用于選擇性確定胎盤生長因子2的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在妊娠對象中進行胎盤生長因子2(PlGF?2)檢測的免疫測定方法。此外,本發(fā)明涉及所述方法用于對產(chǎn)前病癥進行診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估和治療控制的用途,其包括在所述妊娠對象中確定PlGF?2的水平。DSM ACC322220131121DSM ACC322120131121
【專利說明】
用于選擇性確定胎盤生長因子2的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于臨床診斷領(lǐng)域。特別地,本發(fā)明涉及在從患者之體液獲得的樣品中確 定胎盤生長因子2(Placental Growth Factor 2,PIGF_2)或其片段的水平。
【背景技術(shù)】
[0002] 全世界每年有至少1.3億女性分娩。其中,約15%經(jīng)歷妊娠相關(guān)的并發(fā)癥或疾病。 例如,先兆子癇發(fā)生于多至5%的所有妊娠者、10%的首次妊娠者以及20%至25%具有慢性 高血壓病史的女性中。妊娠期高血壓病可導(dǎo)致母體和胎兒發(fā)病率,并且其仍然是母體死亡 率的主要原因。
[0003] 在很多國家,用于確定產(chǎn)前并發(fā)癥和/或胎兒異常之風(fēng)險的篩選方法已變得常規(guī) 以幫助治療和建議妊娠女性。例如,在歐洲,醫(yī)護人員通常使用母體血液中存在的生化標(biāo)志 物來篩選胎兒中的染色體異常。已證明,母體年齡、血清學(xué)標(biāo)志物妊娠相關(guān)的血漿蛋白A (pregnancy associated plasma potein A,PAPP_A)和游離0人絨毛膜促性腺激素(free-beta human chorionic gonadotropin,0_hCG)以及超聲標(biāo)志物(ultrasound marker)頸半 透明度(nuchal translucency,NT)厚度的組合在第11至13周內(nèi)起作用,其中對唐氏綜合征 (Down syndrome)的檢測率為約82%至90%,假陽性率為5% (Malone等2005 .NEJM353( 19): 2001-2010;Bindra等2002.Ultrasound Obstet Gynecol 20:219-225)。這樣的篩選有助于 鑒定具有足夠高風(fēng)險而證明有必要進行進一步的診斷測試的女性,所述測試可以是侵入性 的并且為胎兒帶來風(fēng)險。然而,這種篩選仍然不能檢測顯著數(shù)量的唐氏綜合征病例以及其 他受非整倍性(aneuploidy)影響的妊娠者,并且診斷仍有5%呈假陽性。
[0004] 目前,還沒有常規(guī)的篩選用于使用母體樣品來早期檢測先兆子癇。尋求可預(yù)測這 一危及生命之妊娠病癥的發(fā)生或有助于其檢測的非侵入性生物標(biāo)志物仍至關(guān)重要。如果可 更早檢測先兆子癇的發(fā)生,在很多情況下可獲得更佳的結(jié)果,包括嚴重程度降低以及甚至 復(fù)原。在妊娠期的早期或晚期階段,用于發(fā)展中先兆子癇或者評估先兆子癇存在的可靠風(fēng) 險評估方法將降低妊娠女性、嬰兒或二者之不利健康結(jié)果的可能性。
[0005] 多年來,基于在先兆子癇情況下已注意到的病理生理觀察結(jié)果,已對不同的生物 物理和生物化學(xué)標(biāo)志物進行了研究,例如胎盤功能障礙、廣泛性炎性應(yīng)答、內(nèi)皮功能障礙和 凝血系統(tǒng)活化(Grill等2009.Reproductive Biology and Endocrinology 7:70)。最廣泛 地用于預(yù)測先兆子癇的成像技術(shù)是子宮胎盤多普勒超聲。胎盤灌注受損可通過測量流量波 形比(flow waveform ratio)或者通過檢測子宮弓形血管的舒張期切跡(diastolic notching)來評估。然而,已表明,在低風(fēng)險和高風(fēng)險患者組兩者中,預(yù)測值均并未足夠高以 建議常規(guī)篩選(Conde-Agudelo等2004? Obstet Gynecol 104: 1367-1391) 〇
[0006] 目如,認為母體樣品中存在的很多生物標(biāo)志物與先兆子瘤有關(guān)。這些潛在的標(biāo)志 物包括血管發(fā)生因子(例如,胎盤生長因子(PIGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、可溶性fms-樣酪氨酸激酶_l(soluble fms-like tyrosine kinase-1,sFlt-1 ))、可溶性內(nèi)皮糖蛋白(soluble endoglin,sEng)、P_選擇蛋 白、無細胞胎兒DNA(cell_freefetal DNA)、ADAM 12、胎盤蛋白 13(placental protein 13, PP-13)、正五聚蛋白3(Pentraxin 3,PTX3)和妊娠相關(guān)的血漿蛋白A(PAPP-A) (Grill等 2009 . Reproductive Biology and Endocrinology? : 70) 〇 目前,提出將月臺盤生長因子 (PIGF)用于評估妊娠女性發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險(Akolekar等2008 . Ultrasound Obstet Gynecol 32:732-739)。盡管PIGF作為先兆子癇的可靠標(biāo)志物已得到一定程度的認可,但是 期望具有以更高特異性、靈敏度和預(yù)測力為特征的作為替代和另外的標(biāo)志物。
[0007] 因此,需要用于產(chǎn)前并發(fā)癥和/或胎兒異常的精確篩選方法。
[0008] 胎盤生長因子(PIGF)(與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)同源的血管發(fā)生糖蛋白)由于 PIGF初級轉(zhuǎn)錄物的選擇性mRNA剪接而在人中以至少4種同工型存在(De Falco,2012.Exp Mol Med44:l-9)。這些同工型命名為?16?-1、?16?-2、?16?-3和?16?-4。術(shù)語叩16?"在不同 同工型之間并無區(qū)別。四種同工型之間的主要差異為:PIGF-1和3是非肝素結(jié)合的并且可潛 在地以旁分泌方式影響靶標(biāo),而PIGF-2和4具有額外的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且最可能以自分 泌方式工作。認為主要的同工型是PIGF-1和PIGFIWIGF-KSEQ ID N0:2)包含131個氨基 酸(Mff=單體14.7kDa,二聚體SgjkDahPIGFKSEQ ID勵:3)包含?16?-1序列并且額外含 有21個氨基酸的肝素結(jié)合位點插入片段(MW =單體17.3kDa,二聚體34.6kDa)。因此,全長 PIGF-2蛋白的長度為152個氨基酸。PIGF-3(SEQ ID N0:4)包含PIGF-1并且在C-末端附近包 含72個氨基酸的插入片段(MW=單體22.8kDa,二聚體45.6kDa)。因此,全長PIGF-3蛋白的長 度為203個氨基酸。PIGF-4(SEQ ID N0:5)包含PIGF-3和21個氨基酸的肝素結(jié)合位點插入片 段(MW=單體26.2kDa,二聚體52.4kDa)。因此,全長PIGF-4蛋白的長度為224個氨基酸。
[0009] PIGF在多種生理和病理條件下是血管發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。不同PIGF同工型調(diào)節(jié)血 管形成的確切分子機制尚未完全了解(Fischer等2008.Nat Rev Cancer 8:942-956)。已報 道,由不同PIGF形式誘導(dǎo)的血管發(fā)生響應(yīng)是有區(qū)別的(Hoffmann等2013. J Biol Chem 288: 17976-17989)。已證明,PIGF-2而非PIGF-1通過肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與肝素特異性結(jié)合,并且這 一相互作用對于細胞迀移、血管生長和血管出芽(vascular sprouting)而言至關(guān)重要。
[0010] 在妊娠期,PIGF參與胎盤發(fā)育,并且數(shù)項研究已報道在具有胎兒21三體(唐氏綜合 征)、18三體(愛德華茲綜合征(Edwards Syndrome))和13三體(帕陶綜合征(Patau Syndrom))的妊娠者中,在隨后發(fā)生先兆子癇的妊娠者中并且在分娩小于胎齡的(small for gestational age,SGA)新生兒的妊娠者中,母體血清PIGF濃度在妊娠的11+Q至13+6周 降低(Levine等2004? NEJM 350:672-683;Zarasoza等2009? Ultrasound Obstet Gynecol 33:382_386;Pandya等2012.Fetal Diagn Ther 31:87~93;Akolekar^2008.Ultrasound Obstet Gynecol 32:732-739;Poon等2008.Prenat Diagn 28:1110-1115)。在所有這些研 究中,主要測量的同工型為PIGF-1。關(guān)于正常或病理性妊娠者中PIGF-2的母體血清濃度,仍 沒有研究報道。對于人血液中循環(huán)PIGF-2同工型的絕對濃度及其用于在妊娠女性中診斷胎 兒非整倍性、先兆子癇和SGA的相關(guān)性,仍一無所知。W0 2010/059952A1報道,相對于對照樣 品,在先兆子癇患者的樣品中PIGF-2的水平提高。
[0011]本發(fā)明人已出人意料地發(fā)現(xiàn),在具有產(chǎn)前病癥之對象的樣品中PIGF-2的水平降 低。他們已發(fā)現(xiàn),在來自妊娠女性的體液樣品中測量特異性PIGF-2同工型(PIGF-2)的水平 可用于確定妊娠女性發(fā)生先兆子癇,懷有具有胎兒非整倍性的胎兒和/或小于胎齡的胎兒 ("小于胎齡兒"(SGA))的風(fēng)險是否提高。
