檢測設(shè)備的制造方法
【專利說明】
[0001] 本申請基于并要求2012年4月3日提交的編號為61/619, 784的美國臨時申請的 權(quán)益，所述文獻(xiàn)在此引入作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本申請的實(shí)施例總體上涉及例如在核酸測序過程中用于樣品的流體操作和光學(xué) 檢測的設(shè)備和方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 我們的基因組為預(yù)測我們的許多固有傾向性（如我們的偏好、才能、對疾病的易 感性和對治療藥物的反應(yīng)性）提供了藍(lán)圖。人類個體的基因組包含超過30億個核苷酸的 序列。只是那些核苷酸的一小部分的差異賦予許多我們獨(dú)特的特性。研究團(tuán)體在查明構(gòu)成 藍(lán)圖的特征以及利用所述特征更完整地理解在每個藍(lán)圖中信息如何與人類健康相關(guān)方面 正取得令人印象深刻的進(jìn)步。然而，我們的理解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不完整，并且這正在阻礙信息從研究 實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化，希望有一天我們每一個人將擁有我們自己的個人基因組的備份，使 得我們能夠和我們的醫(yī)生一同坐下來針對健康的生活方式或適當(dāng)?shù)闹委熯^程確定合適的 選擇。
[0004] 目前的瓶頸是產(chǎn)量和規(guī)模的問題。查明任何給定個體的藍(lán)圖的基本組成部分是確 定其基因組中的30億個核苷酸的精確序列?？梢允褂酶鞣N技術(shù)來做到這一點(diǎn)，但是那些技 術(shù)通?；ㄙM(fèi)許多天以及成千上萬美元來完成。此外，任何個體的基因組序列的臨床相關(guān)性 是將其基因組序列的獨(dú)特特征（即，他們的基因型）和與已知特性（即，表型）相關(guān)的參考 基因組進(jìn)行比較的問題。當(dāng)人們考慮到參考基因組是基于基因型和表型的相關(guān)性而創(chuàng)建 時，規(guī)模和產(chǎn)量的問題就變得明顯，所述相關(guān)性由通常使用數(shù)以千計(jì)的個體以便在統(tǒng)計(jì)上 有效的研究學(xué)習(xí)得出。因此，針對成千上萬的個體可以對幾十億的核苷酸進(jìn)行最終測序， 以識別任何臨床相關(guān)的基因型和表型的相關(guān)性。進(jìn)一步被疾病、藥物反應(yīng)以及其他臨床相 關(guān)特性的數(shù)目成倍擴(kuò)展，對非常便宜和快速的測序技術(shù)的需要變得更加明顯。
[0005] 需要減少測序成本來驅(qū)使科研人員進(jìn)行大規(guī)模的基因相關(guān)性研究，并且使得在用 于做出改變個體患者的生活的決定的治療的臨床環(huán)境中可進(jìn)行測序。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006] 本文所述的本申請的實(shí)施例滿足上述需要并且還提供其他的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本申請?zhí)峁┮环N檢測設(shè)備，其包括：（a)包括多個顯微熒光計(jì)的支架（carriage)， 其中顯微熒光計(jì)中的每一個具有被配置用于寬視場影像檢測的物鏡，其中多個顯微熒光計(jì) 被定位成同時獲取在公共平面內(nèi)的多個寬視場影像，并且其中寬視場影像中的每一個來自 公共平面的不同區(qū)域；(b)平移平臺，其被配置成在平行于公共平面的至少一個方向上移 動支架；以及（c)樣品平臺，其被配置成保持基板在公共平面內(nèi)。
