一種簡(jiǎn)便檢測(cè)rna與蛋白互作的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒及其使用方法，包括標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、細(xì)胞裂解液、鏈霉親和磁珠、洗液和蛋白洗脫液。本發(fā)明用RNA去抓與之相互作用的蛋白質(zhì)，首先把已知序列的RNA做好標(biāo)記（例如biotin),依靠這個(gè)標(biāo)記將RNA固定到某Beads上，再和含有蛋白的物質(zhì)共孵育，之后去掉未與RNA作用的上清收集從Beads上洗下來的蛋白，得到的蛋白可做質(zhì)譜或免疫印跡實(shí)驗(yàn)。
【專利說明】
一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物領(lǐng)域，尤其涉及一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]非編碼RNA是眾多細(xì)胞過程的關(guān)鍵調(diào)控子，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常關(guān)鍵，與發(fā)育和癌癥進(jìn)程密切相關(guān)。非編碼RNA主要包括長(zhǎng)非編碼RNA(IncRNA)和microRNAs(miRNA)，它們可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、指導(dǎo)染色質(zhì)的重組和修飾、減少mRNA的翻譯對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行控制。
[0003]RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins)在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著重要的作用，它通過和RNA相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。RNA結(jié)合蛋白參與RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列編輯、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、維持RNA的穩(wěn)定和降解、細(xì)胞內(nèi)定位和翻譯控制等RNA代謝的各個(gè)方面。RNA結(jié)合蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)或功能的不同可分為核糖核蛋白(RNP)、KH基序RNA結(jié)合蛋白、雙螺旋RNA結(jié)合蛋白和冷酸基序RNA結(jié)合蛋白R(shí)NA結(jié)合蛋白質(zhì)包括異源核糖核蛋白、小核糖核蛋白、Poly(A)結(jié)合蛋白、葉綠體RNA結(jié)合蛋白、植物富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白、哺乳動(dòng)物富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白和藍(lán)細(xì)菌RNA結(jié)合蛋白。
[0004]蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。了解它們之間相互作用的分子機(jī)制對(duì)理解這些生物學(xué)過程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性標(biāo)記，或?qū)嶒?yàn)步驟過多，不僅耗時(shí)費(fèi)力，也增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定。另外，穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系也需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間建立。許多研究者不確定實(shí)驗(yàn)的陰性、陽(yáng)性。綜上所述，本領(lǐng)域中沒有特別穩(wěn)定且省時(shí)的方法檢測(cè)RNA與蛋白的相互作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性好、經(jīng)濟(jì)、完整的簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒及其使用方法。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，包括標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、細(xì)胞裂解液、鏈霉親和磁珠、洗液和蛋白洗脫液。本發(fā)明用RNA去抓與之相互作用的蛋白質(zhì)，首先把已知序列的RNA做好標(biāo)記(例如b1tin)，依靠這個(gè)標(biāo)記將RNA固定到某Beads上，再和含有蛋白的物質(zhì)(例如細(xì)胞裂解物)共孵育，之后去掉未與RNA作用的上清收集從Beads上洗下來的蛋白，得到的蛋白可做質(zhì)譜或免疫印跡實(shí)驗(yàn)。
