能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子及其編碼DNA、β淀粉樣蛋白檢測試劑盒及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子及編碼該大分子的DNA、β淀粉樣蛋白檢測試劑盒及其用途。首先使用抗原43肽β淀粉樣蛋白免疫小鼠，確定免疫成功后，分離出小鼠脾臟和淋巴結(jié)，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴增出抗體的輕、重鏈基因；然后組裝與擴增scFv DNA，構(gòu)建pCANTAB5E?scFv重組質(zhì)粒；再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒得到單鏈抗體噬菌體庫，通過篩選得到目標抗體；最后組裝成人β淀粉樣蛋白檢測試劑盒。本發(fā)明篩選得到的抗體檢測范圍較廣，為0~1000pg/ml，線形相關(guān)系數(shù)高，檢測靈敏度可達3.0pg/ml，且非常穩(wěn)定。
【專利說明】
[0001] 能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子及其編碼DNAj淀粉樣蛋 白檢測試劑盒及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子 及編碼該大分子的DNA、份定粉樣蛋白檢測試劑盒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 人口老齡化是當今世界各國面臨的重大社會問題，已經(jīng)引起國際社會的廣泛關(guān) 注。截至2014年底，我國60歲以上老年人口已經(jīng)達到2.12億，占總?cè)丝诘?5.5%。預(yù)計2033年 前后將翻番到4億，到2050年左右，老年人口將達到全國人口的三分之一，"銀發(fā)潮"將對我 國的經(jīng)濟、社會、政治、文化發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響。老年人的心理及身體健康問題日益成為 全社會關(guān)注的焦點。老年癡呆癥是老年人腦部功能失調(diào)的一種表現(xiàn)，是以智力衰退、行為及 人格變化為特征。典型臨床癥狀包括有記憶力、抽象思考、定向力障礙等，同時伴有社會活 動能力減退。主要表現(xiàn)為健忘、目光呆滯、口齒遲鈍，繼而影響知覺神經(jīng)，失去自理能力。它 已成為老年人健康的一大克星。
[0004] 阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年癡呆癥一種常見形式。目前全世 界大約有2500萬AD患者。患者多為老年人，AD目前尚無有效療法。該病患不僅患者自身痛 苦，而且對于其家庭乃至整個社會都會造成極為消極的影響。迄今為止，AD發(fā)病的確切機理 尚未完全清楚。但大量研究揭示:淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP)產(chǎn)生 的淀粉樣蛋白（amyloid l_Peptide，Al)在AD的病理學上起了重要作用。患者大腦中β淀粉 樣蛋白出現(xiàn)異常蓄積，常在患者腦細胞內(nèi)形成腦纖維組織糾結(jié)(n euro f i br i 11 ary tang I e， NFT)、腦細胞外形成老年斑（senile plague，SP)。因此，NFT和SP也被認為AD的病理診斷依 據(jù)。β淀粉樣蛋白（β-Amyloid)是由前體物質(zhì)β淀粉樣前體蛋白（Αβ)經(jīng)酶解作用形成40到43 個氨基酸的多肽。在機體內(nèi)，APP普遍存在于人體的心臟、腦、腎、肺、腸等器官。在腦中，中樞 神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、星形細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞均能表達ΑΡΡ。正常情況 下，β淀粉樣蛋白僅有極少量表達，低濃度的β淀粉樣蛋白對未分化、不成熟的神經(jīng)元有營養(yǎng) 作用，而高濃度的β淀粉樣蛋白對已分化的成熟神經(jīng)元則有毒性作用。β淀粉樣蛋白的沉淀 與APP的過度表達和異常加工有關(guān)，APP經(jīng)Ig分泌酶降解，產(chǎn)生淀粉樣蛋白生成可溶性和 不可溶性兩種狀態(tài)，不溶的以β折疊為主，上述構(gòu)象有利于β淀粉樣蛋白的聚集。β淀粉樣蛋 白在形成高密度、纖維狀的聚合體后可引起神經(jīng)毒性，從而妨礙神經(jīng)細胞的正常生長與傳 導。