[0008] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個還可包括專用自動聚焦模塊。
[0009] 所述自動聚焦模塊可包括檢測器和驅(qū)動器，其中所述驅(qū)動器可被配置成改變所述 顯微熒光計(jì)相對于所述公共平面的焦點(diǎn)，并且其中所述檢測器可被配置成引導(dǎo)所述驅(qū)動器 的運(yùn)動。
[0010] 所述檢測器還可被配置成獲取所述寬視場影像。
[0011] 所述檢測器還可被配置成向位于所述支架外部的處理單元輸出影像數(shù)據(jù)。
[0012] 所述檢測器可專用于所述自動聚焦模塊并且其中所述顯微熒光計(jì)可包括第二檢 測器，該第二檢測器可被配置成向位于所述支架外部的處理單元輸出影像數(shù)據(jù)。
[0013] 用于所述設(shè)備的第一顯微熒光計(jì)的所述自動聚焦模塊可被配置成整合來自用于 所述設(shè)備的第二顯微熒光計(jì)的自動聚焦模塊的數(shù)據(jù)，由此所述自動聚焦模炔基于所述第 一顯微熒光計(jì)的焦點(diǎn)位置和所述第二顯微熒光計(jì)的焦點(diǎn)位置改變所述第一顯微熒光計(jì)的 焦點(diǎn)。
[0014] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個還可包括分束器和檢測器，其中所述分束器可被定位 成將來自激勵輻射源的激勵輻射引導(dǎo)至所述物鏡以及將來自所述物鏡的發(fā)射輻射引導(dǎo)至 所述檢測器。
[0015] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個還可包括所述激勵輻射源。
[0016] 所述激勵輻射源可將所述激勵輻射引導(dǎo)至所述多個顯微熒光計(jì)中的單個顯微熒 光計(jì)的物鏡，由此每個顯微熒光計(jì)可包括單獨(dú)的激勵輻射源。
[0017] 所述支架還可包括與所述激勵輻射源熱接觸的散熱器。
[0018] 所述散熱器可與所述支架中的單一輻射源熱接觸。
[0019] 所述散熱器可與所述支架中的多個輻射源熱接觸。
[0020] 所述激勵輻射源可將所述激勵輻射引導(dǎo)至所述多個顯微熒光計(jì)中的兩個或更多 個顯微熒光計(jì)的物鏡，由此兩個或更多個顯微熒光計(jì)可共享激勵輻射源。
[0021] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個還可包括至少兩個激勵輻射源。
[0022] 所述激勵輻射源可包括LED。
[0023] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個的物鏡可具有0. 2和0. 5之間的數(shù)值孔徑。
[0024] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個可被配置成以足以區(qū)分相隔小于50微米的特征的分 辨率進(jìn)行檢測。
[0025] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個的寬視場影像可具有至少Imm2的面積。
[0026] 所述支架可阻止所述顯微熒光計(jì)之間的橫向移動。
[0027] 所述顯微熒光計(jì)可與所述支架共同模制。
[0028] 所述支架可包括至少四個顯微熒光計(jì)，其中所述至少四個顯微熒光計(jì)的物鏡可被 布置成至少兩排。
[0029] 所述至少四個顯微熒光計(jì)的物鏡可以成六邊形堆積排列。
[0030] 所述基板可包括至少四個平行通道，并且其中所述物鏡中的每一個可被定位成 對所述四個平行通道中的唯一的一個通道進(jìn)行成像。