[0012]在規(guī)范PIGF前體序列SEQ ID NO:l(UniProfKB/Swiss-Prot登錄號P49763)中,1 至 18位氨基酸代表信號序列,132至203位氨基酸代表功能未知的結(jié)構(gòu)域,并且在該前體中, 214至234位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PIGF-1的氨基酸序列由SEQ ID N0: 2表示。在 PIGF-2(SEQ ID N0:3)中,124至144位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:6)。在PLGF-3(SEQ ID N0:4)中,114至185位氨基酸代表功能未知的結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:7),在此將其稱 為"環(huán)3"。在PIGF-4(SEQ ID N0:5)中,114至185位氨基酸代表環(huán)3并且196至216位氨基酸代 表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在下文,給出了PIGF家族的氨基酸序列及相關(guān)氨基酸序列;在前體中,1 至18位氨基酸代表信號序列(以下劃線標(biāo)出);前體中的214至234位氨基酸、PIGF-2中的124 至144位氨基酸和PIGF-4中的196至216位氨基酸代表肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(斜體);前體中的132 至203位氨基酸、PLGF-3中的114至185位氨基酸和PIGF-4中的114至185位氨基酸代表功能 未知的結(jié)構(gòu)域(粗體)。
[0013] PLGF(PGF)同工型的前體(規(guī)范序列)(SEQ ID N0:1;登錄號P49763):
【發(fā)明內(nèi)容】
[0028] 本發(fā)明涉及用于在妊娠雌性對象或所述對象的未出生胎兒中對產(chǎn)前病癥或狀況 進行診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、風(fēng)險分級和/或治療控制的方法,其包括:
[0029] (i)在來自所述對象的樣品中確定胎盤生長因子2(PIGF_2)的水平,
[0030] (ii)將所述樣品中所測定的水平與由無產(chǎn)前病癥或狀況之對象獲得的對照水平 進行比較;
[0031] 其中與對照水平相比,來自所述對象之樣品中的水平降低指示產(chǎn)前病癥或狀況 和/或所述對象或胎兒獲得產(chǎn)前病癥或狀況的風(fēng)險提高和/或產(chǎn)前病癥或狀況加重的風(fēng)險 提尚。
[0032] 本發(fā)明還涉及用于在妊娠雌性對象或所述對象的未出生胎兒中診斷產(chǎn)前病癥或 狀況的方法,其中在來自待診斷對象的樣品中確定胎盤生長因子2(PIGF_2)的水平,并且其 中卩16卩-2的水平低于0.90、0.85、0.80、0.75或0.70"中位數(shù)倍數(shù)"(111111^口16(^讓6 median,MoM)指示產(chǎn)前病癥或狀況。
[0033]此外,本發(fā)明涉及用于檢測胎盤生長因子2(PIGF_2)的免疫測定方法,其包括以下 步驟:
[0034] (a)在以下條件下使懷疑含有PIGF-2的樣品與PIGF特異性的第一抗體或者其抗原 結(jié)合片段或衍生物接觸并且與PIGF-2特異性的第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物接 觸,所述條件允許在PIGF-2和這兩種抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物之間形成三元復(fù)合 物,以及
[0035] (b)檢測這兩種抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物與PIGF-2的結(jié)合。
[0036] 本發(fā)明的免疫測定方法可用于本發(fā)明之診斷方法的情形。本發(fā)明還涉及用于本發(fā) 明方法的抗體和試劑盒。
【附圖說明】
[0037] 圖1示出了單克隆PIGF-2抗體477/E5和477/G2的劑量響應(yīng)曲線。
[0038]圖2示出了實施例2和3之使用時間分辨放大穴狀化合物發(fā)射(Time Resolved Amplified Cryptate Emission,TRACE)技術(shù)的PIGF-2均相夾心焚光免疫測定(homogenous sandwich fiuoroimmunoassay)的齊lj量口向應(yīng)曲線。
[0039] 圖3:PIGF-1和PIGF-2的劑量響應(yīng)曲線示出針對PIGF-2的特異性測定對于PIGF-1 同工型沒有交叉反應(yīng)性(實施例4)。
[0040] 圖4:在對應(yīng)于肝素結(jié)合位點之21-aa肽存在或不存在下的PIGF-2濃度的確定。當(dāng) 在測定中添加特異性肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽時,對信號沒有抑制,因此單克隆抗體477/G2不識 別對應(yīng)于SEQ ID從):6的線性21&3肽。
[0041] 發(fā)明詳述
[0042] 本發(fā)明提供了用于對產(chǎn)前病癥或狀況進行診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估和/或治療控制的 方法。所述產(chǎn)前病癥或狀況可以是母體病癥或狀況或者胎兒病癥或狀況。所述方法基于特 異性地檢測母體樣品中PIG F同工型2 (PIG F - 2)的水平,即在妊娠雌性對象的樣品中確定 PIGF-2水平。PIGF-2水平相對于對照組降低指示產(chǎn)前病癥或狀況。因此,本發(fā)明的診斷方法 可用于在妊娠雌性對象中或者在其未出生的胎兒中對產(chǎn)前病癥或狀況進行診斷、預(yù)后、風(fēng) 險評估、風(fēng)險分級和/或治療控制。
[0043] 因此,在一個方面,本發(fā)明涉及用于在妊娠雌性對象或所述對象的未出生胎兒中 對產(chǎn)前病癥或狀況進行診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、風(fēng)險分級和/或治療控制的方法,其包括:
[0044] (i)在來自所述對象的樣品中確定胎盤生長因子2(PIGF_2)的水平,
[0045] (ii)將所述樣品中所測定的水平與由無產(chǎn)前病癥或狀況之對象獲得的對照水平 進行比較;
[0046] 其中與對照水平相比,來自所述對象之樣品中的水平降低指示產(chǎn)前病癥或狀況 和/或所述對象或胎兒獲得產(chǎn)前病癥或狀況的風(fēng)險提高和/或產(chǎn)前病癥或狀況加重的風(fēng)險 提尚。
[0047] 本發(fā)明還涉及用于在妊娠雌性對象或所述對象的未出生胎兒中診斷產(chǎn)前病癥或 狀況的方法,其中在來自待診斷對象的樣品中確定胎盤生長因子2(PIGF_2)的水平,并且其 中PIGF-2的水平低于對照組之0.90、0.85、0.80、0.75或0.70"中位數(shù)倍數(shù)"(MoM)指示產(chǎn)前 病癥或狀況。中位數(shù)倍數(shù)(MoM)是單獨測試結(jié)果偏離對照組之中位數(shù)的程度的量度。MoM通 常用于報道醫(yī)學(xué)篩選測試的結(jié)果,特別是當(dāng)單獨測試的結(jié)果高度可變時。產(chǎn)前篩選分析物 的濃度在整個妊娠期間不斷改變。例如,母體血清中的AFP濃度在用于檢測開放性神經(jīng)管缺 陷的最有利時間期間(妊娠第15至20周)每周提高約15%。將這些數(shù)值轉(zhuǎn)化為胎齡特異性的 中值(MoM)使這一胎齡效應(yīng)歸一化。因此,實驗室可首先從例如300至500位女性常規(guī)獲得的 血清獲得測量值。測量結(jié)果初始以質(zhì)量單位(例如,ng/ml)或國際單位(例如,IU/ml)表示。 使用加權(quán)對數(shù)線性回歸分析(weighted log-linear regression analysis)來計算方程以 確定所討論分析物在每個妊娠周的中位數(shù)水平。然后,將每位女性的測量結(jié)果除以合適胎 齡的中值,得到中位數(shù)倍數(shù)(MoM)。根據(jù)定義,女性群體中的整體中值為1 .OOMoM。"中位數(shù)倍 數(shù)"指應(yīng)用于中值的因子,例如0.90意指中值的90%。優(yōu)選的MoM值為0.85、0.80或0.75,更 優(yōu)選的為〇. 80和0.75,并且最優(yōu)選的為0.75。合適的閾值可例如由下表2得出。在下文,將對 示例性的閾值進行討論。然而,基于期望的特異性和/或靈敏度或者對照組,還可使用其他 閾值。例如,低于122.3pg/ml(對應(yīng)于0.83的MoM)的值可指示先兆子癇。低于128.7pg/ml (對 應(yīng)于0.75的MoM)的值可指示小于胎齡兒。用于13三體、18三體和21三體的合適閾值分別為 例如 125pg/ml (對應(yīng)于0 ? 75 的MoM)、113pg/ml (對應(yīng)于0 ? 81 的MoM)和99 ? 6pg/ml (對應(yīng)于0 ? 76 的MoM)。