[0005] 目前，臨床對于老年癡呆癥的治療，首先考慮的是對癥治療，如，神經(jīng)節(jié)苷脂能有 效修復(fù)受損或瀕死的腦神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)的修復(fù)再生及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重塑;補充膽堿類藥 物能改善其記憶和思維能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種非常穩(wěn)定的能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子，該 生物大分子包含SEQ ID NO.2氨基酸序列。
[0007] 本發(fā)明的還提供上述生物大分子的用途，即該生物大分子用于定性或/和定量檢 測人的體液中人β淀粉樣蛋白含量的用途，該生物大分子包含SEQ ID NO.2氨基酸序列。
[0008] 本發(fā)明的還提供編碼上述生物大分子的DNA，該DNA含有如SEQ ID NO. 1的序列。
[0009] 本發(fā)明的還提供β淀粉樣蛋白檢測試劑盒，其包括： -固相，上述固相上固定了捕捉用抗體，上述捕捉用抗體包括抗人β淀粉樣蛋白單鏈抗 體， -導致變性的溶液，和 -含有檢測用抗體的液相，上述檢測用抗體包括抗人β淀粉樣蛋白多克隆抗體。上述抗 人β淀粉樣蛋白單鏈抗體或抗人β淀粉樣蛋白多克隆抗體具有如SEQ ID NO.2的序列。
[0010]采取的進一步優(yōu)化措施包括： 上述檢測用抗體能與上述捕捉用抗體包夾檢測β淀粉樣蛋白。
[0011] 上述抗人β淀粉樣蛋白多克隆抗體經(jīng)生物素標記；上述液相還包括用于定量測試 參照的標準品。
[0012] 上述液相還包括顯色劑;上述顯色劑為四甲基聯(lián)苯二胺；上述導致變性的溶液為 反應(yīng)終止液;上述反應(yīng)終止液為HCl。
[0013] 上述液相還包括洗滌液;上述洗滌液為pH值為7.2的含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液； 上述液相還包括濃縮酶結(jié)合物，上述濃縮酶結(jié)合物包括但不限于辣根過氧化物酶標記 的親和素。
[0014] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 1、 本發(fā)明篩選的抗體非常穩(wěn)定，檢測時采用雙抗夾心法的反應(yīng)模式，此方法具有操作 簡便、反應(yīng)快捷的優(yōu)點，對實驗室條件及設(shè)備要求不高，易于掌握和推廣； 2、 本發(fā)明的試劑盒檢測范圍較廣，其檢測范圍為0~1000pg/ml，該試劑盒線形相關(guān)系數(shù) 更尚； 3、 本發(fā)明的試劑盒靈敏度較高，其檢測靈敏度最高可達3.0pg/ml，可用于老年癡呆癥 早期預(yù)防。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明的質(zhì)粒載體圖譜； 圖2是本發(fā)明使用份定粉樣蛋白免疫小鼠后抽血用ELISA方法檢測效價； 圖3是本發(fā)明PCR樣品瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0016] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0017] 實施例:本發(fā)明的技術(shù)路線是，首先，使用抗原43肽β淀粉樣蛋白免疫小鼠，確定免 疫成功后，分離出小鼠脾臟和淋巴結(jié)，提取總的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴增出抗體的 輕、重鏈基因。然后組裝與擴增scFv DNA，構(gòu)建pCANTAB5E-scFv重組質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒得到 單鏈抗體噬菌體庫，通過篩選得到目標抗體。最后組裝成人β淀粉樣蛋白檢測試劑盒。
[0018] 通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建和篩選單鏈抗體 細胞及細胞株采用coh· TGl，用于pCANTAB-5E的轉(zhuǎn)化coh· ΗΒ2151，用于scFv的 表達。