[0031] 所述物鏡中的每一個可被定位成對所述唯一的一個通道的部分進(jìn)行成像。
[0032] 所述支架可包括至少六個顯微熒光計(jì)，其中所述至少六個顯微熒光計(jì)的物鏡可被 布置成至少兩排，并且其中所述至少六個顯微熒光計(jì)的物鏡可成六邊形堆積排列。
[0033] 所述基板可包括至少六個平行通道，并且其中所述物鏡中的每一個可被定位成對 所述六個平行通道中的唯一的一個通道的至少一部分進(jìn)行成像。
[0034] 所述顯微熒光計(jì)中的每一個還可包括激勵輻射源、分束器和檢測器，其中所述分 束器可被定位成將來自所述激勵輻射源的激勵輻射引導(dǎo)至所述物鏡以及將來自所述物鏡 的發(fā)射輻射引導(dǎo)至所述檢測器，其中所述激勵輻射和發(fā)射輻射可在相互正交的方向上被引 導(dǎo)。
[0035] 所述至少四個顯微熒光計(jì)的所述激勵輻射源可被布置在與所述公共平面相對的 所述支架的第一側(cè)上，其中所述檢測器中的至少兩個可被布置在與所述第一側(cè)正交并且與 所述公共平面正交的所述支架的第二側(cè)上，并且其中所述檢測器中的至少兩個可被布置在 與所述第一側(cè)正交并且與所述公共平面正交的所述支架的第三側(cè)上。
[0036] 所述至少四個顯微熒光計(jì)的所述檢測器可被布置在與所述公共平面相對的所述 支架的第一側(cè)上，其中所述激勵輻射源中的至少兩個可被布置在與所述第一側(cè)正交并且與 所述公共平面正交的所述支架的第二側(cè)上，并且其中所述激勵輻射源中的至少兩個可被布 置在與所述第一側(cè)正交并且與所述公共平面正交的所述支架的第三側(cè)上。
[0037] 所述支架可包括至少四個顯微熒光計(jì)，其中所述至少四個顯微熒光計(jì)的物鏡可被 布置成單排。
[0038] 所述基板可包括至少四個平行通道，并且其中所述物鏡中的每一個可被定位成對 所述四個平行通道中的唯一的一個通道進(jìn)行成像。
[0039] 所述物鏡中的每一個可被定位成對所述唯一的一個通道的一部分進(jìn)行成像。
[0040] 本申請還提供一種對基板進(jìn)行成像的方法，包括以下步驟：（a)提供在表面上包 括熒光特征的基板；(b)使用多個顯微熒光計(jì)獲取表面的第一部分的多個寬視場影像，其 中顯微熒光計(jì)中的每一個從表面的不同位置獲取寬視場影像，其中所述多個顯微熒光計(jì)被 固定到支架；以及（C)在平行于表面的方向上平移支架并且針對表面的第二部分重復(fù)（b)。 該方法可以使用本文其他地方所述的設(shè)備中的任何一種，但是無需在所有實(shí)施例中受此限 制。
[0041] 還提供了流體卡盤（fluidics cartridge)，其包括：（a)具有光學(xué)透明表面、入口 和出口的流動池；和（b)由光學(xué)不透明且不可透過含水液體的材料制成的殼體，其中所述 殼體保持：（i)樣品貯存器；（ii)樣品貯存器和流動池的入口之間的流體線路；（iii)經(jīng)由 流動池的入口與流動池流體連通的多個試劑貯存器；（iv)至少一個閥，其被配置成協(xié)調(diào)貯 存器和流動池的入口之間的流體連通；以及（V)至少一個壓力源，其被配置成將液體從樣 品貯存器或試劑貯存器經(jīng)由流動池的入口移動到流動池，其中光學(xué)透明窗口中斷殼體并且 入口端口中斷殼體，其中入口端口與樣品貯存器流體連通，并且其中光學(xué)透明表面被定位 在窗口中。
