一種檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及檢測試紙技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙。
【背景技術(shù)】
[0002]有機(jī)磷農(nóng)藥是一類殺蟲效力強、對植物藥害較小的人工合成有機(jī)磷酸脂類化合物，是目前我國廣泛使用的一類農(nóng)藥品種。其中甲拌磷主要用于小麥、玉米、棉花、甘蔗、大豆等作物拌種或土壤施藥，用來防治地下害蟲和農(nóng)作物苗期害蟲。內(nèi)吸磷有強大的觸殺和內(nèi)吸殺蟲作用，對防治蚜蟲、紅蜘蛛、線蟲等有良好效果。
[0003]長期以來由于農(nóng)民缺乏科學(xué)用藥知識，經(jīng)常出現(xiàn)亂用和濫用問題，大量甲拌磷和內(nèi)吸磷隨植物種子和噴灑過程進(jìn)入土壤，污染了農(nóng)田土壤和表面水體，導(dǎo)致了環(huán)境的污染和生態(tài)的破壞。農(nóng)藥殘留隨著土壤、水源進(jìn)一步又進(jìn)入下一輪種植的農(nóng)作物中，使得農(nóng)產(chǎn)品達(dá)不到無公害農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量要求，威脅著消費者的食品消費安全，對農(nóng)產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯也造成負(fù)面影響。
[0004]以上兩種有機(jī)磷農(nóng)藥都屬于劇毒高效殺蟲劑，導(dǎo)致中毒死亡的案例屢有發(fā)生，因此被我國列為禁用農(nóng)藥，但是仍有一些人在違規(guī)使用，對此初步篩查工作顯得尤為重要。
[0005]目前甲拌磷和內(nèi)吸磷殘留檢測常采用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法，由于這些方法需要較昂貴的儀器并且樣品前處理過程復(fù)雜，因而難以滿足實際檢測的需要。免疫分析方法具有快速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可進(jìn)行現(xiàn)場測定，近年已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測。但是甲拌磷和內(nèi)吸磷分子量小，本身不具有免疫原性，制備抗體的過程繁瑣，且抗體的質(zhì)量受抗原影響很大。制備過程有批內(nèi)和批間差異，產(chǎn)生的抗體針對結(jié)構(gòu)相似的抗原交叉反應(yīng)率高，還有可能有針對大分子偶聯(lián)物的假陽性結(jié)果。以上缺點也制約了針對農(nóng)藥檢測免疫分析的發(fā)展。研究一種快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測技術(shù)非常重要而迫切。
[0006]核酸適體是一種比抗體具有更高特異性的配基，其優(yōu)點在于體外篩選、體外制備，因此能夠有效克服抗體制備周期長、生產(chǎn)成本高、技術(shù)難度大、批間差異大、克隆株不易有效保存的缺點，并且開發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、使用方便在檢測分析領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，核酸適體在甲拌磷和內(nèi)吸磷的快速檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了使得甲拌磷和內(nèi)吸磷雙殘留的檢測能夠快速的定量分析，本實用新型提供了一種能同時檢測甲拌磷和內(nèi)吸磷殘留操作簡便快速的新型試紙。與其他檢測試紙相比該試紙條制備成本更低、生產(chǎn)周期更短且基本無批間差異。
[0008]本實用新型的技術(shù)方案為:一種檢測甲拌磷和內(nèi)吸磷雙殘留的新型試紙，包括:底板、吸水墊、層析膜、適體金標(biāo)結(jié)合墊、樣品吸液層；所述的底板是長條形的平板，底板在最下層，底板上從一端開始順序粘貼樣品吸液層、適體金標(biāo)結(jié)合墊、層析膜，在另一端粘貼吸水墊。
[0009]所述的適體金標(biāo)結(jié)合墊上固定的是親和素標(biāo)記的膠體金微粒上的甲拌磷適體和親和素標(biāo)記的膠體金微粒上的內(nèi)吸磷適體。
[0010]所述的層析膜和吸水墊之間設(shè)有檢測線和質(zhì)控線。
[0011]所述的檢測線為兩條，一條為甲拌磷檢測線，另一條為內(nèi)吸磷檢測線，所述的甲拌磷檢測線含有甲拌磷適體互補序列信標(biāo)分子(信標(biāo)分子兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)-FAM和淬滅基團(tuán)-TAMRA)，所述的內(nèi)吸磷檢測線含有內(nèi)吸磷適體互補序列信標(biāo)分子(信標(biāo)分子兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)_Cy5和淬滅基團(tuán)-BHQ)。
[0012]所述的質(zhì)控線是生物素。
[0013]本實用新型的具有以下有益效果:
[0014]1、本實用新型依據(jù)分子信標(biāo)檢測原理，信標(biāo)分子發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近，熒光猝滅，靶序列存在時，分子信標(biāo)與完全互補序列形成更加穩(wěn)定的雙鏈雜交體，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離增大，熒光恢復(fù)。層析試紙檢測時，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，使得特異性適體和互補分子信標(biāo)結(jié)合，當(dāng)有農(nóng)藥存在時，農(nóng)藥和信標(biāo)分子競爭適體序列，隨著農(nóng)藥濃度的不同，產(chǎn)生的熒光信號不同，從而計算出農(nóng)藥濃度。該方法比普通免疫層析法更為精確。
[0015]2、操作簡便快速。使用快速檢測試紙只需將試紙插入樣品液中，5分鐘左右顯示結(jié)果Ο
[0016]3、顯示結(jié)果更加準(zhǔn)確，以熒光條帶為檢測結(jié)果。進(jìn)一步研究可發(fā)現(xiàn)配用專門的熒光檢測儀樣品中甲拌磷/內(nèi)吸磷的含量與檢測線的熒光值呈反相關(guān)，樣品中甲拌磷/內(nèi)吸磷含量越高，檢測線的熒光值越低。兩條檢測線熒光集團(tuán)不同，不會出現(xiàn)干擾。
[0017]4、成本低。篩選過程簡便，無需經(jīng)過農(nóng)藥分子改造，后期制備只需要化學(xué)合成，制作周期和成本都遠(yuǎn)低于抗體。
[0018]5、易于大范圍推廣應(yīng)用?？焖贆z測試紙操作簡單，能較好的滿足不同層次人員的需要，該實用新型具有廣闊的市場前景和較好的社會、經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說明】
[0019]圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖2為本實用新型的檢測結(jié)果示意圖。
[0021]其中:1底板、2吸水墊、3層析膜、4適體金標(biāo)結(jié)合墊、5樣品吸液層、6-1甲拌磷檢測線、6-2內(nèi)吸磷檢測線、7質(zhì)控線。
【具體實施方式】
[0022]下面的實施例是對本實用新型的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0023]圖1示出了本實用新型的的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024]一種檢測甲拌磷和內(nèi)吸磷雙殘留的新型試紙，包括:底板1、吸水墊2、層析膜3、適體金標(biāo)結(jié)合墊4、樣品吸液層5 ;所述的底板1是長條形的平板，底板1在最下層，底板1上從一端開始順序粘貼樣品吸液層5、適體金標(biāo)結(jié)合墊4、層析膜3，在另一端粘貼吸水墊2。
[0025]所述的層析膜3和吸水墊2之間設(shè)有檢測線和質(zhì)控線7。
[0026]所述的檢測線為兩條，一條為甲拌磷檢測線6-1，另一條為內(nèi)吸磷檢測線6-2，所述的甲拌磷檢測線6-1含有甲拌磷適體互補序列信標(biāo)分子，所述的內(nèi)吸磷檢測線6-2含有內(nèi)吸磷適體互補序列信標(biāo)分子。
[0027]具體地，適體金標(biāo)結(jié)合墊4上含有親和素標(biāo)記的膠體金微粒上的甲拌磷適體和親和素標(biāo)記的膠體金微粒上的內(nèi)吸磷適體，在層析膜3上有互補序列構(gòu)成的隱形檢測線6-1和 6-2。
[0028]其中，把試紙的樣品吸液層端插入果汁、蔬菜浸出液中，由于毛細(xì)作用進(jìn)行側(cè)向?qū)游觯?-10min觀察結(jié)果。
[0029]其中，分別將甲拌磷和內(nèi)吸磷適體固定在適體金標(biāo)結(jié)合墊4上，用其互補序列信標(biāo)分子作為檢測線，用生物素基團(tuán)作為質(zhì)控線7,當(dāng)樣品中超量存在甲拌磷時，適體不能與互補序列結(jié)合，則在甲拌磷檢測線6-1處不顯示熒光條帶，當(dāng)樣品中超量存在內(nèi)吸磷時，適體不能與互補序列結(jié)合，則在內(nèi)吸磷檢測線處6-2處不顯示熒光條帶，隨著農(nóng)藥濃度的降低，熒光量逐漸升高。而不存在甲拌磷和內(nèi)吸磷時兩條檢測線都顯示強烈熒光條帶，達(dá)到檢測的目的。適體分子上修飾有親和素，因此無論樣品中是否含有農(nóng)藥成分，親和素和生物素結(jié)合時，質(zhì)控線顯紅色，否則試紙無效。
[0030]要制成檢測甲拌磷和內(nèi)吸磷殘留的適體熒光金標(biāo)試紙首先需要篩選甲拌磷和內(nèi)吸磷的適體，合成檢測線上的互補序列，制備熒光微球用于結(jié)合適體；整個制備過程中不需要對甲拌磷和內(nèi)吸磷農(nóng)藥進(jìn)行改造和修飾，相比于免疫層析技術(shù)極大地簡化了制備過程。以下是相關(guān)材料的制備方法:
[0031]1、運用SELEX技術(shù)篩選針對甲拌磷適體和針對內(nèi)吸磷適體
[0032]本實用新型中用熒光素(FAM)將隨機(jī)寡聚核苷酸庫進(jìn)行標(biāo)記，每輪篩選的PCR擴(kuò)增用FAM標(biāo)記的上游引物進(jìn)行，通過比較篩選時投入樣品和洗脫樣品的熒光強度來判斷篩選效率。
[0033]SELEX具體過程如下:
