一種鑒別藥材溪黃草的植物來源的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種鑒別藥材溪黃草的植物來源的方法，所述方法基于高效液相色譜法，以迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯為對照品；供試品溶液與混合對照品溶液的色譜圖比較，在235～240nm中任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、冬凌草甲素和胡麻素的吸收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和胡麻素的吸收峰，則供試品是植物溪黃草；在235～240nm中的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和咖啡酸乙酯的吸收峰，則供試品是植物線紋香茶菜或細(xì)花線紋香茶菜。本發(fā)明的方法具有操作簡便、特征性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、耗時短等優(yōu)點。
【專利說明】
一種鑒別藥材溪黃草的植物來源的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生藥學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于高效液相色譜法鑒別藥材 溪黃草的植物來源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥材溪黃草，為民間常用草藥，因喜生山谷溪旁潮濕處，新鮮葉片揉搓有黃色液汁 而得名。其味微苦，性涼，具清熱、袪濕、利膽退黃的功效，用于治療濕熱瀉痢、跌打瘀腫、急 性黃疸型肝炎和急性膽囊炎等疾病。以溪黃草為主要原料生產(chǎn)的消炎利膽片已成為肝膽專 科用藥中銷量第一的中成藥。
[0003] 為保證藥品質(zhì)量，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)建立起了一些藥材溪黃草的定性定量檢測方法。 如公開號CN 103399120 A(【公開日】2013年11月20日）的中國發(fā)明專利申請"一種藥材溪黃草 的薄層鑒別方法"，公開了以石油醚-乙酸乙酯（9:1~8:2)作為展開劑，在硅膠板上以標(biāo)準(zhǔn) 對照藥材為對照，對不同來源的溪黃草樣品進(jìn)行薄層展開、鑒別的方法。
[0004] 但是藥材溪黃草的植物來源非?；靵y。鄧喬華等報道，廣州清平市場上的溪黃草 不下十幾種植物來源(鄧喬華，王德勤等.溪黃草考證及性狀鑒別法的驗證[J].現(xiàn)代中藥研 究與實踐.2014,28(2):15-19)。2010年版《中國藥典》附錄111首次收載溪黃草的基原為唇形 科香茶菜屬植物線紋香茶菜Isodon lophanthoides或溪黃草Isodon sorra(Maxim. )Kudo (sorra疑為serra之誤）。實際上，唇形科香茶菜屬的多種植物，如線紋香茶菜Isodon lophanthoides及其變種：細(xì)花線紋香茶菜（纖花線紋香茶菜）Isodon lophanthoides var.graciliflora和狹基線紋香茶菜Isodon lophanthoides var.gerardianus(Benth.) H. Hara等都作藥材溪黃草使用。
[0005] 雖然植物溪黃草Isodon serra(Maxim. )Kudo與藥材溪黃草同名，藥典也將其列為 藥材的基原之一;但是在藥材性味等方面，植物溪黃草Isodonserra與同屬作溪黃草用的其 它植物都存在很大差異。具體而目：
[0006] ( - )黃汁特征
[0007] 線紋香茶菜和細(xì)花香茶的新鮮及用水浸泡至濕潤的干燥葉片，用手揉搓后有棕黃 色液汁，染黃手指;植物溪黃草的新鮮及用水浸泡至濕潤的干燥葉片，用手揉搓后沒有棕黃 色液汁，不染黃手指。
[0008] (二)性味特征
[0009] 線紋香茶菜和細(xì)花線紋香茶菜，味甘苦，性涼，民間一般稱為"甜溪黃"。植物溪黃 草味極苦，性寒，民間稱為"苦溪黃"。
[0010] 除上述區(qū)別外，鄧喬華等還發(fā)現(xiàn)植物溪黃草的性狀鑒別特征與線紋香茶菜及細(xì)花 線紋香茶菜均顯著不同，與傳統(tǒng)溪黃草經(jīng)驗鑒別特征也不相符；因此認(rèn)為植物溪黃草是否 能夠作為藥材溪黃草使用值得商榷（鄧喬華，王德勤等.溪黃草考證及性狀鑒別法的驗證 [J].現(xiàn)代中藥研究與實踐.2014,28(2): 15-19)。
