFP)a×YFP×ϵYFP(440)ϵCFP(440)---(10)]]>由于式(8)和式(10)相等，我們就可以得到CFP與YFP濃度之比，[D][A]=(FC+G×CFP)a×YFP×ϵYFP(440)ϵCFP(440)---(11)]]>這里，G的值為5.40，εYFP(440)/εCFP(440)指在440nm激發(fā)時YFP與CFP的吸收系數(shù)之比，這個值為0.09參見M.G.Erickson，B.A.Alseikhan，B.Z.Peterson，D.T.Yue，Preassociation of calmodulin with voltage-gated ca2+channels revealed by FRET insingle living cells.Neuron 31(2001)973-985，a為YFP熒光漏到FRET通道內(nèi)的比例系數(shù)，見等式(4)，F(xiàn)C為凈FRET值，見等式(3)，CFP和YFP分別表示CFP和YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。
本發(fā)明技術(shù)解決方案如下一種測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，特征在于該方法是利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，青色熒光蛋白以下簡稱為CFP蛋白，黃色熒光蛋白以下簡稱為YFP蛋白，包括下列步驟①測量三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡(以下簡稱為三通道顯微鏡)漏過系數(shù)在中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞，簡稱為CHO細(xì)胞，內(nèi)分別表達(dá)CFP蛋白和YFP蛋白，分別測量表達(dá)YFP蛋白的CHO細(xì)胞在熒光共振能量轉(zhuǎn)移通道，簡稱為FRET通道和YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，利用下列公式計算漏過系數(shù)a，a＝IFRET(Y)/IYFP(Y)分別測量表達(dá)CFP蛋白的CHO細(xì)胞在FRET通道和CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)下式計算漏過系數(shù)b，b＝IFRET(C)/ICFP(Y)式中IFRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IYFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IFRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，ICFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度；
②利用三通道顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)CFP蛋白與YFP蛋白濃度之比在CHO細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)CFP和YFP，共表達(dá)CFP和YFP的CHO細(xì)胞用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡分別記錄CFP通道、YFP通道和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)下式，計算三CHO細(xì)胞內(nèi)的CFP蛋白和YFP蛋白濃度之比[D][A]=(FC+G×CFP)a×YFP×ϵYFP(440)ϵCFP(440)]]>式中FC為凈FRET值，F(xiàn)C＝FRET-a×YFP-b×CFPG稱為G參數(shù)，εYFP(440)/εCFP(440)指在440nm波長的光激發(fā)時，YFP蛋白與CFP蛋白的吸收系數(shù)之比，其值為0.094，CFP和YFP分別表示CFP通道和YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。
所述的G參數(shù)的測量方法的步驟如下(詳見發(fā)明名稱測量三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡G參數(shù)的方法，申請?zhí)?00710039414.5，申請日期2007年4月12日。)①測量三通道顯微鏡漏過系數(shù)在中國倉鼠卵巢癌(CHO)細(xì)胞內(nèi)分別表達(dá)CFP和YFP蛋白，利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡分別測量表達(dá)YFP熒光蛋白的CHO細(xì)胞在FRET通道和YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，分別測量表達(dá)CFP熒光蛋白的CHO細(xì)胞在FRET通道和CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，利用下列公式計算計算漏過系數(shù)a，ba＝IFRET(Y)/IYFP(Y)b＝IFRET(C)/ICFP(C)式中IFRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IYFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IFRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，ICFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。
②用三通道顯微鏡測量CFP-YFP融合蛋白在CFP，YFP和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡G參數(shù)在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CFP-YFP融合蛋白，表達(dá)CFP-YFP融合蛋白的CHO細(xì)胞用三通道FRET顯微鏡分別記錄CFP，YFP和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度為CFP，YFP和FRET；③計算三通道顯微鏡的G參數(shù)計算FC＝FRET-(a×YFP)-(b×CFP)FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)G＝[1-(FR-1)×0.094]×FC/[(FR-1)×0.094×CFP]。
所述的G參數(shù)的值為5.40。
本發(fā)明的技術(shù)效果利用三通道顯微鏡在活細(xì)胞內(nèi)測量了CFP與YFP濃度之比，我們的測量結(jié)果校正了CFP和YFP熒光的串?dāng)_，校正了由于FRET的發(fā)生而引起的CFP熒光的減少和YFP熒光的增加，我們測量的結(jié)果穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)誤差比較小。
具體實施例方式下面用一個實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例如下1.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞用含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)在含5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中。實驗采用了瞬時轉(zhuǎn)染的方法，CHO細(xì)胞生長到80-90％的匯合度的時候進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個12孔板中的單孔加CFP和YFP質(zhì)粒各0.5μg，LipofectAMINE2000(GIBCO)1μl，具體實驗方法參考LipofectAMINE 2000使用說明書。