[0007]進(jìn)一步地，所述細(xì)胞裂解液的配方包括如下原料:
0.05?1.5體積% NP-40；
0.15?0.35體積％去氧膽酸鈉；
Tris-HCL 45-55 mmoL/L ；Nacl 140?160 mmoL/L；
EDTA 0.8~1.2 mmoL/L；
PMSF 0.8~1.2mmoL/L；
所述 Tri s-HCL 的 pH 值為 7.2~7.5。
[0008]其中，NP-40是一種去垢劑，可以裂解胞膜，0.25%左右的去氧膽酸鈉可以裂解細(xì)胞膜;去氧膽酸鈉是一種離子型去垢劑，可以裂解胞膜，0.25%左右的去氧膽酸鈉可以裂解細(xì)胞膜，0.5%的去氧膽酸鈉可以裂解核膜;Tris-HCL作為一種緩沖液，可以維持穩(wěn)定的pH值，pH值為7.2-7.5，與細(xì)胞正常PH值(7.4左右)保持一致，保持正常的DNA和蛋白形態(tài);Nacl作為一種電解質(zhì)，協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度;EDTA為乙二胺四乙酸，可以和金屬離子絡(luò)合，作為核酸酶和蛋白酶的抑制劑;PMSF為磷酸酶抑制劑，主要抑制磷酸酶的活性。
[0009]所述洗液的配方包括如下原料:
Tris-HCL 45-55 mmoL/L；
EDTA 0.8-1.2 mM；
KCl 80-120 mM；
0.1-0.2體積% TritonX-100；
0.05-0.15體積%甘油；
4.5?5.5體積% DTT；
所述 Tri s-HCL 的 pH 值為 6.8~7.2。
[0010]其中，KCl作為一種電解質(zhì)，可以協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度;TritonX-100為一種去垢劑，0.1%以上的TritonX-100可以去除大部分脂類物質(zhì)；少量的，S卩1%左右的甘油可以結(jié)合大量分子，穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)，降低蛋白的降解;DTT是一種還原劑，5%左右可以穩(wěn)定蛋白的活性。蛋白的外界環(huán)境一般是中性，PH=7.0左右，所以所述Tris-HCL的pH值調(diào)為6.8?7.2。[0011 ]所述蛋白洗脫液的配方包括如下原料:
220-280 mM Tris-HCl；
8.5~11.5%(ff/V)SDS；
0.2~0.6%(W/V)溴酚藍(lán);
45?55%(V/V)甘油;
4?6%(W/V)0-巰基乙醇；
所述 Tri s-HCL 的 pH 值為 6.6~7.0。
[0012]其中，10%左右的SDS可以使蛋白變性，并使蛋白均勻帶負(fù)電荷;溴酚藍(lán)為指示劑，電泳時(shí)指示蛋白條帶的位置;甘油可增加溶液的粘稠度，上樣后，使液體更容易沉淀;5%左右的巰基乙醇可以使蛋白變性；蛋白帶負(fù)電荷，溶液的PH值應(yīng)保持在偏酸性，所以所述Tri s-HCL 的 pH 值調(diào)為 6.6?7.0。
[0013]所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
51、制備標(biāo)記生物素RNA探針:以含有目的基因的T載體為模板，標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP為底物，通過T7RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA ；
52、制備細(xì)胞蛋白提取液:
521、將3~5X 17個(gè)細(xì)胞收集至1.5ml離心管中；
522、加0.5~11111細(xì)胞裂解液，再加入10~201]/1111RNase inhibitor和0.5?lug/ml的蛋白酶抑制劑，裂解細(xì)胞，取上清作為蛋白提取液；
53、鏈霉親和磁珠與標(biāo)記生物素RNA探針孵育:將步驟SI制備的RNA探針與鏈霉親和磁珠孵育，使RNA探針結(jié)合到鏈霉親和磁珠上，用洗液洗掉未結(jié)合磁珠；
54、標(biāo)記RNA探針的磁珠與蛋白提取液孵育，富集RNA結(jié)合蛋白，得到蛋白:將S3制備的含有RNA探針的磁珠與細(xì)胞裂解液或純蛋白孵育，用洗液洗掉未結(jié)合蛋白，加洗脫液洗脫結(jié)合蛋白O
[0014]步驟SI的具體步驟為:
依次加入線性化DNA片段I?2ug、B1tin RNA labeling mix 2ul、10X buffer 2ul、T7RNA聚合酶2ul，加水補(bǔ)足18ul，在溫度為37°C條件下孵育2?3h，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并標(biāo)記此RNA;再加1.5?2ul DNase I，在溫度為37°C條件下孵育15?20min，然后加2?2.5ul 0.2MEDTA，調(diào)至pH=7.5-8.0； 95°C條件下加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min，去除DNA。