[0042] 本申請還提供了一種測序方法，其包括以下步驟：（a)提供一種具有以下各項(xiàng)的 流體卡盤：（i)具有光學(xué)透明表面的流動池，（ii)核酸樣品，（iii)用于測序反應(yīng)的多個試 劑，以及（iv)用于將試劑輸送到流動池的流體系統(tǒng)；(b)提供一種具有以下各項(xiàng)的檢測設(shè) 備：（i)多個顯微熒光計(jì)，其中顯微熒光計(jì)中的每一個包括被配置用于在X和y維度上在影 像平面中的寬視場影像檢測的物鏡，以及（ii)樣品平臺；(c)將流體卡盤輸送到樣品平臺， 其中光學(xué)透明表面被置于影像平面中；以及（d)在流體卡盤中執(zhí)行核酸測序過程的流體操 作以及在檢測設(shè)備中執(zhí)行核酸測序過程的檢測操作，其中（i)通過流體系統(tǒng)將試劑輸送到 流動池，以及（ii)通過多個顯微熒光計(jì)檢測核酸特征。
【附圖說明】
[0043] 圖1示出了可用于核酸測序的光電檢測裝置（左）和流體卡盤（右）。
[0044] 圖2示出了用于具有正交激勵和發(fā)射光束路徑的單個顯微熒光計(jì)的光學(xué)布局。
[0045] 圖3示出了用于顯微熒光計(jì)的光學(xué)布局。
[0046] 圖4示出了與具有兩個通道的流動池相關(guān)的四個顯微熒光計(jì)的排列。
[0047] 圖5示出了可以被用在顯微熒光計(jì)中的自動聚焦設(shè)備。
[0048] 圖6A示出了流動池中的四個通道的排列（左）和單排物鏡的線性排列（右）的 頂視圖。
[0049] 圖6B示出了具有八個通道的流動池（左）和四個一排的兩排共八個物鏡的排列 的頂視圖。
[0050] 圖7示出了流動池中六個通道的排列（左）和兩排物鏡的六邊形堆積排列（右） 的頂視圖。
[0051] 圖8示出了檢測設(shè)備的八個顯微熒光計(jì)的排列的透視圖。
[0052] 圖9示出了檢測設(shè)備的八個顯微熒光計(jì)的排列的底部平面圖。
[0053] 圖10示出了具有平行激勵和發(fā)射光束路徑的單個顯微熒光計(jì)的光學(xué)布局。
[0054] 圖11示出了檢測設(shè)備的Y平臺的頂部透視圖。
[0055] 圖12示出了檢測設(shè)備的Y平臺的底部透視圖。
[0056] 圖13示出了支持八個顯微熒光計(jì)的排列的Y平臺的頂部透視圖。
[0057] 圖14示出了檢測設(shè)備的電氣框圖。
[0058] 圖15示出了帶有流動池的流體卡盤的分解圖。
[0059] 圖16示出了流體卡盤的流體學(xué)圖。
[0060] 圖17示出了四個樣品注射旋轉(zhuǎn)閥。
[0061] 圖18示出了使用單向流動和兩個閥的試劑重用系統(tǒng)的流體學(xué)圖。
[0062] 圖19示出了使用往返流動和單個閥的試劑重用系統(tǒng)的流體學(xué)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0063] 本申請?zhí)峁┯糜谄教箙^(qū)域（如在基板表面上存在的那些平坦區(qū)域）的高分辨率檢 測的方法和設(shè)備。一種特別有用的應(yīng)用是存在于表面上的生物樣品的基于光學(xué)的成像。例 如，本文所述的方法和設(shè)備可用于獲取存在于核酸陣列（如用于核酸測序應(yīng)用中的那些核 酸陣列）中的核酸特征的影像?？梢允褂美霉鈱W(xué)可檢測的樣品和/或試劑的多種核酸測 序技術(shù)。這些技術(shù)特別好地適用于本申請的方法和設(shè)備，并因此強(qiáng)調(diào)針對本申請的特定實(shí) 施例的各種優(yōu)點(diǎn)。出于說明的目的以下闡述了這些優(yōu)點(diǎn)中的一些，并且盡管例舉了核酸測 序應(yīng)用，但是這些優(yōu)點(diǎn)也可被擴(kuò)展到其他應(yīng)用。