[0011] 為了將植物溪黃草(苦溪黃)與其它做溪黃草用的同屬植物(甜溪黃)區(qū)別開，現(xiàn)有 技術(shù)中出現(xiàn)了名為"溪黃草藥材HPLC指紋圖譜的建立及其指紋圖譜"的中國發(fā)明專利申請 (公開號103776926A，【公開日】2014年5月7日），該專利文件記載以12批苦溪黃的高效液相色 譜圖為基礎(chǔ)，以咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香 酸為對照品，以迷迭香酸吸收峰為參照峰，建立了苦溪黃的指紋圖譜。該文獻(xiàn)還披露咖啡 酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸均為線紋香茶菜、 狹基線紋香茶菜和纖花線紋香茶菜共有的色譜峰，而植物溪黃草僅有咖啡酸和迷迭香酸 峰;據(jù)此，可以將植物溪黃草(苦溪黃)和其它藥材溪黃草來源植物區(qū)別開來。
[0012]上述鑒別苦溪黃的方法，存在不足之處：
[0013] 1)分析一個樣品的時間過長，需要100~120分鐘。
[0014] 2)對照品的選擇上還需商榷?？Х人釓V泛存在于植物中，其特征性和代表性不突 出。另外，唐海明等采用HPLC法同時測定不同來源溪黃草藥材中8個水溶性成分(咖啡酸、新 西蘭牡荊苷2、新西蘭牡荊苷3、異夏佛塔苷、夏佛塔苷、牡荊苷、芹菜素一6,8-二一C 一a - L 一吡喃阿拉伯糖苷和蘆?。┑暮?，結(jié)果不同商業(yè)渠道購得的6種植物溪黃草，有3個測出 了牡荊苷，占所測樣品的50 % (唐海明，陳建南等.HPLC法同時測定不同來源溪黃草藥材中8 個水溶性成分[J].藥物分析雜志.2015，35(2): 228-234)。因此，將牡荊苷作為線紋香茶菜、 狹基線紋香茶菜和纖花線紋香茶菜區(qū)別于植物溪黃草的特征對照品，是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹?br>[0015] 3)指紋圖譜需借助"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)"進(jìn)行相似度計算，對匹配 度要求高。由于溪黃草藥材成分復(fù)雜，種類繁多，加上分析時間較長，色譜條件的任何細(xì)微 改變，都意味著整體色譜圖形變異，不能與對照指紋圖譜相匹配，造成誤判，給鑒定工作造 成困難，導(dǎo)致實驗的重現(xiàn)性受到影響。
[0016] 因此，有必要建立更嚴(yán)謹(jǐn)、快速簡便的方法，以鑒別和區(qū)分苦溪黃(植物溪黃草)和 甜溪黃(主要是線紋香茶菜、纖花線紋香茶菜）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 針對上述問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種鑒別藥材溪黃草來源于植物溪黃 草，還是來源于植物細(xì)花線紋香茶菜或線紋香茶菜的方法。該方法基于HPLC法，完成一個樣 品檢測僅需要50分鐘。
[0018] 為了實現(xiàn)達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：
[0019] -種鑒別藥材溪黃草的植物來源的方法，所述方法基于高效液相色譜法，以迷迭 香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯為對照品，色譜條件包括：
[0020] 固定相:十八硅烷鍵合硅膠；
[0021] 流動相：以乙腈為A相，體積百分比濃度0.08~0.3 %的磷酸水溶液為B相，按照如 下程序梯度洗脫：
[0022]第0min，A相占流動相的體積百分比為18%，其余為B相，
[0023]第33min，A相占流動相的體積百分比為23%，其余為B相，
[0024]第45min，A相占流動相的體積百分比為30%，其余為B相，
[0025]第50min，A相占流動相的體積百分比為34%，其余為B相，
[0026] 流速:0.6~1.2mL/min;
[0027] 柱溫：23 ~28°C;
[0028] 檢測波長：235~240nm中的任一波長和330nm。
[0029] 優(yōu)選的，所述B相為體積百分比濃度0.1 %的磷酸水溶液。
[0030] 優(yōu)選的，所述流速為0.8ml/min。
[0031]優(yōu)選的，所述柱溫為25。(：。