[0019] Triz〇 1總RNA抽提試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及內(nèi)切酶均購自NEB公司。DNA膠回收試劑盒購自天根公司。 Ml 3K07輔助噬菌體購自GE公司。某閔擴增的引物序列如下表： 實驗方法
動物免疫： β淀粉樣蛋白抗原與等量的弗氏完全佐劑混勻后，采用腹部和背部皮下多點注射方式 免疫Balb/C小鼠。每隔14天免疫一次，4次免疫后，抽血用ELISA方法檢測效價，具體方法為： 1)用磷酸鹽緩沖液將血清按一定比例稀釋后（稀釋比例見圖），每孔50μ1加在包被板 上，于4 °C放置過夜； 2) 用200μ 1含牛血清白蛋白為2%(W/V)、蔗糖為3%(W/V)的磷酸鹽緩沖液封閉液封閉包 被板； 3) 同時加入生物素化的抗人β淀粉樣蛋白（Αβ)抗體和標準品、樣品，每孔為50μ1;樣品 中的人β淀粉樣蛋白會與加入于孔中的生物素化的抗人β淀粉樣蛋白抗體及包被于酶標板 上的多抗結(jié)合，形成免疫復(fù)合物； 4) 用磷酸鹽緩沖液洗滌包被板，游離的成分被洗去； 5) 加入辣根過氧化物酶標記的親合素，親合素與生物素特異性結(jié)合，游離的成分被洗 去； 6) 反應(yīng)孔中有人β淀粉樣蛋白，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑變藍，加終止液變 黃。在490nm處測OD值。
[0020] 分離純化淋巴細胞： 取出小鼠脾臟和淋巴結(jié)。用PBS洗滌并移除多余脂肪組織，將脾臟和淋巴結(jié)置于20目不 銹鋼網(wǎng)膜中，輕輕研磨組織，使淋巴細胞通過網(wǎng)膜流入平皿中。用PBS輕輕沖洗不銹鋼網(wǎng)膜 和平皿后，輕輕吹打均勻后將細胞懸液置于15ml離心管中，離心收集細胞。
[0021] 提取淋巴細胞總RNA: 按照Invitrogen公司的Tr izol總RNA抽提試劑盒說明書提取淋巴細胞總RNA。
[0022] 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA: 反應(yīng)程序為:94°C 5min，42°C 60min，反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA。
[0023] 反轉(zhuǎn)錄體系如下： 暴 Ci:嫌壤_:》..： ISj成 5徹物' .補' dNTi5 MSsiEtf? 1 # ??Μ:> l|sl .、·:夠1:細*!梅. iL辦 :濟莰||爨翁 轉(zhuǎn)纏纖： 寧 2.5擴增輕、重鏈基因 輕、重鏈基因擴增體系如下： 班吻iidte 2ji ?>ΝΑ 袖 <Γ?<?Τ Mbtoj! ? si / ? 試 凝:篸:義錄凝Ci_0 #_ 'Γ????ΟΝΑ 聚會稼 IfM 鉢賴終:纖 麵 擴增程序為:94 °C預(yù)變性5min，94 °C變性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸30s，30個循環(huán)，72 °C延伸lOmin。電泳膠回收純化輕、重鏈基因片段。輕鏈可變區(qū)基因片段的擴增：以cDNA為模 板，以VL的上、下游引物VAback和MJAfor-Mix進行PCR擴增。將VL下游引物MJAlfor、MJA 2for、MJX3f〇r和MJA4for混合為MJAfor-Mix。重鏈可變區(qū)基因片段的擴增：以cDNA為模板， 以VH的上、下游引物VH back和VH for進行PCR擴增。
[0024] 2.6 scFv DNA的組裝與擴增 Linker引物和輕、重鏈基因擴增片段，通過重疊延伸拼接PCR( S0E-PCR)，使抗體Vh、Vl 基因與Linker組裝成VH-Linker-VL單鏈抗體。然后通過scFv單鏈抗體引物擴增scFv DNA。其中正向引物為 Sf i I back，反向引物為 JAI-No 11、JX2-No 11、JX3-No 11 和 JA4-No 11 的 混合物。
[0025] 重疊延伸拼接PCR擴增條件為:94°C lmin，63°C 4min，作用7個循環(huán);添加ScFv單 鏈抗體引物后再擴增scFv DNA，程序為94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，作用30個循環(huán)， 最后72 °C延伸IOmin。