[0034](1)雜交:將隨機(jī)庫以及封閉序列溶入200 μ L緩沖液中，變性后于4°C條件下孵育過夜；
[0035](2)固定:取200 μ L親和素修飾的瓊脂糖凝膠用PBS洗滌5次，再將過夜孵育的溶液加入，于室溫條件下在旋轉(zhuǎn)混合器上作用；
[0036](3)洗滌:用緩沖液快速洗滌上述凝膠5次；
[0037](4)洗脫:加入甲拌磷或內(nèi)吸磷溶液，于室溫條件下在旋轉(zhuǎn)混合器上競爭洗脫，每輪減少作用時間，增加篩選壓力，離心后收集下清濾液；
[0038](5 ) PCR擴(kuò)增及雙鏈DNA拆分；
[0039](6)重復(fù)篩選過程，當(dāng)篩選效率不再上升時停止篩選，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后備用。
[0040](7)將測序成功的序列進(jìn)行合成，修飾親和素基團(tuán)，以供下一步試紙條組裝使用。
[0041]2、適體金標(biāo)結(jié)合墊4的制備
[0042](1)以檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，獲得直徑15nm的膠體金；
[0043](2)用膠體金標(biāo)記修飾有親和素的甲拌磷適體和內(nèi)吸磷適體，并將其噴涂在玻璃纖維素膜上。
[0044]3、檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷殘留的試紙實施檢測原理
[0045](1)把試紙的樣品吸液層端插入果汁、蔬菜浸出液中，由于毛細(xì)作用進(jìn)行側(cè)向?qū)游觯?-10min觀察；
[0046](2)檢測甲拌磷濃度lmg/kg以上，層析膜上出現(xiàn)一條質(zhì)控線的紅色條帶為強陽性；0.05-lmg/kg時，焚光強度隨著農(nóng)藥濃度降低而升高，0.05mg/kg以下出現(xiàn)6 (1)焚光條帶和質(zhì)控紅線為陰性。檢測內(nèi)吸磷濃度lmg/kg以上，層析膜上出現(xiàn)一條質(zhì)控線的紅色條帶為強陽性；0.03-lmg/kg時，焚光強度隨著農(nóng)藥濃度降低而升高，0.03mg/kg以下出現(xiàn)6 (2)熒光條帶和質(zhì)控紅線為陰性。當(dāng)兩種農(nóng)藥濃度都低于〇.〇5mg/kg出現(xiàn)兩條強熒光帶和一條質(zhì)控紅線。甲拌磷和內(nèi)吸磷各自的分子信標(biāo)標(biāo)記了不同的熒光基團(tuán)，檢測時不存在干擾現(xiàn)象。
[0047]對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，隨著技術(shù)的發(fā)展，本實用新型構(gòu)思可以不同方式實現(xiàn)。本實用新型的實施方式并不僅限于以上描述的實施例，而且可在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行變化。
【主權(quán)項】
1.一種檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙，其特征在于:所述的試紙由底板、吸水墊、層析膜、適體金標(biāo)結(jié)合墊、樣品吸液層組成；所述的底板是長條形的平板，底板在最下層，底板上從一端開始順序粘貼樣品吸液層、適體金標(biāo)結(jié)合墊、層析膜，在另一端粘貼吸水墊。2.如權(quán)利要求1所述的檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙，其特征在于:所述的層析膜和吸水墊之間設(shè)有檢測線和質(zhì)控線。3.如權(quán)利要求2所述的檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙，其特征在于:所述的檢測線為兩條，一條為甲拌磷檢測線，另一條為內(nèi)吸磷檢測線，所述的甲拌磷檢測線含有甲拌磷適體互補序列信標(biāo)分子，所述的內(nèi)吸磷檢測線含有內(nèi)吸磷適體互補序列信標(biāo)分子。4.如權(quán)利要求2所述的檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙，其特征在于:所述的質(zhì)控線是生物素質(zhì)控線。
【專利摘要】本實用新型公開了一種檢測甲拌磷、內(nèi)吸磷雙殘留的試紙，所述的試紙是由底板、吸水墊、層析膜、適體金標(biāo)結(jié)合墊、樣品吸液層組成；底板是長條形的支撐物，樣品吸液層、適體金標(biāo)結(jié)合墊、層析膜、吸水墊依次順序粘貼在底板上；所述吸水墊與所述層析膜之間的反應(yīng)區(qū)設(shè)有具有各自適體互補序列信標(biāo)分子的檢測線、由生物素形成的質(zhì)控線，檢測線共兩條。該檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的適體熒光金標(biāo)試紙靈敏度高、操作簡便快速、成本低、易于大范圍推廣應(yīng)用。
【IPC分類】G01N33/558
【公開號】CN205003162
【申請?zhí)枴緾N201520681868
【發(fā)明人】王耘
【申請人】金陵科技學(xué)院
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年9月6日