[0032] 本發(fā)明所述方法，包括混合對照品溶液的制備；具體操作為:精密稱取迷迭香酸、 細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯對照品，加50%乙醇配制成每lmL含 迷迭香酸20~40iig、細(xì)花線紋香茶菜苷A2~lOyg、冬凌草甲素2~16yg、胡麻素10~20iig、咖 啡酸乙酯10~25yg的混合對照品溶液，即得。
[0033] 上述方法還包括供試品溶液的制備;具體操作為:稱取干燥的待測植物樣品粉末， 置于具塞容器中，加入20mL 50 %乙醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱重量，用 50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，0.22M1濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0034] 本發(fā)明所述的方法，還包括測定步驟;具體操作為:精密吸取制備得到的所述混合 對照品溶液和供試品溶液，分別注入高效色譜儀，在上述色譜條件下，記錄235~240nm中的 任一波長和330nm下0~50min的液相色譜圖。
[0035] 上述的方法，還包括鑒別步驟;具體的，供試品溶液與混合對照品溶液的色譜圖比 較，在235~240nm中的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、冬凌草甲素和胡麻素的吸收峰，在 330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和胡麻素的吸收峰，則供試品是植物溪黃草，為"苦溪黃"； 在235~240nm中的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸 收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和咖啡酸乙酯的吸收峰，則供試品是植物線紋香茶 菜或細(xì)花線紋香茶菜，為"甜溪黃"。
[0036]作為一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供一種植物線紋香茶菜、細(xì)花線紋香茶菜和 植物溪黃草的鑒別方法，所述方法基于高效液相色譜法，以迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、 冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯為對照品，包括色譜條件的建立、混合對照品溶液的制 備、供試品溶液的制備、測定和鑒別;具體操作為：
[0037] I.色譜條件的建立 [0038]固定相:十八硅烷鍵合硅膠；
[0039]流動相：以乙腈為A相，體積百分比濃度0.1 %的磷酸水溶液為B相，按照如下程序 梯度洗脫：
[0040] 第0min，A相占流動相的體積百分比為18%，其余為B相，
[0041] 第33min，A相占流動相的體積百分比為23%，其余為B相，
[0042]第45min，A相占流動相的體積百分比為30%，其余為B相，
[0043]第50min，A相占流動相的體積百分比為34%，其余為B相，
[0044] 流速:0.8ml/min;
[0045] 柱溫：25°C;
[0046] 檢測波長：235~240nm中的任一波長和330nm;
[0047] II.混合對照品溶液的制備
[0048]精密稱取迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯對照 品，加50%乙醇配制成每lmL含迷迭香酸20~40yg、細(xì)花線紋香茶菜苷A 2~lOyg、冬凌草甲 素2~16yg、胡麻素10~20yg、咖啡酸乙酯10~25yg的混合對照品溶液，即得；
[0049] III.供試品溶液的制備
[0050] 稱取干燥的待測植物樣品粉末，置于具塞容器中，加入20mL50 %乙醇，密塞，稱定 重量，超聲提取30min，放冷，再稱重量，用50 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，0.22wii濾膜濾過，取續(xù) 濾液，即得；
[0051] IV ?測定
[0052] 精密吸取步驟II制備得到的所述混合對照品溶液和步驟III制備得到的所述供試 品溶液l〇yl，分別注入高效色譜儀，在所述色譜條件下，記錄235~240nm中的任一波長和 330nm下0~50min的液相色譜圖；
[0053] V ?鑒別