[0026]重疊延伸拼接PCR反應(yīng)體系為： 寧 '雖灸I 備 1.0辯域〉： j|S| Llists# 1;? 備頌街壤 獄僉藝; :3:辦 H iX 糊 單鏈抗體庫的構(gòu)建和鑒定 單鏈抗體scFv片段和噬菌粒載體pCANTAB-5E分別用S/?Ι和NoiI進行酶切，之后連接、 電轉(zhuǎn)化入E. coh TGl感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化的細胞加入培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)，當0D600為0.8時， 加入M13K07輔助噬菌體，繼續(xù)培養(yǎng)至終濃度10 1()pfu/ml。加氨芐青霉素至終濃度lOOug/ml， 繼續(xù)培養(yǎng)過夜，即可得到單鏈抗體噬菌體抗體初級庫。通過ELISA篩選最理想的單鏈抗體， 并純化出質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入[coh HB2151用于scFv的表達。
[0027]實驗結(jié)果 ELISA方法檢測血清效價 使用β淀粉樣蛋白免疫小鼠后，抽血用ELISA方法檢測效價，結(jié)果見圖2,結(jié)果表明稀釋 倍數(shù)增加到1:50000時血清中的抗體依然可明顯檢測到，表明免疫小鼠是成功的。
[0028]重鏈、輕鏈基因擴增結(jié)果 取7μ I PCR樣品瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.3%，6V/cm電泳20min。結(jié)果如圖3 所示，Vh和Vl均位于250bp和500bp之間。
[0029] Vh和Vl連接后的ScFv基因 取7μ I PCR樣品瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.2%，6V/cm電泳20min。結(jié)果如圖3 所示，Vh和Vl拼接后，得到的ScFv基因約為750bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，所編碼的氨基 酸序列如SEQ ID NO.2所示，具體如下： ScFv基因，SEQ ID NO. 1: ATGGCCCAGGTCAAACTGCAGGAGTCAGGCGGCGACCTGAAGAAGCCCGCCGCCACCGTGAGAATCAGCTGCA AGGCCACCGCCTACAGCTGGAGCACCTACGGCATGCACTTCGTGAAGAACGCCCCCGGCCAGCACCTGGAGTTCATG GGCTTCATCAACGCCGGCCAGGGCGCCAGCCACTACAGCCAGAGATTCAACGGCAGAGTGAGCATCACCAAGGAGAG CACCGCCAGCACCGGCTACATGGACGTGACCACCATCAGAAGCGACGAGACCGCCGTGTTCTACTGCGCCCACAGCA GAAAGAAGAACTTCGGCCAGGGCAGCCTGGTGACCGTGAGCAGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGC GGCGGCGGCAGCAGCGACATCACCAACGACCCCGGCGTGACCCTGGCCCTGGGCAACACCGTGAGACTGACCTGCCA GGGCGAGAGCATCAAGAGCTACTACGGCAGCTGGTACAACAACAAGCCCGCCCAGGCCCCCCTGGTGCTGATCTACG GCAAGCAGAACAAGCCCAGCGGCCTGCCCGACAGAAAGTTCAGCGGCACCACCAGCGGCCAGACCGGCAGCGTGACC ATCACCGCCGCCCAGGCCGACGAGGAGGCCGAGTTCTACTGCAACACCAGAGAGACCAGCGCCAACCACCTGGTGTT CGGCGCCGCCACCAGAATCAGCCTGGTGGGCGCCGGCGCCGAGCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCGGCCG CAGAATGACTC ScFv基因的氨基酸序列，SEQ ID NO.2: MAQVKLQESGGDLKKPAATVRISCKATAYSWSTYGMHFVKNAPGQHLEFMGFINAGQGASHYSQRFNGRVSIT KESTASTGYMDVTTIRSDETAVFYCAHSRKKNFGQGSLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSDITNDPGVTLALGNTVRL TCQGESIKSYYGSWYNNKPAQAPLVLIYGKQNKPSGLPDRKFSGTTSGQTGSVTITAAQADEEAEFYCNTRETSANH LVFGAATRISLVGAGAEQGTKLEIKRAAAE* SEQ ID NO. I和NO. 2對應(yīng)如下： λλλ CS：<5- CSsS 'ΓΓ?5· .??: Ο?