Csfv抗體的改進的診斷測試的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及獸醫(yī)診斷學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及用于檢測針對CSFV的抗體的測試。具體地，本發(fā)明涉及用于檢測測試樣品中的針對野生型CSFV的抗體的方法，其特征在于該方法包括與包含CSFV E2蛋白的突變的TAVSPTTLR表位的載體共溫育。此外，本發(fā)明涉及診斷測試試劑盒，和本發(fā)明方法的用途。此外，本發(fā)明涉及用于區(qū)分被野生型CSFV感染的動物和用CSFV(標記)疫苗針對CSFV接種疫苗的動物的方法，和用于通過組合使用CSFV(標記)疫苗和本發(fā)明的診斷測試試劑盒控制豬類動物群體中的野生型CSFV的感染的方法。
【專利說明】CSFV抗體的改進的診斷測試
[0001] 本發(fā)明設(shè)及獸醫(yī)診斷學(xué)領(lǐng)域，具體地設(shè)及用于檢測針對CSFV的抗體的測試。具體 地，本發(fā)明設(shè)及用于檢測測試樣品中的針對野生型CSFV的抗體的方法。此外，本發(fā)明設(shè)及診 斷測試試劑盒，和所述方法用于檢測針對野生型CSFV的抗體的用途。此外，本發(fā)明設(shè)及用于 區(qū)分被野生型CSFV感染的動物和用CSFV疫苗針對CSFV接種疫苗的動物的方法，和用于控制 豬類動物群體中的野生型CSFV感染的方法。
[0002] 已知不同的測試用于血清學(xué)診斷微生物的感染，W確定人或動物對微生物或針對 微生物的抗體陽性還是陰性的。通常，此類測試包含使用提供特異性的定義抗體檢測可能 已經(jīng)形成的免疫復(fù)合物的技術(shù)。經(jīng)常，測試也將具有用于擴增信號強度的步驟，和一個或多 個用于洗去未結(jié)合的、非特異性的或不需要的組分的步驟。免疫復(fù)合物的檢測可W多種方 式進行，諸如光學(xué)上通過檢測顏色變化、巧光或顆粒大小的變化，或者另外通過檢測免疫復(fù) 合物中的放射標記的抗原或抗體。類似地，測試的物理形式可W廣泛變化，并且可W例如采 用微量滴定板、膜、試紙、生物傳感器忍片、凝膠基質(zhì)或包含(微)載體顆粒諸如膠乳、金屬或 聚苯乙締(polystyreen)等的溶液。
[0003] 此類測試的特定設(shè)置的選擇通常通過輸入樣品的類型、所需測試靈敏度(正確鑒 定陽性樣品）和特異性(正確地區(qū)分真陽性和真陰性樣品）來確定;此類特性取決于免疫應(yīng) 答的強度和時機，或微生物的存在。進一步，測試經(jīng)濟諸如其大規(guī)模適用性和其成本的要求 對于具體格式的選擇可W是決定性的。
[0004] 熟知的診斷測試是:放射免疫測定法、免疫擴散、免疫巧光、免疫沉淀、凝集、溶血、 中和和"酶聯(lián)免疫吸附測定法"或ELISA。尤其是對于大規(guī)模測試，可要求液體處理、結(jié)果讀 取和處理或兩者的自動化。運還可需要用更加現(xiàn)代化和小型化的形式諸如Alph化ISA? (Perkin Elmer)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的測定形式。