[0015]步驟S3包括如下步驟:先采用500ul?700 ul Wash Buffer沖洗50ul鏈霉親和磁珠3~5次，再將步驟SI標(biāo)記的RNA加入鏈霉親和磁珠，在溫度4°C條件下過夜孵育;然后，在轉(zhuǎn)速為3000~5000rpm條件下離心I?2min，去上清液，最后用Wash buffer I洗3?5次。
[0016]步驟S4包括如下步驟:向S3制備的含有RNA探針的磁珠磁珠中加入I?2mg蛋白提取液，在溫度4°C條件下孵育4h;再在轉(zhuǎn)速為3000?5000rpm條件下離心I?2min，去上清液;然后用Wash buffer I洗3?5次后加30?50ul蛋白洗脫液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下離心，取上清液。
[0017]本步驟中，蛋白提取液最多加入2mg蛋白，蛋白過量后，會(huì)增加磁珠的非特異性結(jié)合，一定要在4 °C條件下孵育，抑制蛋白的降解，轉(zhuǎn)速不要超過5000rpm，超過后，未結(jié)合蛋白會(huì)沉淀下來，造成假陽(yáng)性。
[0018]所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒用于免疫印跡檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的RNA為Ul的正義鏈，檢測(cè)蛋白為snRNP70，陰性對(duì)照的RNA為Ul的反義鏈，檢測(cè)蛋白為snRNP70。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
(1)脫硫生物素化的目標(biāo)RNA能夠直接富集RBP;
(2)操作簡(jiǎn)單，步驟簡(jiǎn)化，耗時(shí)短；
(3)使用不同長(zhǎng)度的體外轉(zhuǎn)錄RNA或合成RNA進(jìn)行標(biāo)記;可成功富集內(nèi)源、過表達(dá)和體外翻譯的裂解液中的蛋白；(4)特異性好，磁珠背景低，反義鏈的RNA與正義鏈富集的RNA有明顯區(qū)別；
(5)本發(fā)明比單獨(dú)購(gòu)買合成的末端標(biāo)記RNA、磁珠和試劑更為經(jīng)濟(jì)，可工業(yè)化生產(chǎn)；(6)完整:包含標(biāo)記和富集組分，陽(yáng)性對(duì)照RNA、陰性對(duì)照RNA;
(7)最終得到的蛋白用途廣泛，可用于質(zhì)譜、銀染、Western。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明原理圖；
圖2為本發(fā)明的銀染圖；SHAPE MERGEFORMAT 圖3為本發(fā)明的免疫印跡檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
[0022]實(shí)施例1
一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，包括標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、細(xì)胞裂解液、鏈霉親和磁珠、洗液和蛋白洗脫液。
[0023]其中，所述細(xì)胞裂解液的配方包括如下原料:
1% NP-40；
0.25%去氧膽酸鈉；
Tris-HCL 50mmoL/L ；
Nacl 150 mmoL/L；
EDTA I mmoL/L；
PMSF I mmoL/L；
所述Tri s-HCL的pH值為7.4。
[0024]所述洗液的配方包括如下原料:
Tris-HCL 50mmoL/L；
EDTA ImM;
KCl lOOMm；
TritonX-100；
0.1%丙三醇；
5%DTT ImM;
所述Tri s-HCL的pH值為7.0。
[0025]所述蛋白洗脫液的配方包括如下原料:
250 mM Tris-HCl；
10%(ff/V)SDS；
0.5%(W/V)溴酚藍(lán);
50%(V/V)甘油;
5%(W/V)0-巰基乙醇；
所述Tri s-HCL的pH值為6.8。
[0026]所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
S1、制備標(biāo)記生物素RNA探針:
依次加入線性化DNA片段lug、B1tin RNA labeling mix 2ul、10X buffer 2ul、T7RNA聚合酶2ul，加水補(bǔ)足18ul，在溫度為37°C條件下孵育2h，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并標(biāo)記此RNA;再加2ul DNase I，37°C孵育 15min，然后加2ul 0.2M EDTA，調(diào)至PH=8.0 ;加StructureBuffer，95 °C 加熱 2min，冰浴 3min，室溫靜置 30min，去除 DNA。
[0027]S2、制備細(xì)胞蛋白提取液:
521、將3X 17個(gè)細(xì)胞收集至1.5ml離心管中