-ΟΓ ?·> ?? λ ：?5·.： ·ν· ：?： ?.立 S 丨-5 ^ &： ：￡.： ：Χ；： 'K; 5* A 義 ?： V λΛΧ λ?'Λ'： iOvVi >.^5 Λ.·Λ\' Λν.5Τ'Χ* Λ?.* '： 漢 i S G Λ i X ? JS 次 Ι? ? X ?? ：??. Λ； Λ' V K Α··.ν： χ,'ΛΟ ?：.'V Ki-'-y： ?.λ* ^ >, ? C ^ ·? ? 1 % λ ?； i A $ Λ??； ^.W.' .??- ?Υ：·.·： .\λ.： ?,.??; :5tVV AS···： ·'： ??? >；· 'S' is ?5 %. .ST ..Α? ·?? ?? 'λ :5：: Τ. :7:._ ?? R S "S A ?? λ- AS--C .?Λν； *?.<； NXiV? ν?Χ" ：；^Χ? > ?Λ；ν ?ν?, ν??? ^ v ^ V 5-i C V T ^ T S. ? ? A V $' ? 、Γ >, K ΑΛ"; =?? '5^ir '怒.'? 靶::：氣滅： f:. '洛 益：_:杳_ 致.. ψ 'i..吻 ：s.. .趣歲.：威.. ΝΛΧ' *C；', <X'C ?：^ s: '?Λ·；' ..:這...窣....承.費.疫.，S::.:嘁 象湊.:卷..:簽.努： Z % .誇...SS..::這.,杳.V A.cr C-Tii v?<^ Ctr-i λλ-C ^?'? λ-?-Α OTC： ：·：Λ?〇 -S-Ai λν? J^C rA'；s < '???? t ?.. Λ Α、 Λ： η Y K ?· Y $ 兌 S c ：? A ?? ? Tix \ν；ν：； ?·5>? ????? ·?.^·. ；%Λ.Ο Χλ-s ^.'C ??.ν·：： WAi； -.'XX' C5\> ?>Γ·5 .VAT:? VAi" ^ Y Q S V 文 ?? 攻 K χ· Α. 公 ,λ·: ：\· λ、 ? V ? K ΑΛΟ <：Ci： ^ ?.Τ-ν Α??λ .?Α?； Χ5Χ" C^X ^ λ??； ^ 'χΑ-?? <. *<：$ 〇· ?? .St··: S ? -S： Λ； 公 l> .5? . _;Κ_ y_ S： S .7: S ?? T ,5ν^ \：?^ Λ?.ν Α??： AO '： ???.ν： ?，Κ；0 \ν?<： ?；Α* ? :\' ?Λ?Λ AA V As：；V 令 * V ? λ ? λ· * ·? iS. S： > & ? ?? C j ·? .?^? (6.?-:? ?；<χ； .?.?^ ·??'Χ· ·ΤΧ'￥. <SSS -:5^- ?。??τ .?:? ?.·><： ν^·$ ^?·'； <. Λ：ζ·> ? δ T SS ·\ ?! ￥1 X· Sf <5 A Sf S ? -S 乙 \s <5 sHV： s<.C?ir ?λ^Λ iS.T^ νν：^ ?.Λν： ??*：^ χ"^. < "、·· 義 眾 λ S. 公 <5 T K Ss 5i .? ?? R A 備各:iV + 單鏈抗體的鑒定 篩選獲得步驟3.3所述序列的單鏈抗體后，純化出質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入I C〇2i HB2151用于ScFv 的表達，所得單鏈抗體分子量約為25KD。
[0030]組裝人β淀粉樣前體蛋白試劑盒 ELISA篩選出合適單鏈抗體后，組裝成人β淀粉樣蛋白試劑盒。該試劑盒包括抗體包被 板條、標準品、濃縮生物素化抗體(單鏈抗體標記生物素 ）、濃縮酶結(jié)合物、試劑稀釋液、濃縮 洗滌液、顯色劑及終止液。具體組成如表1所示。
[0031] 表1本發(fā)明人β淀粉樣蛋白試劑盒的組成