[0048] 作為替代地,可使用新開發(fā)的"極端度"(degree of extremeness,DoE)代替MoM用 于血液來源的標(biāo)志物的風(fēng)險計算(Merz 2007.Ultraschall in Med 28:270-272;Schmidt 等2007.Frauenarzt 48:1089-1092) PDoE是中值和實際值之間的距離與中值和第五百分位 數(shù)之間的距離(當(dāng)測量指低于中位數(shù)時)或中位數(shù)與第95百分位數(shù)之間的距離(當(dāng)測量值高 于中位數(shù)時)的比(Merz 2007 .Ultraschall in Med28:270-272 ;Merz等2007 .Ultrasound Obstet Gynecol30:542-543)。在該假設(shè)下,在中值時DoE為0,在第95百分位數(shù)時DoE為1.0, 并且在第5百分位數(shù)時DoE為-1 .0。另外,可使用貝葉斯定理(Bayesian theorem) (Schetinin等2007 ? IEEE Trans Inf Technol Biomed 11: 312-319)代替Palomaki和 Haddow的序貫似然比(sequential likelihood ratio)的數(shù)學(xué)概念(Palomaki和Haddow 1987.Am J Obstet Gynecol 156:460-463)〇
[0049] 所述產(chǎn)前病癥或狀況可以是妊娠雌性對象或該對象的未出生胎兒的病癥或狀況。 例如,所述產(chǎn)前病癥或狀況可以是妊娠雌性對象中的先兆子癇。所述產(chǎn)前病癥或狀況還可 涉及不利的妊娠結(jié)果,例如雌性對象分娩"小于胎齡兒"或具有異常(例如非整倍性)的孩子 的風(fēng)險。因此,胎兒的產(chǎn)前病癥或狀況可以是例如"小于胎齡兒"或非整倍性。
[0050] 在另一方面,本發(fā)明涉及用于檢測PIGF-2的免疫測定方法,其可用于本發(fā)明的診 斷方法的情形。所述免疫測定方法基于使用PIGF-2特異性的抗體(優(yōu)選單克隆抗體)檢測 PIGF-2,即該抗體優(yōu)選地不與其他抗原,特別是PIGF-2的其他同工型交叉反應(yīng)。在該免疫測 定中,可使用兩種抗體的組合,例如以夾心形式(參見下文),其中至少一種抗體對PIGF-2具 有特異性。例如,第一抗體對PIGF具有特異性(不一定對同工型2具有特異性但是在任何情 況下均能夠與PIGF-2結(jié)合),而第二抗體對PIGF-2具有特異性。因此,本發(fā)明涉及用于檢測 胎盤生長因子2(PIGF-2)的免疫測定方法,其包括以下步驟:
[00511 (a)在以下條件下使懷疑含有PIGF-2的樣品與PIGF特異性的第一抗體或者其抗原 結(jié)合片段或衍生物接觸并且與PIGF-2特異性的第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物接 觸,所述條件允許在PIGF-2和這兩種抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物之間形成三元復(fù)合 物,以及
[0052] (b)檢測這兩種抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物與PIGF-2的結(jié)合。
[0053] 在下文,除非另外說明,否則術(shù)語"抗體"還包括抗原結(jié)合片段或衍生物。第一抗體 可以是PIGF特異性的任何抗體,只要其檢測PIGF-2即可。這樣的抗體可商購獲得。例如,第 一抗體可以是針對人PIGF的多克隆抗體。這樣的抗體可從例如R&D Systems Europe Ltd. (參考號:AF-264-PB)購買。
[0054] 在根據(jù)本發(fā)明的免疫測定方法中,所述第二抗體可對PIGF-2序列(SEQ ID N0:3) 中,優(yōu)選肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:6)中的表位具有特異性。然而,優(yōu)選地第二抗體針對 其他PIGF同工型中不存在的PIGF-2的構(gòu)象表位。第二抗體優(yōu)選地是單克隆抗體。
[0055] 如下文將更詳細討論的,本文中所述的免疫測定方法的(第一和/或第二)抗體或 者其抗原結(jié)合片段或衍生物可以是例如多克隆抗體、單克隆抗體或遺傳工程化單克隆抗 體。
[0056] 優(yōu)選地在本文中,所述第一和第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物對PIGF-2的 非重疊的不同構(gòu)象表位具有特異性。
[0057]第一抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物可例如對SEQ ID NO: 1的序列內(nèi)包含的表 位具有特異性。
[0058]第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物可例如通過選自以下的雜交瘤細胞系產(chǎn) 生:于2013年11月21日以DSM ACC3222保藏在德國微生物菌種保藏中心Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ; Inhoffenstr ? 7B,Braunschweig,Germany)的細胞系 477/G2,和于 2013年11 月 21 日以 DSM ACC3221保藏在DSMZ的細胞系477/E5,優(yōu)選地在本文中第二抗體通過以DSM ACC3222保藏的 雜交瘤細胞系477/G2產(chǎn)生。
[0059] 優(yōu)選地在本文中,第一抗體是多克隆的抗PIGF抗體,例如由R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK以參考號:AF-264-ro提供的可商購抗體。在一個具體實施方案中,第一抗 體是多克隆的抗PIGF抗體,例如由R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK以參考號:AF- 264-ro提供的可商購抗體,而第二抗體是通過以DSM ACC3222保藏的雜交瘤細胞系477/G2 產(chǎn)生的抗體。
[0060]抗體與PIGF-2的結(jié)合發(fā)生于合適的條件下(即,允許免疫反應(yīng),即抗體與PIGF-2結(jié) 合形成免疫復(fù)合物)。這樣的條件是技術(shù)人員已知的并且可使用例如如下文所述的免疫測 定的標(biāo)準(zhǔn)形式。這樣的條件將優(yōu)選地處于生理溫度、pH和離子強度之下,并且可發(fā)生于介質(zhì) 例如,如磷酸緩沖鹽水(PBS)中。
[0061 ]優(yōu)選的檢測方法包括多種形式的免疫測定,例如,如放射免疫測定 (rad io immunoassay,RIA)、化學(xué)發(fā)光-和焚光-免疫測定、酶免疫測定(enzyme immunoassay,EIA)、酉每耳關(guān)免疫測定(Enzyme-1 inked immunoassay,ELISA)、基于Luminex的 珠陣列、蛋白質(zhì)微陣列測定、快速測試形式(例如,如免疫層析條測試)、和選擇/多重反應(yīng)監(jiān) 測(Selected/Multiple reaction monitoring,SRM/MRM)〇
[0062]所述測定可以是均相或異相測定、競爭性或非競爭性測定。在一個特別優(yōu)選的實 施方案中,所述測定是夾心測定的形式,其是一種非競爭性免疫測定,其中待檢測和/或量 化的分子與第一抗體結(jié)合并且與第二抗體結(jié)合。第一抗體可結(jié)合于固相,例如珠,孔或其他 容器的表面,芯片或條,而第二抗體是例如經(jīng)染料、放射性同位素或者反應(yīng)性或催化活性部 分標(biāo)記的抗體。然后,通過合適的方法測量與分析物結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記抗體的量。有關(guān)"夾心測 定"的一般性組合物和程序是公認的并且為技術(shù)人員所知Immunoassay Handbook Ed.David WilcUElsevier LTD,0xford;第3版(2005年5月),ISBN-13:978-0080445267; Hultschis C等,Curr Opin Chem Biol ? 2006年2月;10(1) :4_10 .PMID: 16376134,其通過引 用并入本文)。
[0063] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中,所述測定包含兩種捕獲分子,優(yōu)選抗體,這二者在 液體反應(yīng)混合物中均作為分散體存在,其中第一標(biāo)記組分與第一捕獲分子連接,其中所述 第一標(biāo)記組分是基于熒光-或者化學(xué)發(fā)光-猝滅或放大的標(biāo)記系統(tǒng)的一部分,所述標(biāo)記系統(tǒng) 的第二標(biāo)記組分與第二捕獲分子連接,以使得在這兩種捕獲分子與分析物結(jié)合之后,產(chǎn)生 可測量的信號,這允許在包含樣品的溶液中檢測所形成的夾心復(fù)合物。
[0064] 甚至更優(yōu)選地,所述標(biāo)記系統(tǒng)包含與熒光或化學(xué)發(fā)光染料特別是花菁型染料組合 的稀土穴狀化合物(cryptate)或稀土螯合物。
[0065] 在本發(fā)明的情形下,基于熒光的測定包括使用染料,其可例如選自包括以下的組: FAM(5-或6-羧基熒光素)、¥1(:、呢0、熒光素、異硫氰酸熒光素$11'〇、11^-700/800、花菁染 料(例如,CY3、CY5、CY3 ? 5、CY5 ? 5、Cy7)、Xanthen、6-羧基-2 ',4 ',7 ',4,7-六氯熒光素(HEX)、 TET、6-羧基-4',5'_二氯-2',7'_二甲氧基熒光素(J0E)、N,N,N',N'_四甲基-6-羧基羅丹明 (TAMRA)、6_羧基-X-羅丹明(R0X)、5_羧基羅丹明-6G(R6G5)、6_羧基羅丹明-6G(RG6)、羅丹 明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、B0DIPY染料(例如,B0DIPY TMR)、俄勒岡綠(Oregon Green)、香豆素類(例如,傘形酮)、苯甲亞胺(Benzimide)(例如Hoechst 33258);菲啶類,例 如德克薩斯紅、Yakima Ye 1 low、A1 exa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶染料、咔唑染料、吩_惡嗪 染料、撲啉染料、聚甲炔染料,等。