[0064] 關(guān)于本文所述的實(shí)例中的一些，許多核酸測序技術(shù)的顯著特征是（1)多色檢測的 使用（例如，通常使用四種不同的熒光團(tuán)，一個熒光團(tuán)用于存在于核酸中的不同核苷酸類 型A、C、G和T(或U)中的每一個），⑵來自核酸樣品的大量的不同片段（例如，來自基因 組樣品、RNA樣品或其衍生物的片段）在陣列的表面上的分布以及（3)陣列的流體處理和 成像的重復(fù)循環(huán)。本文所公開的方法和設(shè)備的實(shí)施例特別可用于核酸測序，因?yàn)樗鼈兛梢?提供具有多種顏色和多處重復(fù)的陣列表面的高分辨率成像的能力。例如，本文所述的實(shí)施 例允許在幾百、幾十或者甚至單位數(shù)微米范圍內(nèi)的分辨率下獲取表面的影像。同樣地，可以 分辨具有最近相鄰的平均中心至中心間距低于100微米、50微米、10微米、5微米或更小的 核酸特征。在特定的實(shí)施例中，可以獲取表面的寬視場影像，包括例如覆蓋陣列的Imm2或更 大的面積的影像?？梢酝瑫r或順序地獲取具有多種顏色的影像，例如，以識別唯一與不同的 核苷酸類型相關(guān)聯(lián)的熒光標(biāo)記。此外，可以針對測序技術(shù)的多個循環(huán)順序地獲取影像?？?以從每個循環(huán)可靠地比較來自陣列的給定區(qū)域的影像以確定針對陣列上的每一個核酸特 征檢測到的顏色變化的序列。顏色變化的序列可以依次用于推斷在每個特征中核酸片段的 序列。
[0065] 在特定的實(shí)施例中，本申請的設(shè)備包括一個或多個顯微熒光計(jì)。顯微熒光計(jì)中 的每一個可以包括激勵輻射源、檢測器以及物鏡，以形成讀取頭的集成子單元。在每一 個顯微熒光計(jì)中可以存在其他光學(xué)部件。例如，可以存在分束器以提供緊湊的落射熒光 (印ifluorescent)檢測配置，由此分束器被定位成將來自激勵輻射源的激勵輻射引導(dǎo)至物 鏡以及將來自物鏡的發(fā)射輻射引導(dǎo)至檢測器。
[0066] 使用集成顯微熒光計(jì)設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于：例如在掃描操作中，可以方便地移動顯微 熒光計(jì)，以允許比顯微熒光計(jì)的視場大的基板的成像。在特定的實(shí)施例中，幾個顯微熒光計(jì) 可以結(jié)合以形成讀取頭。下文闡述了用于讀取頭的結(jié)合的各種配置，并且可加以選擇以適 用于待成像的基板的特殊格式，同時對于整個讀取頭保持相對緊湊的尺寸。在本申請的幾 個實(shí)施例中，讀取頭相對較小的尺寸和較輕的質(zhì)量導(dǎo)致相對低的慣性，使得讀取頭在被移 動之后迅速地停止，從而有利于快速掃描核酸陣列或其他基板。在一些情況下，顯微熒光計(jì) 可以被固定到支架，使得它們在分析應(yīng)用（如核酸測序運(yùn)行）的過程中在至少一些維度上 不可獨(dú)立地移動。例如，多個顯微熒光計(jì)可以是永久固定的，使得它們在X和y維度上（其 中X或y中的至少一個是掃描的方向）相對于彼此不可獨(dú)立地移動。然而，可以在z維度上 獨(dú)立地驅(qū)動顯微熒光計(jì)，以提供獨(dú)立的聚焦控制。本申請的設(shè)備的幾個不同顯微熒光計(jì)之 間的自由度的減少提供了免于在設(shè)備的運(yùn)輸、操作和使用過程中造成的對準(zhǔn)損失的保護(hù)。
[0067] 在一些實(shí)施例中，存在于讀取頭或支架中的多個顯微熒光計(jì)中的每一個可具有專 用自動聚焦模塊。因此，每個顯微熒光計(jì)可以獨(dú)立地聚焦。在一些實(shí)施例中，在讀取頭中的 特定自動聚焦模塊，盡管專用于特定的顯微熒光計(jì)的驅(qū)動，但仍然可以從讀取頭中的至少 一個其他自動聚焦模塊接收信息，并且來自特定自動聚焦模塊以及來自至少一個其他自動 聚焦模塊的信息可用于確定適當(dāng)?shù)尿?qū)動以實(shí)現(xiàn)特定顯微熒光計(jì)的期望聚焦。這樣，對于任 何給定的顯微熒光計(jì)的聚焦可以利用存在于相同的讀取頭或支架中的兩個或多于兩個顯 微焚光計(jì)之間的一致來確定。