抗體包被板條的制備包括以下步驟：用pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液將本發(fā)明制備的鼠 抗人β淀粉樣蛋白單鏈抗體稀釋至lμg/ml，加在包被板上，用封板紙封板，在4°C放置24h過 夜后，將包被板置于洗板機上，用pH值為7.2的吐溫20含量為0.1%(V/V)的磷酸鹽緩沖液洗 板一次，然后加入pH值為7.2、含牛血清白蛋白為2%(W/V)、蔗糖為3%(W/V)的磷酸鹽緩沖液， 在室溫下放置2h，甩干封閉液，風干。風干的包被板裝入鋁箱袋中，加入干燥劑，密封即得抗 體包被板條。
[0032]標準品的制備包括以下步驟：以pH值為7.2，含牛血清白蛋白為5%(W/V)的磷酸鹽 緩沖液為溶劑，將人β淀粉樣蛋白重組蛋白標準品配制成2000pg/50l·! 1/支的溶液，將該溶液 置于_70°C低溫環(huán)境中凍干2h，然后將其置于冷凍干燥機中凍干8h，密封即得標準品。
[0033]濃縮生物素化抗體為生物素標記的抗人β淀粉樣蛋白單鏈抗體，具體采用Thermo Fisher:Sulfo-NHS-LC-Biotin Kit來標記本發(fā)明的抗人β淀粉樣蛋白單鏈抗體。濃縮酶結(jié) 合物為辣根過氧化物酶標記的鏈親和素。試劑稀釋液為PH值為7.2、牛血清白蛋白含量為1% (W/V)的磷酸鹽緩沖液。濃縮洗滌液為pH值為7.2、吐溫20含量為0.1%(V/V)的磷酸鹽緩沖 液。顯色劑為四甲基聯(lián)苯二胺。終止液為IN HCUlN鹽酸）。
[0034]利用本發(fā)明的試劑盒進行人β淀粉樣蛋白檢測，采用雙抗體夾心ELISA法。抗人β淀 粉樣蛋白單鏈抗體包被于酶標板上，同時加入標本、標準品和生物素化的抗人β淀粉樣蛋白 單鏈抗體，標本、標準品中的人β淀粉樣蛋白會與加入于孔中的生物素化的抗人β淀粉樣蛋 白抗體及包被于酶標板上的單抗結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入辣根過氧 化物酶標記的親合素，親合素與生物素特異性結(jié)合，游離的成分被洗去。加入顯色底物（顯 色劑），若反應(yīng)孔中有人β淀粉樣蛋白，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑變藍，加終止液變 黃。在490nm處測OD值，人β淀粉樣蛋白濃度與OD 49q值之間呈正相關(guān)，可通過繪制標準曲線求 出標本中人β淀粉樣蛋白濃度。具體包括以下步驟： 試驗所需自備試驗器材： 1.酶標儀(490nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片）； 2 ·高精度加液器及一次性吸頭:0 · 5-10μ 1，2-20μ 1，20-200μ 1，200-1000μ 1; 3.微孔板振蕩器，雙蒸水或去離子水，坐標紙。
[0035] 標本收集： 1.收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管； 2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA，避免使用溶血，高血脂標本； 3. 標本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除； 4. 標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20°C或-70°C冰箱內(nèi)，避 免反復(fù)凍融； 5. 可根據(jù)標本的實際情況，做適當倍數(shù)稀釋； 注:血清或血漿樣本凍存后聚合的蛋白會遮蓋抗原的表位，建議用試劑稀釋液將血清 或血漿樣本做1:2稀釋后檢測。計算樣本含量時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
[0036] 注意事項： 1. 試劑盒使用前請保存在2-8tC，除復(fù)溶后的標準品，其它成分不可凍結(jié)； 2. 濃縮生物素化抗體、濃縮酶結(jié)合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置會使液體沾到 管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000 rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體 沉積到管底； 3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，微加熱至40°C使結(jié)晶完全 溶解后再配制洗滌液； 4. 若需要分次使用標準品，在標準品復(fù)溶后應(yīng)按每一次用量分裝，將其放在-20或-70 °C貯存。避免反復(fù)凍融； 5. 不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外）； 6. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率），如無微 量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕晃動酶標板，使加入孔中的反應(yīng)液混勻； 7. 酶免試驗中標準品和樣本檢測時建議作復(fù)孔。