[0054] 將步驟IV得到的供試品溶液色譜圖與混合對照品溶液的色譜圖比較，在235~ 240nm中的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、冬凌草甲素和胡麻素的吸收峰，在330nm檢測波 長下出現(xiàn)迷迭香酸和胡麻素的吸收峰，則供試品是植物溪黃草(苦溪黃）；在235~240nm中 的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸收峰，在330nm檢 測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和咖啡酸乙酯的吸收峰，則供試品是植物線紋香茶菜或細(xì)花線紋香 茶菜(甜溪黃）。
[0055] 本發(fā)明所述方法中，制備供試品溶液時，待測植物樣品為過60目的粉末。
[0056] 本發(fā)明說明書中，沒有特殊說明，"溪黃草"指的是藥材溪黃草；"苦溪黃"指的是植 物溪黃草；"甜溪黃"指的是線紋香茶菜和/或細(xì)花線紋香茶菜。
[0057]本發(fā)明說明書中"50%乙醇"指的是乙醇體積百分比濃度為50%，一般用酒精計測 定。
[0058]發(fā)明人經(jīng)過深入研究并進(jìn)行了大量的實驗，發(fā)現(xiàn):線紋香茶菜、細(xì)花線紋香茶菜等 含迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、咖啡酸乙酯3種成分，而溪黃草不含細(xì)花線紋香茶菜苷A、 咖啡酸乙酯2種成分;植物溪黃草含迷迭香酸、冬凌草甲素、胡麻素三種成分，而線紋香茶 菜、細(xì)花線紋香茶菜不含冬凌草甲素、胡麻素2種成分，因此以迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷 A、咖啡酸乙酯、冬凌草甲素和胡麻素為對照品，特征性強(qiáng)，根據(jù)高效液相圖譜中出現(xiàn)的特征 成分組合，就可以鑒別出藥材是否來源于植物溪黃草。
【附圖說明】
[0059]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0060]圖1為實施例1獲得的混合對照品的高效液相色譜圖，其中1A是240nm下的色譜圖， 1B是330nm下的色譜圖；圖中1號峰為迷迭香酸的吸收峰，2號峰為細(xì)花線紋香茶菜苷A的吸 收峰，3號峰為冬凌草甲素的吸收峰，4號峰為胡麻素的吸收峰，5號峰為咖啡酸乙酯的吸收 峰。
[00611圖2為實施例2獲得的植物溪黃草的高效液相色譜圖，其中2A是240nm下的色譜圖， 2B是330nm下的色譜圖；圖中1號峰為迷迭香酸的吸收峰，2號峰為細(xì)花線紋香茶菜苷A的吸 收峰，3號峰為冬凌草甲素的吸收峰，4號峰為胡麻素的吸收峰，5號峰為咖啡酸乙酯的吸收 峰。
[0062]圖3為實施例3獲得的線紋香茶的高效液相色譜圖，其中3A是240nm下的色譜圖，3B 是330nm下的色譜圖；圖中1號峰為迷迭香酸的吸收峰，2號峰為細(xì)花線紋香茶菜苷A的吸收 峰，3號峰為冬凌草甲素的吸收峰，4號峰為胡麻素的吸收峰，5號峰為咖啡酸乙酯的吸收峰。 [0063]圖4為實施例4獲得的細(xì)花線紋香茶的高效液相色譜圖，其中4A是240nm下的色譜 圖，4B是330nm下的色譜圖；圖中1號峰為迷迭香酸的吸收峰，2號峰為細(xì)花線紋香茶菜苷A的 吸收峰，3號峰為冬凌草甲素的吸收峰，4號峰為胡麻素的吸收峰，5號峰為咖啡酸乙酯的吸 收峰。
[0064]圖5為10批樣品（S1~S10)的高效液相色譜圖，其中5A是235nm下樣品S1~S5的色 譜圖，5B是235nm下樣品S6~S10的色譜圖，5C是330nm下樣品S1~S5的色譜圖，ro是330nm下 樣品S6~S10的色譜圖；圖中1號峰為迷迭香酸的吸收峰，2號峰為細(xì)花線紋香茶菜苷A的吸 收峰，3號峰為冬凌草甲素的吸收峰，4號峰為胡麻素的吸收峰，5號峰為咖啡酸乙酯的吸收 峰。
【具體實施方式】
[0065] 以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0066] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的藥 材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0067] 以下實施例中所用的儀器、試劑和藥材及其來源為：
[0068] 1 ?儀器
[0069] 安捷倫1260型高效液相色譜儀，包括Chemstation色譜工作站、G1314B型DAD檢測 器、G1311C型四元栗、G1329B型自動進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱(美國Agilent公司）；