[0068] 在特定的實(shí)施例中，可以以卡盤格式提供將以本文所述的方法或設(shè)備進(jìn)行檢測的 樣品。例如，卡盤可包括沿著用來處理基板以進(jìn)行檢測的其他流體部件的待檢測的基板。 以核酸測序應(yīng)用為更具體的實(shí)例，卡盤可包括能夠向檢測裝置呈現(xiàn)核酸特征陣列的流動 池，以及可選地用于保持測序試劑的貯存器、用于保持樣品制備試劑的貯存器、用于保持測 序過程中產(chǎn)生的廢物產(chǎn)品的貯存器中的一個或多個，和/或能夠?qū)⒘黧w移動通過流動池的 栗、閥和其他部件。流體卡盤同樣可提供方便和緊湊的格式的優(yōu)點(diǎn)，以便用于核酸測序的樣 品和試劑的存儲和處理。
[0069] 在特定的實(shí)施例中，流體卡盤可被配置成允許一種或多種試劑的重復(fù)使用。例如， 流體卡盤可被配置成將試劑輸送到流動池，然后從流動池移除試劑，并且然后重新將試劑 引入流動池。重復(fù)使用試劑的優(yōu)點(diǎn)是減少浪費(fèi)以及降低利用昂貴的試劑和/或以高濃度 (或以高的量）被輸送的試劑的過程的成本。
[0070] 本申請的流體卡盤可以提供模塊化的優(yōu)點(diǎn)，由此可以在第一模塊（即流體卡盤） 中對不同的樣品進(jìn)行流體處理，所述第一模塊與第二模塊（例如，顯微熒光計(jì)、讀取頭或檢 測設(shè)備）光學(xué)連通。流體卡盤可以包含足夠整個流體處理過程（例如，核酸測序過程）的 一個或多個樣品、試劑和流體器件，并且流體卡盤可以被輸送到檢測設(shè)備。一旦流體和檢測 過程完成，可以將流體卡盤移除，使得檢測設(shè)備準(zhǔn)備進(jìn)行另一個過程。由于流體模塊和檢測 模塊是可分離的，本系統(tǒng)允許評估多個不同的樣品，同時避免樣品之間的交叉污染的危險。 通過避免光學(xué)部件的不必要的維修、凈化或處理，這為其中檢測部件相對昂貴并且技術(shù)上 很難組裝的實(shí)施例提供了優(yōu)點(diǎn)，其中當(dāng)流體部件和光學(xué)部件不是模塊化的時候可能需要所 述的維修、凈化或處理。
[0071] 圖1示出了示例性的光學(xué)掃描裝置1，其利用通過本文所述的幾個實(shí)施例提供的 集成光電子學(xué)和基于卡盤的流體學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。示例性裝置1包括殼體2,該殼體2包含各種固 定部件，例如包括光學(xué)部件、計(jì)算部件、電源、風(fēng)扇等。例如，存在于殼體2的正面上的屏幕 3用作圖形用戶接口，其可以提供各種類型的信息，如工作狀態(tài)、正在進(jìn)行的分析過程（例 如，測序運(yùn)行）的狀態(tài)、到達(dá)或來自裝置1的數(shù)據(jù)傳送的狀態(tài)、用法說明、警告等。卡盤座4 也存在于殼體2的正面上。如圖所示，卡盤座4可被配置成具有保護(hù)門5的狹槽。在該實(shí) 例中，存在在卡盤座的框架上為指示燈形式的狀態(tài)指示器6,并且其可被配置成指示裝置 1中卡盤的存在或不存在。例如，指示燈6可以從開改變?yōu)殛P(guān)或從一種顏色改變?yōu)榱硪环N顏 色以指示卡盤的存在或不存在。在該實(shí)例中，電源控制按鈕7存在于殼體2的正面上，識別 標(biāo)記8 (如生產(chǎn)商或器械的名稱）也存在于殼體2的正面上。
[0072] 圖1中還示出了示例性的流體卡盤10,其可用于向裝置1提供樣品和試劑。流體 卡盤10包括殼體11，該殼體11保護(hù)各種流體部件，如貯存器、流體連接件、栗、閥等。流動 池12被集成到流體卡盤中與殼體內(nèi)的試劑流體連通的