2.三通道顯微鏡成像是利用配備了40倍物鏡和Cascade512F(Roper)CCD的Olympus IX71倒置顯微鏡實現(xiàn)的。此顯微鏡配備了三個成像通道，分別是CFP通道(激發(fā)，440/21nm；發(fā)射，480/30nm)，YFP通道(激發(fā)，500/25nm；發(fā)射，545/35nm)和FRET通道(激發(fā)，440/21；發(fā)射，535/26nm)。激發(fā)光是采用75W的氙燈。成像是利用1×1bining模式和100-200ms的曝光時間。成像控制和數(shù)據(jù)分析是采用5.0.1版本的Image-proplus軟件(Media Cybernetics)。
3.測量三通道顯微鏡漏過系數(shù)CHO細(xì)胞接種到放置在12孔板內(nèi)8×8mm2大小的玻璃蓋玻片，瞬時轉(zhuǎn)染CFP或YFP質(zhì)粒。24小時之后，接種有細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移到玻璃底的小平皿之中，用HEPES作緩沖液的HBSS(PH7.4)清洗2次，加HBSS浸沒細(xì)胞。表達(dá)CFP熒光蛋白的CHO細(xì)胞用三通道顯微鏡分別記錄CFP和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。表達(dá)YFP熒光蛋白的CHO細(xì)胞用三通道顯微鏡分別記錄YFP和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。根據(jù)等式(4)和(5)就可以得到漏過系數(shù)a和b。
4.利用三通道顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)CFP與YFP的濃度之比CHO細(xì)胞接種到放置在12孔板內(nèi)8×8mm2大小的玻璃蓋玻片，瞬時共轉(zhuǎn)染CFP和YFP質(zhì)粒。24小時之后，接種有細(xì)胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移到玻璃底的小平皿之中，用HEPES作緩沖液的HBSS(PH7.4)清洗2次，加HBSS浸沒細(xì)胞。在CHO細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)CFP和YFP，共表達(dá)CFP和YFP的CHO細(xì)胞用三通道FRET顯微鏡分別記錄CFP，YFP和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)等式(11)，計算三CHO細(xì)胞內(nèi)的CFP和YFP濃度之比。利用三通道顯微鏡我們測量了CHO細(xì)胞內(nèi)CFP與YFP濃度之比，這個比值為1.69±0.20(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，樣品數(shù)量＝34)。
本發(fā)明方法的測量結(jié)果表明校正了CFP和YFP熒光的串?dāng)_，校正了由于FRET的發(fā)生而引起的CFP熒光的減少和YFP熒光的增加，測量的結(jié)果穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)誤差比較小。
權(quán)利要求
1.一種測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，特征在于該方法是利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，青色熒光蛋白以下簡稱為CFP蛋白，黃色熒光蛋白以下簡稱為YFP蛋白，包括下列步驟①測量三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡漏過系數(shù)在中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞，簡稱為CHO細(xì)胞，內(nèi)分別表達(dá)CFP蛋白和YFP蛋白，分別測量表達(dá)YFP蛋白的CHO細(xì)胞在熒光共振能量轉(zhuǎn)移通道，簡稱為FRET通道和YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，利用下列公式計算漏過系數(shù)a，a＝IFRET(Y)/IYFP(Y)分別測量表達(dá)CFP蛋白的CHO細(xì)胞在FRET通道和CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)下式計算漏過系數(shù)b，b＝IFRET(C)/ICFP(Y)式中IFRET(Y)表示YFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IYFP(Y)表示YFP蛋白在YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，IFRET(C)表示CFP蛋白在FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，ICFP(C)表示CFP蛋白在CFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度；②利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)CFP蛋白與YFP蛋白濃度之比在CHO細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)CFP和YFP，共表達(dá)CFP和YFP的CHO細(xì)胞用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡分別記錄CFP通道、YFP通道和FRET通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)下式，計算三CHO細(xì)胞內(nèi)的CFP蛋白和YFP蛋白濃度之比[D][A]=(FC+G×CFP)a×YFP×ϵYFP(440)ϵCFP(440)]]>式中FC為凈FRET值，F(xiàn)C＝FRET-a×YFP-b×CFPG稱為G參數(shù)，εYFP(440)/εCFP(440)指在440nm波長的光激發(fā)時，YFP蛋白與CFP蛋白的吸收系數(shù)之比，其值為0.094，CFP和YFP分別表示CFP通道和YFP通道內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，F(xiàn)RET為FRET通道的平均熒光強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，其特征在于所述的G參數(shù)的值由下列公式計算G＝[1-(FR-1)×0.094]×FC/[(FR-1)×0.094×CFP]式中FR＝[FRET-(b×CFP)]/(a×YFP)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，其特征在于所述的G參數(shù)的值為5.40。
全文摘要
一種測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，該方法是利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白濃度比的方法，包括下列步驟①測量三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡漏過系數(shù)；②利用三通道熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡測量活細(xì)胞內(nèi)CFP蛋白與YFP蛋白濃度之比。本發(fā)明方法的測量結(jié)果表明校正了CFP和YFP熒光的串?dāng)_，校正了由于FRET的發(fā)生而引起的CFP熒光的減少和YFP熒光的增加，測量的結(jié)果穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)誤差比較小。
文檔編號G06F19/00GK101055251SQ20071004050
公開日2007年10月17日 申請日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
發(fā)明者付國, 王桂英, 徐至展 申請人:中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所