[0070] AgiLent EcLipse XDB-Ci8(4.6mmX250mm，5iim)色譜柱；
[0071] BT12?型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司）；
[0072] 超聲清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司，型號：KQ-300VDE，功率：300KW，頻率： 45KHz)〇
[0073] 2.試劑
[0074] 95 %乙醇(分析純)規(guī)格:500mL，廣州嘉樂化工有限公司；
[0075]去離子水，自制。
[0076] 3 ?對照品：
[0077]迷迭香酸(批號：111871-201404,中國食品藥品檢定研究院），細(xì)花線紋香茶菜苷A (批號：20160226,實驗室自制，經(jīng)HPLC檢測純度>98.0%)，冬凌草甲素（批號：111721-201403，中國食品藥品檢定研究院），胡麻素(批號:BBP02771，西力生物科技有限公司，純度 >98.0%)和咖啡酸乙酯(批號：20160228,實驗室自制，經(jīng)HPLC檢測純度>98.0%)。
[0078] 4.待測植物
[0079]線紋香茶菜、花線紋香茶菜，購于各大藥店或采于清遠(yuǎn)、英德、福建等多個GAP種植 基地，經(jīng)華南植物園葉華谷研究員鑒定分別為線紋香茶菜Isodon lophanthoides、細(xì)花線 紋香茶菜(纖花香茶菜）Isodon lophanthoides var.graciliflora的干燥地上部分。
[0080]溪黃草，購于各大藥店或采于清遠(yuǎn)、英德、福建等多個GAP種植基地，經(jīng)華南植物園 葉華谷研究員鑒定分別為溪黃草Isodon serra(Maxim. )Kudo干燥地上部分。
[00811實施例1對照品高效液相色譜圖的建立
[0082] 1 ?色譜條件：
[0083] 色譜柱:AgiLent EcLipse XDB-Ci8(4.6mmX250mm，5iim)色譜柱。
[0084]流動相：以乙腈為A相、以體積百分比為0.08~0.3 %的磷酸水溶液為B相進(jìn)行梯度 洗脫。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)B相為0.1 % (vol % )的磷酸水溶液時，各對照品的吸收峰峰形好，分離度 高，基線平穩(wěn)，因此B相優(yōu)選為0.1 % (vol % )的磷酸水溶液。流動相梯度洗脫條件見表1。 [0085]表1梯度洗脫程序 [0086]
[0087] 流速:0 ? 6~1 ? 2mL/min;經(jīng)試驗，發(fā)現(xiàn)流速0 ? 8mL/min時分離效果最好，因此優(yōu)選流 速為 0 ? 8mL/min〇
[0088]柱溫：23 ~28°C，優(yōu)選 25°C。
[0089] 紫外檢測波長:分別調(diào)出迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素、咖 啡酸乙酯5種成分的液相DAD全波長色譜圖，結(jié)果迷迭香酸、胡麻素、咖啡酸乙酯的最大吸收 波長為330nm，細(xì)花線紋香茶菜苷A的最大吸收波長為235nm，冬凌草甲素的最大吸收波長為 238nm。綜合考濾，可以采用235~240nm中的任一波長和330nm雙波長進(jìn)行測定，能同時測定 迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素、咖啡酸乙酯5種成分。本實施例采用 240nm和330nm雙波長進(jìn)行測定
[0090] 洗脫時間：50min。
[0091 ] 2.混合對照品溶液的制備：
[0092] 本發(fā)明混合對照品可以通過如下方法制備:精密稱取迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜 苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯對照品適量，加50%乙醇配制成每lmL含迷迭香酸20 ~40yg、細(xì)花線紋香茶菜苷A 2~lOyg、冬凌草甲素2~16yg、胡麻素10~20yg、咖啡酸乙酯 10~25邱的混合對照品溶液，即得。
[0093] 具體到本實施例，混合對照品溶液通過如下方法制備：