[0037] 檢測前準備工作： 1. 提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫； 2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1:20)，未用完的放回4°C冰箱； 3. 標準品：加入試劑稀釋液1.0 ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕 輕混勻（濃度為2000pg/ml)。然后根據(jù)需要進行稀釋。建議標準曲線使用以下濃度：1000、 500、250、125、62·5、31·25、15·625、0 pg/ml; 4. 生物素化抗體工作液:按當次試驗所需用量，用試劑稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體 (1:100)配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用； 5. 酶結(jié)合物工作液：按當次試驗所需要用量，用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物（1: 100)配置成酶結(jié)合物工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。
[0038]洗滌方法： 1. 自動洗板機:要求注入的洗滌液為350μ 1，注入與吸出間隔20-30秒。洗板4次； 2. 手工洗板:每孔加洗滌液350μ1，靜置30秒后甩盡孔內(nèi)液體，在厚迭吸水紙上拍干。 洗板5次。
[0039] 操作步驟： 1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箱 袋內(nèi)封存于4°c; 2. 留空白孔(若使用雙波長讀板，空白孔可以不設(shè)）； 3. 提前準備好樣本、標準品和生物素化抗體工作液； 4. 先將不同濃度標準品（OmIU/ml孔加試劑稀釋液)分別加入相應(yīng)孔中（100μΙ/孔）;在 每個樣本孔中加入50μ1樣本稀釋液和50μ1樣本(此時樣本已做了 1:2倍稀釋，計算結(jié)果時樣 本含量要乘以2);隨后在樣本和標準品孔中加入50μ1生物素化抗體工作液，用封板膠紙封 住反應(yīng)孔； 5. 室溫(20~25°C)孵育120分鐘。最好使用微量振蕩器(最低頻率，IOOrpm); 6. 提前15分鐘制備酶結(jié)合物工作液。室溫避光放置； 7. 洗板5次； 8. 除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100μ 1/孔）。用封板膠紙封住反應(yīng)孔； 9. 室溫(20~25°C)避光孵育60分鐘。最好使用微量振蕩器(最低頻率，IOOrpm); 10. 洗板5次； 11. 加入顯色底物(包括空白孔）1〇〇μ1/孔，室溫(22~25°C)，避光孵育15分鐘； 12. 加入終止液(包括空白孔）100μ 1 /孔，混勻后即刻測量0D490值（10分鐘內(nèi)）。
[0040] 結(jié)果判斷： 1. 每個標準品和標本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值(若不減零孔值，標準曲線的零孔應(yīng)相 交于Y軸）； 2. 手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準 品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度； 3. 若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 [0041 ]本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性和靈敏度測試 比較本發(fā)明人β淀粉樣蛋白試劑盒與目前市場上的人體β淀粉樣蛋白試劑盒的穩(wěn)定性 和靈敏度。