522、加0.5ml細(xì)胞裂解液，再加入10U/ml RNase inhibitor和0.5ug/ml的蛋白酶抑制劑，裂解細(xì)胞，取上清作為蛋白提取液
S3、鏈霉親和磁珠與標(biāo)記生物素RNA探針孵育:先采用500ul Wash Buffer沖洗鏈霉親和磁珠3次，再將步驟SI標(biāo)記的RNA加入鏈霉親和磁珠，在溫度4°C條件下過夜孵育;然后，在轉(zhuǎn)速為3000rpm條件下離心Imin，去上清液，最后用Wash buffer I洗3次；
S4、標(biāo)記RNA探針的磁珠與蛋白孵育，富集RNA結(jié)合蛋白，得到蛋白:向S3制備的含有RNA探針的磁珠磁珠中加入Img蛋白提取液，在溫度4°C條件下孵育4h ；再在轉(zhuǎn)速為3000rpm條件下離心lmin，去上清液；然后用Wash buffer I洗3次后加50ul蛋白洗脫液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下離心，取上清液。
[0028]將上述獲得的蛋白進(jìn)行銀染、免疫印跡檢測(cè)、質(zhì)譜，具體如下:
(I)銀染:將洗脫的蛋白樣品，取3~5ul，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白樣品，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染，蛋白條帶顯現(xiàn)，對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析。
[0029]如圖2為銀染圖；其中，蛋白的分子標(biāo)記為指示蛋白大小；Input;總蛋白為細(xì)胞SW480的全蛋白提取液;正義鏈為細(xì)胞SW480中，Ul的正義鏈結(jié)合的蛋白；反義鏈為Ul正義鏈的反向互補(bǔ)鏈，細(xì)胞SW480中，Ul的反義鏈結(jié)合的蛋白；磁珠為去除背景。差異條帶可進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0030](2)免疫印跡檢測(cè):將洗脫的蛋白樣品，取20?25ul，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白樣品，再將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用特定抗體進(jìn)行免疫印記，使特定蛋白顯現(xiàn)。
[0031]如圖3為免疫印跡檢測(cè)圖，其中，總蛋白為細(xì)胞SW480的全蛋白提取液的5%上樣;正義鏈為細(xì)胞SW480中，U1的正義鏈結(jié)合的蛋白；反義鏈為細(xì)胞SW480中，U1的反義鏈結(jié)合的蛋白，檢測(cè)蛋白為小核核糖核蛋白，條帶大小為70KD。
[0032]其中，Ul的RNA序列見序列表。
[0033]實(shí)施例2
一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，包括標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、細(xì)胞裂解液、鏈霉親和磁珠、洗液和蛋白洗脫液。
[0034]其中，所述細(xì)胞裂解液的配方包括如下原料:
0.05體積％ NP-40 ；
0.15體積％去氧膽酸鈉；
Tris-HCL 45 mmoL/L ；
Nacl 140 mmoL/L；
EDTA 0.8 mmoL/L；
PMSF 0.8mmoL/L；
所述Tri s-HCL的pH值為7.2。
[0035]所述洗液的配方包括如下原料:
Tris-HCL 45 mmoL/L；
EDTA 0.8 mM；
KCl 80 mM；
0.1 體積% TritonX-100；
0.05體積％丙三醇；
4.5體積% DTT；
所述Tri s-HCL的pH值為6.8。
[0036]所述蛋白洗脫液的配方包括如下原料:220 mM Tris-HCl；
8.5%(ff/V)SDS；
0.4%(W/V)溴酚藍(lán);
45%(V/V)甘油;
4%(W/V)0-巰基乙醇；
所述Tri s-HCL的pH值為6.6。
[0037]所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
51、制備標(biāo)記生物素RNA探針:依次加入線性化DNA片段lug、B1tinRNA labeling mix2ul、10X buffer 2ul、T7 RNA聚合酶2ul，加水補(bǔ)足18ul，在溫度為37°C條件下孵育2h，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并標(biāo)記此RNA;再加1.5ul DNase I，37°C條件下孵育15min，然后加2ul 0.2MEDTA，調(diào)至PH=7.5 ；加Structure Buffer，在95 °C條件下加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min，去除 DNA;
52、制備細(xì)胞蛋白提取液:
521、將3X 17個(gè)細(xì)胞收集至1.5ml離心管中；
522、加0.5ml細(xì)胞裂解液，再加入10U/ml RNase inhibitor和0.5ug/ml的蛋白酶抑制劑，裂解細(xì)胞，取上清作為蛋白提取液；