[0094] 精密稱取迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯對照 品分別為6.49、2.28、4.06、3.32、4.09mg，分別置于10mL溶量瓶中，加50 %乙醇分別配制成 每lmL含迷迭香酸649.0yg、細(xì)花線紋香茶菜苷A 228.0yg、冬凌草甲素406.0yg、胡麻素 331.6yg和咖啡酸乙酯409. Oyg的單一對照品儲備液，分別取單一對照品溶液0.5、0.2、0.2、 0.5、0.5mL置于10mL容量瓶中，加50%乙醇定容，配成每lmL含迷迭香酸32.45yg、細(xì)花線紋 香茶菜苷A 4.56yg、冬凌草甲素8.12yg、胡麻素16.58yg、咖啡酸乙酯20.45yg的混合對照品 溶液。
[0095] 3 ?測定：
[0096] 精密吸取所述混合對照品溶液lOyl，注入高效液相色譜儀，記錄240nm和330nm下0 ~50min的色譜圖，具體見圖1。從圖1可以看出，各對照品分離度好，彼此基本沒有干擾。尤 其是細(xì)花線紋香茶菜苷A和冬凌草甲素，基本達(dá)到了基線分離。說明本發(fā)明的色譜條件對于 上述混合對照品的分離是適合的。
[0097]迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯的吸收峰分別 標(biāo)號為1~5。在240nm和330nm檢測波長下，各對照品的出峰情況及保留時間，見表2〇 [0098]表2對照品的出峰情況
[0100] a:表示檢測到吸收峰;b:表示未檢測到吸收峰
[0101] 實施例2植物溪黃草的高效液相色譜圖建立
[0102] 1 ?色譜條件
[0103] 同實施例1的優(yōu)選的色譜條件，其中紫外檢測波長為240nm和330nm〇
[0104] 2.混合對照品溶液的制備
[0105] 同實施例1的"混合對照品溶液的制備"。
[0106] 3.供試品溶液的制備
[0107] 稱取干燥的植物溪黃草粉末0.5g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入20mL50%乙 醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，0.22仰1 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0108] 4 ?測定
[0109] 精密吸取步驟2制備得到的所述混合對照品溶液和步驟3制備得到的所述供試品 溶液lOyl，分別注入高效色譜儀，在所述色譜條件下，記錄240nm和330nm下0~50min的液相 色譜圖，具體見圖2。
[0110]與混合對照品溶液的色譜圖比較，根據(jù)吸收峰的保留時間判斷，植物溪黃草在 240nm下出現(xiàn)了迷迭香酸、冬凌草甲素和胡麻素的吸收峰，在330nm下則只出現(xiàn)了迷迭香酸 和胡麻素的吸收峰。
[0111] 實施例3線紋香茶菜的高效液相色譜圖建立
[0112] 1.色譜條件
[0113] 同實施例1的優(yōu)選的色譜條件，其中紫外檢測波長為240nm和330nm〇
[0114] 2.混合對照品溶液的制備
[0115] 同實施例1的"混合對照品溶液的制備"。
[0116] 3.供試品溶液的制備
[0117] 稱取干燥的線紋香茶菜粉末0.5g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入20mL50%乙 醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，0.22仰1 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0118] 4.測定
[0119] 精密吸取步驟2制備得到的所述混合對照品溶液和步驟3制備得到的所述供試品 溶液lOyl，分別注入高效色譜儀，在所述色譜條件下，記錄240nm和330nm下0~50min的液相 色譜圖，具體見圖3。
[0120] 與混合對照品溶液的色譜圖比較，根據(jù)吸收峰的保留時間判斷，植物線紋香茶菜 在240nm下出現(xiàn)了迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸收峰，在330nm下則只出 現(xiàn)了迷迭香酸和咖啡酸乙酯的吸收峰。
[0121] 實施例4細(xì)花線紋香茶菜的高效液相色譜圖建立
[0122] 1.色譜條件
[0123] 同實施例1的優(yōu)選的色譜條件，其中紫外檢測波長為240nm和330nm〇
[0124] 2.混合對照品溶液的制備
[0125] 同實施例1的"混合對照品溶液的制備"。
[0126] 3.供試品溶液的制備