[0066] 在本發(fā)明的情形下,基于化學(xué)發(fā)光的測定包括基于Kirk-〇thmer,Encyclopedia of chemical technology,第4版,執(zhí)行編輯,J? I .Kroschwitz ;編輯,M.Howe-Grant,John Wiley&S〇ns,1993,第15卷,第518-562頁中針對化學(xué)發(fā)光材料所述的物理原理來使用染料, 其包括第551至562頁的引用內(nèi)容在內(nèi)通過引用并入本文。優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光染料是吖啶酯 類(^16?-2可例如使用全自動化夾心免疫測定系統(tǒng)在8.1?.4.^.3 10^?1'01?緊湊型?0^設(shè) 備(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH,Hennigsdorf/Berlin,Germany)上進行檢測。 這種隨機存取分析儀采用基于兩種熒光團之間的非放射性迀移的靈敏性時間分辨放大穴 狀化合物發(fā)射(TRACE)技術(shù)。
[0067] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中,一種抗體(例如,第一抗體)是經(jīng)標(biāo)記的,而另一 種抗體(例如,第二抗體)與固相結(jié)合或者可選擇性地與固相結(jié)合。然而,如上所述,優(yōu)選地 在本發(fā)明方法的背景下,第一和第二抗體以分散于液體反應(yīng)混合物中的方式存在,并且其 中第一標(biāo)記組分與第一抗體結(jié)合,所述第一標(biāo)記組分是基于熒光或者化學(xué)發(fā)光消失或放大 的標(biāo)記系統(tǒng)的一部分,并且所述標(biāo)記系統(tǒng)的第二標(biāo)記組分與第二抗體結(jié)合,以使得在這兩 種抗體與待檢測的PIGF-2結(jié)合之后,產(chǎn)生允許在測量溶液中檢測所得夾心復(fù)合物的可測量 信號。
[0068] 本文中提及的"測定"或"診斷測定"可以是應(yīng)用于診斷領(lǐng)域中的任何類型。這樣的 測定可基于待檢測分析物以一定親和力與一種或更多種捕獲探針結(jié)合??紤]到捕獲分子與 靶分子或目標(biāo)分子之間的相互作用,親和常數(shù)優(yōu)選地大于。
[0069]測定的"靈敏度"涉及本身正確鑒定的真實陽性的比例,即鑒定陽性結(jié)果的能力 (真陽性陽性結(jié)果/陽性數(shù))。因此,用測定可檢測的分析物的濃度越低,該測定的靈敏度越 高。測定的"特異性"涉及本身正確鑒定的陰性的比例,即鑒定陰性結(jié)果的能力(真陰性/陰 性結(jié)果)。對于抗體而言,"特異性"定義為單個抗原結(jié)合位點與僅一種抗原表位反應(yīng)的能 力??贵w的結(jié)合特性還可在其"親和力(affinity)"及其"親合力(avidity)"方面進行表征。 抗體的"親和力"是單一抗原表位和單個抗原結(jié)合位點之間的反應(yīng)強度的量度。抗體的"親 合力"是具有很多表位的抗原和多價抗體之間的整體結(jié)合強度的量度。
[0070] 診斷和/或預(yù)后測試的靈敏度和特異性不僅僅取決于該測試的分析"質(zhì)量",而且 其還取決于什么構(gòu)成了異常結(jié)果的限定。實際上,接受者操作特征曲線(Receiver Operating Characteristic curve,R0C曲線)通常通過繪制"正常"(即,不具有產(chǎn)前病癥或 狀況的明顯健康個體)和"患病"群體中變量值相對其相對頻率來計算。對于任何具體的標(biāo) 志物而言,患有疾病和未患疾病之對象的標(biāo)志物水平的分布將可能重疊。在這樣的條件下, 測試并非絕對100%準(zhǔn)確地使正常與患病區(qū)別開,并且重疊區(qū)域指示該測試不能區(qū)別正常 與患病的區(qū)域。選擇這樣的閾值,低于該閾值時認為測試異常而高于該閾值時認為測試正 常。R0C曲線下面積是所認為測量將允許正確鑒定狀況的概率的量度。甚至在測試結(jié)果不一 定給出準(zhǔn)確數(shù)時也可使用R0C曲線。只要可對結(jié)果進行排序,就可以生成R0C曲線。例如,可 根據(jù)程度對"患病"樣品的測試結(jié)果進行排序(例如,例如1 =低、2 =正常和3 =高)。這一排 序可與"正常"群體中的結(jié)果相關(guān)聯(lián),并且生成R0C曲線。這些方法是本領(lǐng)域中公知的。參見, 例如,Hanley等1982.Radiology 143:29-36。優(yōu)選地,選擇提供以下ROC曲線面積的閾值:大 于約0.5、更優(yōu)選大于約0.7、仍更優(yōu)選大于約0.8、甚至更優(yōu)選大于約0.85并且最優(yōu)選大于 約0.9。在這一情形下,術(shù)語"約"指給定測量結(jié)果的+/-5%。
[0071] R0C曲線的橫軸代表(1-特異性),其隨假陽性的比率而增加。該曲線的縱軸代表靈 敏度,其隨真陽性的比率而增加。因此,對于選定的具體截止值而言,可確定(1-特異性)的 值,并且可獲得對應(yīng)的靈敏度。R0C曲線下面積是所測量標(biāo)志物水平將允許正確地鑒定疾病 或狀況的概率的量度。因此,ROC曲線下面積可用于確定測試的有效性。
[0072] 在另一些實施方案中,使用陽性似然比(positive likelihood ratio)、陰性似然 比(negative likelihood ratio)、比值比(odds ratio)或風(fēng)險比(hazard ratio)作為測 試預(yù)測風(fēng)險或者診斷病癥或狀況("患病組")的能力的量度。在陽性似然比的情況下,1的值 指示陽性結(jié)果在"患病"和"對照"兩組中的對象之間同等可能;大于1的值指示陽性結(jié)果更 可能在患病組中;并且小于1的值指示陽性結(jié)果更可能在對照組中。在陰性似然比的情況 下,1的值指示陰性結(jié)果在"患病"和"對照"兩組中的對象之間同等可能;大于1的值指示陰 性結(jié)果更可能在測試組中;并且小于1的值指示陽性結(jié)果更可能在對照組中。
[0073] 在比值比的情況下,1的值指示陽性結(jié)果在"患病"和"對照"兩組中的對象之間同 等可能;大于1的值指示陽性結(jié)果更可能在患病組中;并且小于1的值指示陽性結(jié)果更可能 在對照組中。
[0074] 在風(fēng)險比的情況下,1的值指示終點(例如,死亡)的相對風(fēng)險在"患病"和"對照"兩 組中相等;大于1的值指示患病組中的風(fēng)險更大;并且小于1的值指示對照組中的風(fēng)險更大。
[0075] 技術(shù)人員將了解,將診斷或預(yù)后指標(biāo)與診斷或未來臨床結(jié)果的預(yù)后風(fēng)險聯(lián)系起來 是一種統(tǒng)計學(xué)分析。例如,如通過統(tǒng)計學(xué)顯著性水平所確定的,與水平大于或等于X的患者 相比,低于X的標(biāo)志物水平可預(yù)示患者更可能遭受不良結(jié)果。另外地,標(biāo)志物濃度相對于基 線水平的變化可反映患者的預(yù)后,并且標(biāo)志物水平的變化程度可與不良事件的嚴重程度相 關(guān)。通常通過比較兩個或更多個群體并確定置信區(qū)間和/或P值來確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。參見, 例如,Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983〇 本發(fā)明的優(yōu)選置信區(qū)間為90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%和99.99%,而優(yōu) 選的 P值為0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
[0076] 術(shù)語"抗體" 一般包括單克隆抗體和多克隆抗體及其結(jié)合片段(特別是Fc片段)以 及所謂的"單鏈抗體" (Bird R.E?第(1988)SCienCe242:423-6)、嵌合抗體、人源化抗體(特 別是C D R接枝抗體),和二抗體或四抗體(Ho 1 1 i s e r P ?等(1 9 9 3 ) Proc.Natl. Acad. Sci.U.S. A. 90:6444-8)。還包括通過技術(shù)(包括例如噬菌體展示)選擇的 與樣品中包含的目標(biāo)分子特異性結(jié)合的免疫球蛋白樣蛋白。在這一情形下,術(shù)語"特異性結(jié) 合"指針對目標(biāo)分子或其片段而產(chǎn)生的抗體。如果抗體對目標(biāo)分子或其前述片段的親和力 至少優(yōu)選地50倍、更優(yōu)選地100倍、最優(yōu)選地至少1000倍高于對包含該目標(biāo)分子之樣品中含 有的其他分子的親和力,則認為該抗體是特異性的。如何制備抗體并選擇具有給定特異性 的抗體在本領(lǐng)域中是公知的。如上文所述,優(yōu)選的是單克隆抗體。
[0077] 本發(fā)明還涉及通過選自以下的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的單克隆抗體:以DSM ACC3222 保藏的細胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的細胞系477/E5。本發(fā)明還涉及與通過選自以 下之雜交瘤細胞系產(chǎn)生的抗體結(jié)合相同表位的抗體:以DSM ACC3222保藏的細胞系477/G2 和以DSM ACC3221保藏的細胞系477/E5。
[0078]本發(fā)明還涉及用于檢測PIGF-2的試劑盒,其包含:
[0079] (i)對PIGF具有特異性的第一抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物;和