53、鏈霉親和磁珠與標(biāo)記生物素RNA探針孵育::先采用500ulWash Buffer沖洗鏈霉親和磁珠3次，再將步驟SI標(biāo)記的RNA加入鏈霉親和磁珠，在溫度4°C條件下過夜孵育；然后，在轉(zhuǎn)速為3000rpm條件下離心lmin，去上清液，最后用Wash buffer I洗3次；
54、標(biāo)記RNA探針的磁珠與蛋白提取液孵育，富集RNA結(jié)合蛋白，得到蛋白:向S3制備的含有RNA探針的磁珠磁珠中加入Img蛋白提取液，在溫度4°C條件下孵育4h;再在轉(zhuǎn)速為3000rpm條件下離心lmin，去上清液;然后用Wash buffer I洗3次后加30ul蛋白洗脫液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下離心，取上清液。
[0038]實(shí)施例3
一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，包括標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、細(xì)胞裂解液、鏈霉親和磁珠、洗液和蛋白洗脫液。
[0039]其中，所述細(xì)胞裂解液的配方包括如下原料:
1.5體積％ NP-40 ；
0.35體積％去氧膽酸鈉；
Tris-HCL 55 mmoL/L ；
Nacl 160 mmoL/L；
EDTA 1.2 mmoL/L；
PMSF 1.2mmoL/L；
所述Tri s-HCL的pH值為7.5。
[0040]所述洗液的配方包括如下原料:
Tris-HCL 55 mmoL/L；
EDTA 1.2 mM；
KCl 120 mM；
0.2體積% TritonX-100； 0.15體積％丙三醇；
5.5體積% DTT；
所述Tri s-HCL的pH值為7.2。
[0041]所述蛋白洗脫液的配方包括如下原料:
280 mM Tris-HCl；
11.5%(ff/V)SDS；
0.6%(W/V)溴酚藍(lán);
55%(V/V)甘油;
6%(W/V)0-巰基乙醇；
所述Tri s-HCL的pH值為7.0。
[0042]所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，包括如下步驟:
51、制備標(biāo)記生物素RNA探針:依次加入線性化DNA片段2ug、B1tinRNA labeling mix2ul、10X buffer 2ul、T7 RNA聚合酶2ul，加水補(bǔ)足18ul，在溫度為37°C條件下孵育3h，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并標(biāo)記此RNA;再加2ul DNase I，37°C條件下孵育20min，然后加2.5ul 0.2MEDTA，調(diào)至PH=8.0 ；加Structure Buffer，在95 °C條件下加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min，去除 DNA;
52、制備細(xì)胞蛋白提取液:
521、將5X 17個(gè)細(xì)胞收集至1.5ml離心管中；
522、加Iml細(xì)胞裂解液，再加入20U/mlRNase inhibitor和lug/ml的蛋白酶抑制劑，裂解細(xì)胞，取上清作為蛋白提取液；
53、鏈霉親和磁珠與標(biāo)記生物素RNA探針孵育::先采用700ul Wash Buffer沖洗鏈霉親和磁珠5次，再將步驟SI標(biāo)記的RNA加入鏈霉親和磁珠，在溫度4°C條件下過夜孵育；然后，在轉(zhuǎn)速為5000rpm條件下離心2min，去上清液，最后用Wash buffer I洗5次；
54、標(biāo)記RNA探針的磁珠與蛋白提取液孵育，富集RNA結(jié)合蛋白，得到蛋白:向S3制備的含有RNA探針的磁珠磁珠中加入1.5mg蛋白提取液，在溫度4°C條件下孵育4h;再在轉(zhuǎn)速為5000rpm條件下離心2min，去上清液;然后用Wash buffer I洗5次后加50ul蛋白洗脫液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下離心，取上清液。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，其特征在于，包括標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP混合物、T7RNA聚合酶、細(xì)胞裂解液、鏈霉親和磁珠、洗液和蛋白洗脫液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞裂解液的配方包括如下原料: 0.05?1.5體積% NP-40； 0.15?0.35體積％去氧膽酸鈉； Tris-HCL 45-55 mmoL/L ； Nacl 140?160 mmoL/L； EDTA 0.8~1.2 mmoL/L； PMSF 0.8~1.2mmoL/L；所述 Tri s-HCL 的 pH 值為 7.2~7.5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，其特征在于，所述洗液的配方包括如下原料: Tris-HCL 45-55 mmoL/L； EDTA 0.8-1.2 mM； KCl 80-120 mM； 0.1-0.2體積% TritonX-100； 0.05-0.15體積％丙三醇； 4.5?5.5體積% DTT；所述 Tri s-HCL 的 pH 值為 6.8~7.2。