[0127] 稱取干燥的細(xì)花線紋香茶菜粉末0.5g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加入 20mL50 %乙醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱重量，用50 %乙醇補(bǔ)足減失的重 量，0.22mi濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0128] 4.測定
[0129] 精密吸取步驟2制備得到的所述混合對照品溶液和步驟3制備得到的所述供試品 溶液lOyl，分別注入高效色譜儀，在所述色譜條件下，記錄240nm和330nm下0~50min的液相 色譜圖，具體見圖3。
[0130] 與混合對照品溶液的色譜圖比較，根據(jù)吸收峰的保留時間判斷，植物細(xì)花線紋香 茶菜在240nm下出現(xiàn)了迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸收峰，在330nm下則 只出現(xiàn)了迷迭香酸和咖啡酸乙酯的吸收峰。
[0131] 上述實施例2~4的結(jié)果表明，植物溪黃草和線紋香茶菜、細(xì)花線紋香茶菜在本發(fā) 明所述色譜條件下的色譜圖具有顯著不同的特征，據(jù)此可以快速地鑒別作為溪黃草使用的 植物的來源。
[0132] 實施例5藥材溪黃草的植物基原鑒別
[0133] 從不同渠道收集到藥材溪黃草10份，經(jīng)性狀(黃汁、植物外觀和顯微性狀)鑒定，確 定其植物基原，具體見表3。將上述藥材溪黃草交由分析實驗員隨機(jī)編號（不告知其植物基 原），分別按照實施例3的方法和步驟(但是，其中紫外檢測波長為235nm和330nm)，得到混合 對照品和各樣品235nm和330nm的色譜圖。
[0134] 將各樣品的色譜圖與混合對照品相應(yīng)的色譜圖比較，根據(jù)對照品出峰的情況，判 斷樣品是"苦溪黃"（植物溪黃草），還是"甜溪黃"（細(xì)花線紋香茶菜或線紋香茶菜）。結(jié)果見 表3〇
[0135] 表3藥材溪黃草植物基原鑒別結(jié)果
[0138] 從表3可以看出，利用本發(fā)明的方法鑒別藥材溪黃草的植物基原，結(jié)果與經(jīng)典的性 狀鑒相符合，且可以快速地鑒別藥材溪黃草是"苦溪黃"還是"甜溪黃"。
[0139] 以上對本發(fā)明【具體實施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本 發(fā)明做出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種鑒別藥材溪黃草的植物來源的方法，所述方法基于高效液相色譜法，以迷迭香 酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯為對照品，色譜條件包括： 固定相:十八硅烷鍵合硅膠； 流動相：以乙腈為A相，體積百分比濃度0.08~0.3 %的磷酸水溶液為B相，按照如下程 序梯度洗脫： 第Omin，A相占流動相的體積百分比為18%，其余為B相， 第33min，A相占流動相的體積百分比為23%，其余為B相， 第45min，A相占流動相的體積百分比為30 %，其余為B相， 第50min，A相占流動相的體積百分比為34 %，其余為B相， 流速:0.6~1.2mL/min; 柱溫：23~28 °C; 檢測波長:235~240nm中的任一波長和330nm。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述B相為體積百分比濃度0.1 %的磷酸水 溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述流速為0.8ml/min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱溫為25 °C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括混合對照品溶 液的制備;具體操作為:精密稱取迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖 啡酸乙酯對照品，加50%乙醇配制成每lmL含迷迭香酸20~40yg、細(xì)花線紋香茶菜苷A2~10 yg、冬凌草甲素2~16yg、胡麻素10~20yg、咖啡酸乙酯10~25yg的混合對照品溶液，即得。