[0080] (ii)對PIGF-2具有特異性的第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物。
[00811例如,(i)第一抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物對SEQ ID N0:1序列內(nèi)包含的表 位具有特異性;和/或(i i)第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物對PIGF-2的結(jié)構(gòu)表位具 有特異性。優(yōu)選地,所述試劑盒的第一抗體是多克隆抗PIGF抗體,例如由R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK以參考號:AF-264-PB提供的可商購抗體。在所述試劑盒的一個具 體實施方案中,第一抗體是多克隆抗PIGF抗體,例如由R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK以參考號:AF-264-PB提供的可商購抗體,而第二抗體是通過以DSMACC3222保藏的雜交瘤 細胞系477/G2產(chǎn)生的抗體。
[0082]在所述試劑盒的一個實施方案中,第二抗體是通過選自以下的雜交瘤細胞系產(chǎn)生 的單克隆抗體:以DSM ACC3222保藏的細胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏的細胞系477/ E5,優(yōu)選是通過選自以DSM ACC3222保藏之細胞系477/G2的雜交瘤細胞系產(chǎn)生的單克隆抗 體。
[0083]本發(fā)明還提供了雜交瘤細胞系,其選自以DSMACC3222保藏的細胞系477/G2和以 DSM ACC3221保藏的細胞系477/E5。
[0084] 本發(fā)明例如還涉及根據(jù)本發(fā)明的試劑盒在夾心免疫測定形式中的用途,所述夾心 免疫測定形式用于在來自體液的生物樣品中檢測和/或量化PIGF-2或其片段。這樣的片段 至少包含跨越所述兩種抗體所針對的兩個表位的序列,例如,所述試劑盒可用于檢測和/或 量化總PIGF-2。
[0085] 術(shù)語"樣品"優(yōu)選是生物樣品。本文中使用的"樣品"可例如指出于對目標(biāo)對象(例 如患者)進行診斷、預(yù)后或評價的目的而獲得的體液或組織樣品。出于本發(fā)明的目的,"患 者"或"對象"包括人和其他動物(特別是哺乳動物)二者,以及其他生物體。因此,所述方法 適用于人診斷和獸醫(yī)應(yīng)用兩方面。在一個優(yōu)選實施方案中,所述患者是哺乳動物,在最優(yōu)選 的實施方案中,所述患者或?qū)ο笫侨恕?br>[0086] 優(yōu)選地在本文中,所述樣品是妊娠雌性對象的體液或組織樣品。優(yōu)選的是體液樣 品。優(yōu)選的測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿、唾液、痰和胸腔積液。另外,本領(lǐng)域技 術(shù)人員會意識到,一些測試樣品在分級或純化操作(例如將全血分離成血清或血漿組分)之 后將更容易進行分析。因此,在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,所述樣品選自包括以下的 組:血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿樣品或前述任意樣品的提取 物。優(yōu)選地,所述樣品是血液樣品,更優(yōu)選血清樣品或血漿樣品。在本發(fā)明的情形下,最優(yōu)選 的樣品是血清樣品。
[0087] 在本發(fā)明的情形下,"血衆(zhòng)"為在離心之后獲得的含抗凝劑血液的基本無細胞上清 液。示例性的抗凝劑包括鈣離子結(jié)合化合物(例如EDTA或檸檬酸鹽)和凝血酶抑制劑(例如 肝素鹽類或水蛭素)。無細胞血漿可通過在2000至3000g下離心抗凝化的血液(例如,檸檬酸 化、EDTA或肝素化血液)至少15分鐘獲得。
[0088] "血清"為在使血液凝結(jié)之后收集的全血的液體級分。當(dāng)離心凝固的血液(凝結(jié)的 血液)時,可以以上清液獲得血清。其不包含血纖維蛋白原,但是一些凝血因子保留下來。
[0089] 適當(dāng)時,需要在用于本發(fā)明之前均化樣品或者用溶劑萃取樣品以獲得液體樣品。 在此,液體樣品可以是溶液或混懸液??稍谟糜诒景l(fā)明之前對液體樣品進行一次或更多次 預(yù)處理。這樣的預(yù)處理包括但不限于稀釋、過濾、離心、濃縮、沉降、沉淀、透析。預(yù)處理還可 包括向溶液添加化學(xué)或生化物質(zhì),例如酸、堿、緩沖液、鹽、溶劑、反應(yīng)性染料、去污劑、乳化 劑、螯合劑。
[0090] 本發(fā)明的方法還涉及確定樣品中PIGF-2的水平以用于對醫(yī)學(xué)狀況進行診斷或預(yù) 后或風(fēng)險評估或篩選。
[0091]在本發(fā)明的另一個實施方案中,根據(jù)本發(fā)明的方法可用于檢測總PIGF-2以對產(chǎn)前 病癥進行診斷或預(yù)后或風(fēng)險評估或篩選,其包括以下步驟:
[0092] (i)提供對象的體液樣品,
[0093] (ii)確定所述對象樣品中PIGF-2的量,
[0094 ] (i i i)將PIGF- 2的量與參照樣品進行比較,其中相對于參照樣品的降低指示存在 產(chǎn)前病癥。
[0095] 因此,本發(fā)明的免疫測定、抗體或試劑盒可用于在對象中對病癥或狀況進行診斷、 預(yù)后、風(fēng)險評估、風(fēng)險分級和/或治療控制。
[0096] 在本發(fā)明的情形下,所述病癥或狀況優(yōu)選為妊娠雌性對象中或胎兒中的產(chǎn)前病癥 或狀況。在本發(fā)明的情形下,妊娠雌性對象中的產(chǎn)前病癥或狀況優(yōu)選地選自先兆子癇或分 娩具有非整倍性之孩子的風(fēng)險或分娩小于胎齡的新生兒的風(fēng)險。
[0097]在本發(fā)明的情形下,所述對象可處于妊娠首三個月、妊娠中三個月或妊娠末三個 月。優(yōu)選地,所述對象處于妊娠首三個月。然而,所述對象還可處于中三個月。所述對象還可 處于末三個月。特別地,在先兆子癇或小于胎齡兒的情況下,所述對象可處于妊娠首三個 月、妊娠中三個月或妊娠末三個月,優(yōu)選首三個月。
[0098]在本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法的情形下,除PLGF-2水平之外,還可確定其他的決定 參數(shù)。例如,可額外使用有關(guān)年齡、體重和/或體重指數(shù)(body mass index,BMI)的信息來進 行診斷。其他參數(shù)包括對象中存在或此前存在其他疾病或狀況。此外,可在該對象中(例如 用于本發(fā)明方法的同一樣品中)確定其他相關(guān)的生物標(biāo)志物。因此,在一些實施方案中,在 樣品中確定至少一個與診斷相關(guān)的其他參數(shù)。因此,PIGF-2可以是本發(fā)明的診斷和預(yù)后方 法中使用的標(biāo)志物組的一部分。例如,當(dāng)所述病癥或狀況是先兆子癇時,其他參數(shù)可以是選 自以下的一種或更多種:PAPP-A、超聲標(biāo)志物(搏動指數(shù)、舒張期切跡)、平均動脈壓、PIGF、 sFlt、母體病史(maternal history)、可溶性內(nèi)皮糖蛋白(sEng)、抑制素 A、激活素 A、血管內(nèi) 皮生長因子(VEGF)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)和無細胞胎兒DNA。例如,當(dāng)所述病癥或狀況 是非整倍性時,其他參數(shù)可以是選自以下的一種或更多種:PAPP-A、游離的PhCG、頸半透明 度、母體年齡、AFP、PIGF、胎兒鼻骨、雙頂徑/鼻骨比、hCG、抑制素 A、非綴合雌三醇3 (unconiugated estriol 3,uE3)和無細胞胎兒DNA。例如,當(dāng)所述病癥或狀況是"小于胎齡 兒"時,其他參數(shù)可以是選自以下的一種或更多種:PAPP-A、母體病史、 的此06、11〇6、抑制素4、激活素4、8£1^、恥骨聯(lián)合-宮底高度(8711^117818-;^11(^111618111:, SFH)、胎兒生物計量(股骨長度(femur length,F(xiàn)L)、頭圍(head circumference,HC)、雙頂 徑(biparietal diameter,BF*D)、腹圍(abdominal circumference,AC))和超聲標(biāo)志物(搏 動指數(shù)、臍動脈多普勒、大腦中動脈多普勒、靜脈導(dǎo)管多普勒)。對于區(qū)別診斷而言,除PIGF-2水平之外,還可使用其他標(biāo)志物和信息。