[0042] 1實驗方法 (1) 用磷酸鹽緩沖液將鼠抗人β淀粉樣蛋白抗體稀釋至lμg/ml，每孔50μ1加在包被板 上，于4 °C放置過夜； (2) 用200μ 1含牛血清白蛋白為2%(W/V)、蔗糖為3%(W/V)的磷酸鹽緩沖液封閉包被板； (3) 同時加入標準品和生物素化的抗人β淀粉樣蛋白抗體，每孔為50μ1，每個濃度梯度 重復(fù)三次;標準品中的人β淀粉樣蛋白會與加入于孔中的生物素化的抗人β淀粉樣蛋白抗體 及包被于酶標板上的單抗結(jié)合，形成免疫復(fù)合物； (4) 用磷酸鹽緩沖液洗滌包被板，游離的成分被洗去； (5) 加入辣根過氧化物酶標記的親合素，親合素與生物素特異性結(jié)合，游離的成分被洗 去； (6) 反應(yīng)孔中有人β淀粉樣蛋白，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑變藍，加終止液變 黃。在490nm處測OD值。如下表。
盡管已結(jié)合優(yōu)選的實施例描述了本發(fā)明，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù) 人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，能夠?qū)υ谶@里列出的主題實施各種改變、同 等物的置換和修改，因此本發(fā)明的保護范圍當視所提出的權(quán)利要求限定的范圍為準。
【主權(quán)項】
1. 份定粉樣蛋白檢測試劑盒，其特征是:包括 -固相，所述的固相上固定了捕捉用抗體，所述的捕捉用抗體包括抗人β淀粉樣蛋白單 鏈抗體， -導致變性的溶液，和 -含有檢測用抗體的液相，所述的檢測用抗體包括抗人β淀粉樣蛋白多克隆抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種β淀粉樣蛋白檢測試劑盒，其特征是:所述的抗人β淀粉樣 蛋白單鏈抗體或抗人β淀粉樣蛋白多克隆抗體具有如SEQ ID NO.2的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種淀粉樣蛋白檢測試劑盒，其特征是:所述的檢測用抗體 能與所述的捕捉用抗體包夾檢測β淀粉樣蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的一種β淀粉樣蛋白檢測試劑盒，其特征是:所 述的抗人β淀粉樣蛋白多克隆抗體經(jīng)生物素標記;所述的液相還包括用于定量測試參照的 標準品。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的一種β淀粉樣蛋白檢測試劑盒，其特征是:所 述的液相還包括顯色劑;所述的顯色劑為四甲基聯(lián)苯二胺;所述的導致變性的溶液為反應(yīng) 終止液;所述的反應(yīng)終止液為HC1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一權(quán)利要求所述的一種β淀粉樣蛋白檢測試劑盒，其特征是:所 述的液相還包括洗滌液;所述的洗滌液為pH值為7.2的含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液;所述的 液相還包括濃縮酶結(jié)合物，所述的濃縮酶結(jié)合物包括但不限于辣根過氧化物酶標記的親和 素。7. 能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子，其特征是：所述的生物大分子包含SEQ ID NO. 2氨基酸序列。8. -種能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子的用途，其特征是:該生物大分子用于定性 或/和定量檢測人的離體體液中人β淀粉樣蛋白含量的用途;所述的生物大分子包含SEQ ID NO. 2氨基酸序列。9. 一種編碼能與β淀粉樣蛋白結(jié)合的生物大分子的DNA，其特征是：該DNA含有如SEQ ID NO. 1的序列。
【文檔編號】C07K16/18GK105938145SQ201610120602
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年3月3日
【發(fā)明人】陶新博, 張守濤, 郭亞楠
【申請人】浙江聚康生物工程有限公司