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括供試品溶液 的制備；具體操作為：稱取干燥的待測植物樣品粉末，置于具塞容器中，加入20mL 50%乙 醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，0.224111 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述的方法，還包括測定步 驟;具體操作為:精密吸取制備得到的所述混合對照品溶液和供試品溶液，分別注入高效色 譜儀，在上述色譜條件下，記錄235~240nm中的任一波長和330nm下0~50min的液相色譜 圖。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括鑒別步驟;具 體的，供試品溶液與混合對照品溶液的色譜圖比較，在235~240nm中的任一檢測波長下出 現(xiàn)迷迭香酸、冬凌草甲素和胡麻素的吸收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和胡麻素的 吸收峰，則供試品是植物溪黃草;在235~240nm中的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、細(xì)花線 紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸和咖啡酸乙酯的吸 收峰，則供試品是植物線紋香茶菜或細(xì)花線紋香茶菜。9. 一種植物線紋香茶菜、細(xì)花線紋香茶菜和植物溪黃草的鑒別方法，所述方法基于高 效液相色譜法，以迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯為對照 品，包括色譜條件的建立、混合對照品溶液的制備、供試品溶液的制備、測定和鑒別;具體操 作為： I.色譜條件的建立 固定相:十八硅烷鍵合硅膠； 流動相：以乙腈為A相，體積百分比濃度0.1 %的磷酸水溶液為B相，按照如下程序梯度 洗脫： 第Omin，A相占流動相的體積百分比為18%，其余為B相， 第33min，A相占流動相的體積百分比為23%，其余為B相， 第45min，A相占流動相的體積百分比為30 %，其余為B相， 第50min，A相占流動相的體積百分比為34 %，其余為B相， 流速:〇.8ml/min; 柱溫：25°C; 檢測波長:235~240nm中的任一波長和330nm; II. 混合對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A、冬凌草甲素、胡麻素和咖啡酸乙酯對照品，加 50%乙醇配制成每lmL含迷迭香酸20~40yg、細(xì)花線紋香茶菜苷A 2~10yg、冬凌草甲素2~ 16yg、胡麻素10~20yg、咖啡酸乙酯10~2 5yg的混合對照品溶液，即得； III. 供試品溶液的制備 稱取干燥的待測植物樣品粉末，置于具塞容器中，加入20mL50%乙醇，密塞，稱定重量， 超聲提取30min，放冷，再稱重量，用50 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，0.22μπι濾膜濾過，取續(xù)濾液， 即得； IV. 測定 精密吸取步驟II制備得到的所述混合對照品溶液和步驟III制備得到的所述供試品溶 液10μ1，分別注入高效色譜儀，在所述色譜條件下，記錄235~240nm中的任一波長和330nm 下0~50min的液相色譜圖； V. 鑒別 將步驟IV得到的供試品溶液色譜圖與混合對照品溶液的色譜圖比較，在235~240nm中 的任一檢測波長下出現(xiàn)迷迭香酸、冬凌草甲素和胡麻素的吸收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn) 迷迭香酸和胡麻素的吸收峰，則供試品是植物溪黃草;在235~240nm中的任一檢測波長下 出現(xiàn)迷迭香酸、細(xì)花線紋香茶菜苷A和咖啡酸乙酯的吸收峰，在330nm檢測波長下出現(xiàn)迷迭 香酸和咖啡酸乙酯的吸收峰，則供試品是植物線紋香茶菜或細(xì)花線紋香茶菜。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其特征在于，制備供試品溶液時，待測植 物樣品為過60目的粉末。
【文檔編號】G01N30/88GK106053696SQ201610488797
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】張慧曄, 唐海明, 王德勤, 李楚源
【申請人】廣州白云山和記黃埔中藥有限公司, 清遠(yuǎn)白云山和記黃埔穿心蓮技術(shù)開發(fā)有限公司