[0099]術(shù)語"生物標(biāo)志物"(生物學(xué)標(biāo)志物)指可測量和可量化的生物學(xué)參數(shù)(例如,特定 酶濃度、特定激素濃度、群體中的特定基因表型分布、生物物質(zhì)的存在),其充當(dāng)用于以下健 康和生理相關(guān)評估的指標(biāo),例如疾病風(fēng)險、精神障礙、環(huán)境暴露及其影響、疾病診斷、代謝過 程、物質(zhì)濫用、妊娠、細胞系發(fā)育、流行病學(xué)研究等。此外,生物標(biāo)志物定義為作為正常生物 過程、致病過程或針對治療介入之藥理學(xué)響應(yīng)的指標(biāo)客觀測量并且評價的特征??稍谏?樣品上測量生物標(biāo)志物(作為血液、尿或組織測試),生物標(biāo)志物可為從個人獲得的記錄(血 壓、ECG或Holter)或者生物標(biāo)志物可為成像測試(子宮胎盤多普勒超聲,或頸半透明度 (Conde-Agudelo等2004?Obstet Gynecol 104:1367-1391;Bindra等2002?Ultrasound Obstet Gynecol20:219-225))。生物標(biāo)志物可指示多種健康或疾病特征,包括暴露于環(huán)境 因素的水平或類型、遺傳易感性、針對暴露的遺傳響應(yīng)、亞臨床或臨床疾病的生物標(biāo)志物, 或治療響應(yīng)的指示。因此,考慮生物標(biāo)志物的簡單化方式是作為疾病特征(風(fēng)險因素或風(fēng)險 生物標(biāo)志物)、疾病狀態(tài)(臨床前或臨床)、或疾病速率(進程)的指標(biāo)。相應(yīng)地,可將生物標(biāo)志 物分類為前驅(qū)生物標(biāo)志物(鑒定發(fā)生疾病的風(fēng)險)、篩選性生物標(biāo)志物(篩選亞臨床疾?。?、 診斷性生物標(biāo)志物(識別明顯疾病)、分期性生物標(biāo)志物(對疾病嚴重程度進行分類)或預(yù)后 生物標(biāo)志物(預(yù)測未來疾病過程(包括復(fù)發(fā)和對治療的響應(yīng))和監(jiān)測治療的效力)。生物標(biāo)志 物還可充當(dāng)替代終點(surrogate end point)。替代終點是這樣的終點,其可替代真實目標(biāo) 結(jié)果的測量結(jié)果用作臨床試驗中的結(jié)果來評價治療的安全性和有效性?;驹硎翘娲K 點的改變密切追隨著目標(biāo)結(jié)果的變化。替代終點的優(yōu)勢在于:與需要大型臨床試驗進行評 價的終點例如發(fā)病率和死亡率相比,它們可在更短的時間段內(nèi)并且以更低的成本收集。替 代終點的另外價值包括以下事實:與較遠的臨床事件相比,其更接近目標(biāo)暴露/介入并且可 更易于因果相關(guān)。替代終點的重要劣勢是如果目標(biāo)臨床結(jié)果受多種因素(除替代終點之外) 的影響,則殘余混雜可降低替代終點的有效性。已提出,如果替代終點可解釋暴露或介入對 目標(biāo)結(jié)果的至少50%作用,則其具有較大的有效性。例如,生物標(biāo)志物可以是蛋白質(zhì)、肽或 核酸分子。
[0100] 在本發(fā)明的范圍內(nèi),產(chǎn)前病癥優(yōu)選地涉及先兆子癇、小于胎齡兒和非整倍性(包括 13三體、18三體和21三體)。
[0101] 在本發(fā)明的一個實施方案中,總PIGF-2的測量在首三個月(妊娠第1至13周)、中三 個月(妊娠第14至26周)或末三個月(妊娠第27至40周)內(nèi)進行。
[0102] 在本發(fā)明的范圍內(nèi),PIGF-2理解為意指根據(jù)SEQ ID N0:3的人PIGF-2。根據(jù)本發(fā)明 的這些多肽還可具有翻譯后修飾,例如糖基化(glycolization)、脂化或衍生化。
[0103]在本發(fā)明的范圍內(nèi),總PIGF-2理解為意指游離PIGF-2和結(jié)合成多聚復(fù)合物的 PIGF-2,其可包含例如均二聚體PIGF-2復(fù)合物和異二聚體PIGF-2/VEGF-A復(fù)合物。
[0104] 在本發(fā)明的另一個實施方案中,預(yù)后或風(fēng)險分級涉及先兆子癇的早期發(fā)作(妊娠 20至34周)或晚期發(fā)作(妊娠34周之后)。
[0105] 在本發(fā)明的另一個實施方案中,額外地確定選自以下的其他標(biāo)志物:sFlt-1、 PIGF、VEGF、PP-13、ADAM 12、P-選擇蛋白、無細胞胎兒0麻、卩丁父3、?厶?卩-厶、內(nèi)臟脂肪素 (visfatin)、抑制素 A、激活素 A、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、P-hCG、甲胎蛋白(AFP)、金屬蛋 白酶-9(MMP-9)、超聲標(biāo)志物(子宮動脈搏動指數(shù)和/或舒張期切跡)以及血壓。
[0106] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,所述其他標(biāo)志物選自包括以下的組:sFlt-1、 PIGF、PAPP-A、子宮動脈搏動指數(shù)和血壓。
[0107] 本文中使用的術(shù)語"對象"指活的人或非人雌性生物體。優(yōu)選地在本文中,所述對 象是處于首三個月至末三個月的妊娠人對象,優(yōu)選地其處于妊娠首三個月或中三個月,并 且更優(yōu)選地處于妊娠首三個月。例如,所述對象處于妊娠第11至13周。本文中的"胎兒"指在 胚胎期之后和出生之前的發(fā)育中哺乳動物。在人中,胎兒期開始于妊娠第9周初。
[0108] 本文中使用的術(shù)語"樣品"指上文所述的樣品。
[0109] 術(shù)語"參照樣品"指由未患疾病或病癥和未發(fā)生疾病或病癥的對象或?qū)ο蠼M獲得 的樣品。所述對象或?qū)ο蠼M表現(xiàn)與受試對象相同的性別和物種。"對照水平"由一份或更多 份"參照樣品"獲得并且優(yōu)選地由不具有產(chǎn)前病癥或狀況的對象獲得。在本文中,優(yōu)選地"對 照組"與所述對象來自相同的妊娠三月期,或者甚至來自相同胎齡(例如,就妊娠周而言)。 例如,當(dāng)所述對象處于妊娠第11至13周時,對照組也可來自妊娠第11至13周。
[0110] 在本發(fā)明的情形下,"診斷"涉及在對象中識別和(早期)檢測疾病或臨床狀況,并 且還可包括區(qū)別診斷。在某些實施方案中,術(shù)語"診斷"還可涵蓋評估疾病或臨床狀況的嚴 重程度。
[0111] "預(yù)后"涉及預(yù)測對象遭受特定疾病或臨床狀況的結(jié)果或特定風(fēng)險。這可包括估計 所述對象的恢復(fù)可能性或不利結(jié)果的可能性。
[0112] 在本發(fā)明中,術(shù)語"風(fēng)險分級"涉及根據(jù)對象的進一步預(yù)后將對象分組成不同的風(fēng) 險組。風(fēng)險分級還涉及針對應(yīng)用預(yù)防和/或治療措施進行分級。
[0113] 在本發(fā)明的情形下,術(shù)語治療控制指監(jiān)測和/或調(diào)整所述患者的治療性處理。
[0114] 在本發(fā)明的情形下,術(shù)語"篩選"指對群體進行調(diào)查的過程,其使用一種或更多種 特定標(biāo)志物和限定的篩選截止水平來在群體中鑒定處于特定病癥之較高風(fēng)險中的個體。篩 選適用于群體;診斷應(yīng)用于個體患者水平。
[0115] 術(shù)語"先兆子癇"包括妊娠女性的高血壓性多系統(tǒng)病癥,其以高血壓和蛋白尿為特 征。先兆子癇的最常見癥狀是高血壓、尿中蛋白質(zhì)增加以及手和面部腫脹或水腫。在本發(fā)明 的某些實施方案中,先兆子癇限定為高血壓(收縮壓和舒張壓分別多140和90mm Hg)和蛋白 尿(在24小時尿收集物中的蛋白質(zhì)分泌彡300mg,或纖維素試紙(dipstick)彡2+)。
[0116] 非整倍性是染色體的數(shù)目異常,并且是一種類型的染色體異常。染色體多余或缺 失是遺傳病癥(出生缺陷)的常見原因。非整倍性發(fā)生于細胞分裂期間,此時染色體未在兩 個細胞之間正確分離。非整倍性包括例如胎兒21三體(唐氏綜合征)、18三體(愛德華茲綜合 征)和13三體(帕陶綜合征)。
[0117] 小于胎齡兒指未達到其確定的潛在大小之生長受限的胎兒。胎兒體重低于胎齡的 第10百分位數(shù)。
[0118] 以下實施例和附圖用于對本發(fā)明進行更詳細的解釋,但并非將本發(fā)明限制于所述 實施例和附圖。
[0119] 本文中引用的所有專利和非專利參考文獻均在此通過引用整體并入。 實施例
[0120] 實施例1:抗體的產(chǎn)生
[0121] 多克隆抗體
[0122]針對人PIGF的多克隆抗體從(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon UK;參考號: AF-264-PB)商購。
[0123] 單克隆抗體的開發(fā)
[0124] 針對PIGF-2的單克隆抗體通過標(biāo)準(zhǔn)程序(Harlow E,Lane D.Antibodies-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory,1988;Lane 1985.Journal of Immunology Methods81:223-228)產(chǎn)生。對于抗人PLGF-2抗體的產(chǎn)生,用 50iig人重組PIGF_2(R&D Systems Europe Ltd .Abingdon UK)免疫8周齡的雌性BALB/c小 鼠,所述人重組?16?-2溶解于含有14〇111111〇1/1似(:1的11111111〇1/1磷酸鈉緩沖液化117.2)中。 以4周的時間間隔施用免疫原的后續(xù)加強注射。在初次免疫后3個月,與SP2/0小鼠骨髓瘤細 胞(SP2/0-Ag 14)進行融合。通過ELISA用固定化的重組人PIGF-2篩選到克隆477/G2和477/ E5。通過蛋白A Fast Flow親和色譜法(GE Healthcare Life Sciences)根據(jù)生產(chǎn)商的說明 純化抗體。
[0125] 對單克隆抗體的選擇基于識別重組?16?-2(3£〇10勵:3)獲得的信號。兩條劑量 響應(yīng)曲線示于圖1中。使用克隆477/G2獲得最佳信號。
[0126] 抗體的標(biāo)記
[0127]在該測定中,使多克隆抗人PIGF抗體(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK)和 單克隆抗人 PIGF-2 抗體分別與 Luillil^mumiphore,Inc ?,Ri chmond,Canada)和花菁 5.5(GE Healthcare UK Limited)偶聯(lián)。偶聯(lián)反應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)定偶聯(lián)方案來進行。
[0128] 實施例2:使用單克隆和多克隆抗體之PIGF-2測定的開發(fā)
[0129] 開發(fā)了使用時間分辨放大穴狀化合物發(fā)射(TRACE)技術(shù)的均相夾心熒光免疫測定 (Mathis. 1993.Clin Chem 39(9) : 1953-9)來檢測PIGF-2。