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒，其特征在于，所述蛋白洗脫液的配方包括如下原料: 220-280 mM Tris-HCl； 8.5-11.5 體積 ％(W/V)SDS ； 0.4-0.6體積％(胃八0溴酚藍(lán)； 45?55%(V/V)甘油; 4?6%(W/V)0-巰基乙醇；所述 Tri s-HCL 的 pH 值為 6.6~7.0。5.根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、制備標(biāo)記生物素RNA探針:以含有目的基因的T載體為模板，標(biāo)記有生物素的UTP、ATP、CTP、GTP為底物，通過T7RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA ； 52、制備細(xì)胞蛋白提取液: 521、將3~5X 17個(gè)細(xì)胞收集至1.5ml離心管中； 522、加0.5?Iml細(xì)胞裂解液，再加入10?20U/mlRNase inhibitor和0.5?lug/ml的蛋白酶抑制劑，裂解細(xì)胞，取上清作為蛋白提取液； 53、鏈霉親和磁珠與標(biāo)記生物素RNA探針孵育:將步驟SI制備的RNA探針與鏈霉親和磁珠孵育，使RNA探針結(jié)合到鏈霉親和磁珠上，用洗液洗掉未結(jié)合磁珠； 54、標(biāo)記RNA探針的磁珠與蛋白提取液孵育，富集RNA結(jié)合蛋白，得到蛋白:將S3制備的含有RNA探針的磁珠與細(xì)胞裂解液或純蛋白孵育，用洗液洗掉未結(jié)合蛋白，加洗脫液洗脫結(jié)合蛋白O6.根據(jù)權(quán)利要求5所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟SI的具體步驟為: 依次加入線性化DNA片段I?2ug、B1tin RNA labeling mix 2ul、10X buffer 2ul、T7RNA聚合酶2ul，加水補(bǔ)足18ul，在溫度為37°C條件下孵育2?3h，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并標(biāo)記此RNA;再加1.5?2ul DNase I，在溫度為37°C條件下孵育15?20min，然后加2?2.5ul 0.2MEDTA，調(diào)至pH=7.5-8.0； 95°C條件下加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min，去除DNA。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S3包括如下步驟:先采用500ul?700 ul Wash Buffer沖洗鏈霉親和磁珠3~5次，再將步驟SI標(biāo)記的RNA加入鏈霉親和磁珠，在溫度4°C條件下過夜孵育；然后，在轉(zhuǎn)速為3000?5000rpm條件下離心I?2min，去上清液，最后用Wash buffer I洗3?5次。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟S4包括如下步驟:向S3制備的含有RNA探針的磁珠磁珠中加入I?1.5mg蛋白提取液，在溫度4°C條件下孵育4h;再在轉(zhuǎn)速為3000?5000rpm條件下離心I?2min，去上清液;然后用Washbuffer I洗3~5次后加30?50ul蛋白洗脫液，在轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下離心，取上清液。9.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一一項(xiàng)所述簡(jiǎn)便檢測(cè)RNA與蛋白互作的試劑盒用于免疫印跡檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的RNA為Ul的正義鏈，檢測(cè)蛋白為snRNP70，陰性對(duì)照的RNA為Ul的反義鏈，檢測(cè)蛋白為snRNP70。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK106093436SQ201610592411
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月25日 公開號(hào)201610592411.3, CN 106093436 A, CN 106093436A, CN 201610592411, CN-A-106093436, CN106093436 A, CN106093436A, CN201610592411, CN201610592411.3
【發(fā)明人】高飛, 錢智鵬, 喬繼彪, 張映菲, 張余琴
【申請(qǐng)人】高飛