[0130] 在使用之前,將儲液1111111丨4(思-1:七綴合的抗體和花菁5.5綴合的抗體溶液用測定 緩沖液(l〇〇mmol/L磷酸鈉 pH 7、0.375 %無蛋白酶牛血清白蛋白、0.25mg/mL小鼠 IgG、 0 ? 25mg/mL牛IgG、0 ? 25mg/mL山羊IgG)分別以0 ? 125yg/mL和5yg/mL進行稀釋。將重組人 PIGF-2在經(jīng)熱處理的去纖維蛋白的正常人血漿中稀釋以得到PIGF-2標(biāo)準(zhǔn)物。如下進行免疫 測定:根據(jù)生產(chǎn)商的說明,在B.R.A.H.M.S KRYPT0R緊湊型PLUS設(shè)備(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH,Hennigsdorf/Berlin,Germany)上于37°C下孵育70iiL樣品/校準(zhǔn)物、40ii L花#5.5綴合的抗體溶液和40此1:|1111:14_-11)綴合的抗體溶液。該測定的反應(yīng)時間為29分 鐘。使用8.1?^.^.3 10^?1'01?緊湊型?0^設(shè)備通過在707和62〇11111下進行同時雙波長測量 來測量特異性熒光(RFU)。
[0131] 實施例3:用克隆477/G2測定的劑量響應(yīng)曲線
[0132] 劑量響應(yīng)曲線可通過在上述單克隆免疫測定中使用重組PIGF-2(SEQ ID N0:3)作 為標(biāo)準(zhǔn)材料來產(chǎn)生。典型的劑量響應(yīng)曲線示于圖2中。
[0133] 實施例4:通過該測定識別PIGF-2同工型的特異性
[0134] 使用特異性PIGF-2測定來測量商購的PIGF-1和PIGF-2標(biāo)準(zhǔn)物。圖3顯示,針對 PIGF-2的特異性測定與PIGF-1同工型無交叉反應(yīng)性,因此該方法僅檢測特異性的PIGF-2同 工型。
[0135] 實施例5:PIGF_2同工型上的構(gòu)象表位的識別
[0136] 使用特異性PIGF-2測定來測定重組PIGF-2。制備樣品以包含10yg/mL對PIGF-2之 肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID N0:6)具有特異性的21aa肽。使用高濃度的21aa肽(與重組PIGF-2 相比高lxlO6倍)以抑制該測定識別重組PIGF-2。當(dāng)在該測定中添加特異性肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 肽時,對信號無抑制(圖4),因此單克隆抗體477/G2不識別對應(yīng)于SEQ ID N0:6的線性21 aa 肽。該抗體識別PIGF-2同工型上的構(gòu)象表位。
[0137] 實施例6:產(chǎn)前病癥中的PIGF-2
[0138] 研究群體
[0139] 為了確定PIGF-2是否是病理性妊娠者的可用標(biāo)志物,使用上述針對PIGF-2的均相 夾心熒光免疫測定在來自以下的血清樣品中評價PIGF-2:295位經(jīng)歷正常妊娠的女性、15位 受21三體影響的妊娠者、10位受18三體影響的妊娠者、10位受13三體影響的妊娠者、30位隨 后發(fā)生PE之需要在34周前分娩的妊娠者和30個分娩小于胎齡的(SGA)新生兒的病例。用重 組人PIGF-2校準(zhǔn)特異性PIGF-2測定。
[0140]在例行的首三個月醫(yī)院就診時取得樣品。所有的妊娠女性均簽署了由國王學(xué)院醫(yī) 院倫理委員會(King's College Hospital Ethics Committee)批準(zhǔn)的同意書。
[0141] mm
[0142] 使用全自動化夾心免疫測定系統(tǒng)在8.1?^.^.3 1(1^?1'01?緊湊型?1^5設(shè)備 (Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH,Hennigsdorf/Berlin,Germany)上檢測PIGF_2〇 這種隨機存取分析儀采用基于兩種熒光團之間的非放射性迀移的靈敏性時間分辨放大穴 狀化合物發(fā)射(TRACE)技術(shù)。用于檢測PIGF-2的自動化測定基本上基于夾心熒光測定,其使 用可商購的多克隆抗體(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon UK;參考號:AF-264_PB)和與 PIGF-2特異性結(jié)合并且在上文有所描述的新單克隆單體。用重組人PIGF-2校準(zhǔn)特異性 卩16卩-2測定。8.1?^.11.]\1.5?16卩-21〇^?1'01?測定的測量范圍為15至14 461口8/111以圖2)。 PIGF-2測定的變異針對對照樣品來確定,進行26輪(run),重復(fù)兩次。在7天時間期間,使用 第一輪的校準(zhǔn)曲線作為參照曲線。檢測界限為15pg/mL,而量化界限(功能靈敏度)為< 42pg/mL。測定內(nèi)和測定間變異在100pg/mL的PIGF-2濃度下分別為8.8%和9.4%,在505pg/ mL下分別為2.3%和2.9%,在1018口8/11^下分別為1.3%和2.4%。
[0143] 對于確定胎兒中染色體異常的風(fēng)險,在于首三個月期間從妊娠女性取得的樣品中 測量以下參數(shù):i)PAPP-A、游離PhCG; i i)PAPP-A、游離PhCG、PIGF; i i i)PAPP-A、游離PhCG、 PIGF、PIGF-2。使用合并這些生物標(biāo)志物的算法來確定檢測率和假陽性率。
[0144] 對于妊娠女性中發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險評估分析,在于首三個月期間從所述對象取 得的樣品中測量以下參數(shù):i)PAPP-A、PI、MAP;ii)PAPP-A、PI、]\M^PPIGF ;iii)PAPP-A、PI、 MAP、PIGF和PIGF-2。使用合并這些生物標(biāo)志物的算法來確定檢測率和假陽性率。
[0145] 統(tǒng)計學(xué)分析
[0146] 通過確定正常群體和相應(yīng)胎兒非整倍性群體的中位數(shù)來計算確定胎兒非整倍性 之風(fēng)險的數(shù)學(xué)算法。將PAPP-A、游離f3hCG、PIGF和PIGF-2以中位數(shù)倍數(shù)(MoM)表示從而使研 究結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化?,F(xiàn)有風(fēng)險(prior risk)(表示為比值)由母體年齡特異性的患病率推導(dǎo)出, 并將其乘以來自受影響和未受影響妊娠者中生化標(biāo)志物的對數(shù)高斯分布的似然比 (likelihood ratio,LR)。對于PAPP-A、游離此CG、PIGF和PIGF-2的組合,確定受影響和未受 影響妊娠者中l(wèi)og MoM值之間的相關(guān)系數(shù)。
[0147] 用于進行風(fēng)險評估的統(tǒng)計學(xué)過程通過確定未受影響妊娠者和先兆子癇妊娠者的 中位數(shù)來計算。對于各個生化和生物物理標(biāo)志物,計算MoM。然后,進行多變量高斯分析以確 定似然比。對于先兆子癇風(fēng)險確定,現(xiàn)有風(fēng)險基于一般群體的風(fēng)險。
[0148] 應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗以確定各個結(jié)果組相對于對照的中位數(shù)MoM值的差異顯 著性。
[0149] 結(jié)果
[0150] 患者的特征示于表1中。與對照樣品相比,PIGF-2的中位數(shù)MoM在以下女性的樣品 中顯著更低:患有先兆子癇的女性(P = 0.001)、SGA組的女性(p < 0.0001)、21三體組的女性 (口 = 0.005)、18三體組的女性化=0.001)和13三體組的女性(化=0.004)(表2)。
[0151] 用于對21三體進行風(fēng)險評估的多參數(shù)分析(風(fēng)險截止值250分之一)顯示(表3):與 在測量PAPP-A、游離此06(??1? :9.6%)之后或者在測量?4??4、游離此06和?16?(??1?: 9.6%)之后的FPR相比,妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)、游離f3hCG、PlGF和PIGF-2的確定以 4.8%的最低假陽性率為特征。
[0152]用于對13三體進行風(fēng)險評估的多參數(shù)分析(風(fēng)險截止值250分之一)顯示(表4):與 在測量PAPP-A、游離0hCG(DR:9O%)之后或者在測量PAPP-A、游離此CG和PIGF(DR:90%)之 后的DR相比,妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)、游離此CG、PIGF和PIGF-2的確定以100%的最高 檢測率為特征。
[0153] 用于對先兆子癇進行風(fēng)險評估的多參數(shù)分析顯示(表5):與在測量PAPP_A、PI、MAP (DR:55% )之后或者在測量PAPP-A、PI、MAP和PIGF(DR:77% )之后的檢測率相比,妊娠相關(guān) 血漿蛋白A(PAPP-A)、搏動指數(shù)(PI)、平均動脈壓(MAP)、PIGF和PIGF-2的確定以82%的最高 檢測率為特征。
[0154] 實施例7:末三個月的SGA和先兆子癇患者中的PIGF-2
[0155] 如實施例6中所述確定處于妊娠末三個月的先兆子癇和小于胎齡兒(SGA)患者的 PIGF-2水平。患者的特征示于表6中。與對照樣品相比,PIGF-2的中位數(shù)MoM在處于妊娠末三 個月之患有先兆子癇女性的樣品(P<〇. 0001)中和SGA組女性的樣品(p<0.0001)中顯著更 低(表7)。
[0156] 附表
[0157]表1:研究群體的特征
[0159]表2:各個不利結(jié)果組與對照之胎盤生長因子2的中位數(shù)倍數(shù)(MoM)值的中位數(shù)(四 分位距)比較。通過具有事后Bonferroni校正的Mann-Whitney U檢驗進行結(jié)果組之間的比 較;經(jīng)調(diào)整的顯著性水平P<〇.01 *。
[0160]
[0161]表3:使用多參數(shù)分析用不同算法對非整倍性進行風(fēng)險評估的檢測率(DR)和假陽 性率(FPR)。針對21三體的經(jīng)驗結(jié)果:
[0163]表4:使用多參數(shù)分析用不同算法對非整倍性進行風(fēng)險評估的檢測率(DR)和假陽 性率(FPR)。針對13三體的經(jīng)驗結(jié)果:
[0166]表5:使用多參數(shù)分析用不同算法對先兆子癇進行風(fēng)險評估的檢測率(DR)和假陽 性率(FPR)。
[0168]表6:研究群體的特征
[0170] 值以中位數(shù)(IQR=四分位距)或數(shù)字(%)表示。
[0171]表7:各個不利結(jié)果組與對照在末三個月之胎盤生長因子2的中位數(shù)倍數(shù)(MoM)值 的中位數(shù)(四分位距)比較。通過Mann-Whitney U檢驗進行結(jié)果組之間的比較;經(jīng)調(diào)整的顯 著性水平P<0.01*。
【主權(quán)項】
1. 用于在妊娠雌性對象或所述對象的未出生胎兒中對產(chǎn)前病癥或狀況進行診斷、預(yù) 后、風(fēng)險評估、風(fēng)險分級和/或治療控制的方法,其包括: (i) 在來自所述對象之樣品中確定胎盤生長因子2(P1GF_2)的水平, (ii) 將所述樣品中所測定的水平與由無產(chǎn)前病癥或狀況之對象獲得的對照水平進行 比較; 其中與所述對照水平相比,來自所述對象之樣品中的水平降低指示所述產(chǎn)前病癥或狀 況和/或所述對象或胎兒獲得所述產(chǎn)前病癥或狀況的風(fēng)險提高和/或所述產(chǎn)前病癥或狀況 加重的風(fēng)險提高。2. 用于在妊娠雌性對象或所述對象的未出生胎兒中診斷產(chǎn)前病癥或狀況的方法,其中 在來自待診斷對象的樣品中確定胎盤生長因子2(P1GF_2)的水平,并且其中P1GF-2的水平 低于對照組之0.85 "中位數(shù)倍數(shù)"(MoM)指示所述產(chǎn)前病癥或狀況。3. 用于檢測胎盤生長因子2(P1GF_2)的免疫測定方法,其包括以下步驟: (a) 在以下條件下使懷疑含有P1GF-2的樣品與PlGF特異性的第一抗體或者其抗原結(jié)合 片段或衍生物接觸并且與P1GF-2特異性的第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物接觸,所 述條件允許在P1GF-2和這兩種抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物之間形成三元復(fù)合物,以 及 (b) 檢測所述兩種抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物與P1GF-2的結(jié)合。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫測定方法,其中所述第一和第二抗體或者其抗原結(jié)合片 段或衍生物對非重疊的不同構(gòu)象表位具有特異性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫測定方法,其中所述第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍 生物對P1GF-2的構(gòu)象表位具有特異性。6. 根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的免疫測定方法,其中所述抗體或者其抗原結(jié)合片 段或衍生物為多克隆抗體、單克隆抗體或遺傳工程化單克隆抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫測定方法,其中所述第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍 生物通過選自以下的雜交瘤細胞系產(chǎn)生:以DSM ACC3222保藏的細胞477/G2和以DSM ACC3221保藏的細胞系477/E5。8. 根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項所述的免疫測定方法,其中所述樣品從對象的體液或組 織獲得,例如選自血液、血清、血漿和尿的體液。9. 根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項所述的免疫測定方法,其特征在于,所述抗體中的一種 是經(jīng)標(biāo)記的而另一種抗體與固相結(jié)合或者可以選擇性地與固相結(jié)合。10. 根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項所述的免疫測定方法,其中所述第一和第二抗體以分 散于液體反應(yīng)混合物中的方式存在,并且其中第一標(biāo)記組分與所述第一抗體結(jié)合,所述第 一標(biāo)記組分為基于熒光或者化學(xué)發(fā)光消失或放大的標(biāo)記系統(tǒng)的一部分,并且所述標(biāo)記系統(tǒng) 的第二標(biāo)記組分與所述第二抗體結(jié)合,以使得在這兩種抗體與待檢測的P1GF-2結(jié)合之后, 產(chǎn)生允許在測量溶液中檢測所得夾心復(fù)合物的可測量信號。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫測定方法,其特征在于,所述標(biāo)記系統(tǒng)包含與熒光或化 學(xué)發(fā)光染料特別是花菁型熒光或化學(xué)發(fā)光染料組合的稀土穴狀化合物或螯合物。12. 單克隆抗體,其通過選自以下的雜交瘤細胞系產(chǎn)生:以DSM ACC3222保藏的細胞系 477/G2和以DSM ACC3221保藏的細胞系477/E5。13. 抗體,其與權(quán)利要求12所述的抗體結(jié)合相同的表位。14. 用于檢測P1GF-2的試劑盒,其包含: (i)對PlGF具有特異性的第一抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物;和 (i i)對P1GF-2具有特異性的第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒,其中 (i) 所述第一抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物對SEQ ID NO: 1序列內(nèi)包含的表位具 有特異性;和/或 (ii) 所述第二抗體或者其抗原結(jié)合片段或衍生物對P1GF-2的結(jié)構(gòu)表位具有特異性。16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒,其中所述第二抗體是根據(jù)權(quán)利要求12或12所 述的抗體。17. 根據(jù)權(quán)利要求3至11中任一項所述的免疫測定方法、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的抗 體或者根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒用于在對象中對病癥或狀況進行診斷、預(yù)后、風(fēng) 險評估、風(fēng)險分級和/或治療控制的用途。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途,其中所述病癥或狀況是妊娠雌性對象中或胎兒中的 產(chǎn)前病癥或狀況。19. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途,其中所述妊娠雌 性對象中的所述產(chǎn)前病癥或狀況選自先兆子癇或分娩具有非整倍性之孩子的風(fēng)險或分娩 小于胎齡的新生兒的風(fēng)險。20. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或19中任一項所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途,其中 所述對象處于妊娠的首三個月。21. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或19至20中任一項所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求19至20中任一 項所述的用途,其中在所述樣品中確定與診斷先兆子癇相關(guān)的至少一個其他參數(shù),任選地 其中: (a) 所述病癥或狀況是先兆子癇并且所述其他先兆子癇參數(shù)是選自以下的一種或更多 種:PAPP-A、超聲標(biāo)志物(搏動指數(shù)、舒張期切跡)、平均動脈壓、PlGF、sFl t、母體病史、可溶 性內(nèi)皮糖蛋白(sEng)、抑制素 A、激活素 A、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、人絨毛膜促性腺激素 (1^6)、和無細胞胎兒0嫩, (b) 所述病癥或狀況是非整倍性并且所述其他參數(shù)是選自以下的一種或更多種:PAPP-A、游離ffiCG、頸半透明度、母體年齡、AFP、P1GF、胎兒鼻骨、雙頂徑/鼻骨比、hCG、抑制素 A、非 綴合雌三醇3(uE3)、和無細胞胎兒DNA,或者 (c) 所述病癥或狀況是小于胎齡兒并且所述其他參數(shù)是選自以下的一種或更多種: PAPP-A、母體病史、PlGF、sFlt、AFP、游離βhCG、hCG、抑制素 A、激活素 A、sEng、恥骨聯(lián)合-宮底 高度(SFH)、胎兒生物計量(股骨長度(FL)、頭圍(HC)、雙頂徑(BPD)、腹圍(AC))和超聲標(biāo)志 物(搏動指數(shù)、臍動脈多普勒、大腦中動脈多普勒、靜脈導(dǎo)管多普勒)。22. 雜交瘤細胞系,其選自以DSM ACC3222保藏的細胞系477/G2和以DSM ACC3221保藏 的細胞系477/E5。
【文檔編號】G01N33/68GK105917232SQ201480065790
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年12月3日
【發(fā)明人】蓋安·德米爾吉安, 德爾菲娜·埃斯皮納斯
【申請人】塞尚公司