[0005] 常用的診斷測試是酶免疫測定，諸如化ISA。運些是容易放大的，并且可W是非常 靈敏的。其他優(yōu)點是其結(jié)果的動態(tài)范圍，因為可W在稀釋范圍內(nèi)測試樣品。結(jié)果W吸光度的 任意單位表示，一般為0.1和2.5光密度(0D)單位之間，運取決于用于讀出的技術(shù)設(shè)備的性 能和設(shè)置。包括常規(guī)合適的陽性和陰性對照樣品，并且多次測試倍數(shù)最高的樣品。通過包括 定義參考樣品（的稀釋范圍）而獲得標準化，其也允許將特定評分匹配至用于確定陽性或陰 性的預(yù)設(shè)值，并且允許與生物學(xué)意義關(guān)聯(lián)，例如:抗原的量與效力的關(guān)聯(lián)，或抗體的量與免 疫保護水平的關(guān)聯(lián)。
[0006] ELISA設(shè)置的許多變體是已知的，但通常采用將抗原或抗體固定化至固相，例如固 定化至微量滴定板的孔。當固定化抗體時，測試被稱為'捕獲'或'夾屯、'ELISA。接著添加測 試樣品，允許配體(例如檢測抗原或抗體)結(jié)合。然后加入檢測劑(抗體、抗原或其他結(jié)合組 分），其綴合至標記，例如綴合至可誘導(dǎo)顏色反應(yīng)的酶，所述顏色反應(yīng)可W分光光度讀取。其 他類型的標記可W使用發(fā)光、巧光或放射性。標記的檢測劑的使用意在提供應(yīng)用信號強度 W增強測試靈敏度，但是，它也可引入背景信號，降低信噪比。
[0007] 在化ISA方案的變體中，通過引入競爭性結(jié)合改善測試特異性，在該情況下，測試 被稱為'競爭化ISA'、'抑制化ISA'、'干擾化ISA'或'阻斷化ISA'。在此類測定中，測試樣品 中的因子(抗體或抗原）與標記的檢測抗體/抗原競爭結(jié)合固定化至固相的分子(抗原或抗 體）。運導(dǎo)致最大顏色信號的下降，它是測量競爭因子的存在或量的靈敏方式。結(jié)果可W表 示為最大化ISA信號的抑制百分比。
[0008] 由于其多功能性和靈敏性，一般使用化ISA，例如用于流行病學(xué)、感染監(jiān)測計劃，或 驗證接種疫苗活動的效力。ELISA的該用途也延伸至動物健康部口，例如監(jiān)測更相關(guān)的傳染 病的根治和控制措施。在該背景中關(guān)鍵的是診斷測試的足夠水平的敏感性和特異性，因為 在運方面的錯誤可具有任一方式的嚴重后果:假陽性可導(dǎo)致動物的不必要的檢疫或撲殺， 假陰性可導(dǎo)致通過未檢測到的載體動物跨境運輸傳播病原體。ELISA的此類使用的一個實 例是控制0IE應(yīng)具報疾病，諸如豬類動物中的典型豬攝(CSF)。
[0009] 也稱為豬霍亂或豬攝的CSF是全世界發(fā)生的豬類動物的常見致命疾病。它由高度 感染性的典型豬攝病毒(CSFV)(也被稱為豬霍亂病毒）引起。該疾病導(dǎo)致大量動物患病，和 依賴于商業(yè)豬養(yǎng)殖及其產(chǎn)品的部口的巨大經(jīng)濟損失。
[0010] CSFV屬于黃病毒科，并且屬于攝病毒屬。熟知的其他攝病毒是感染綿羊和豬的邊 界病病毒(BDV)，W及感染牛、綿羊和豬的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。在運些相關(guān)的病毒之 間發(fā)生一定水平的交叉保護。CSF病毒顆粒相對較小且有包膜，并且包含約12.3化的正有 義、單鏈RNA病毒基因組。此基因組被翻譯為一種約4000個氨基酸的大型多蛋白，其被許多 非結(jié)構(gòu)病毒蛋白自動切割。運產(chǎn)生主要結(jié)構(gòu)病毒包膜糖蛋白：Erns、El和E2。關(guān)于病毒及其 疾病的綜述，參見:Moennig (2000，Vet. Microbiol., vol. 73，P. 93)。
[0011] 檢測抗CSFV抗體的黃金標準是病毒中和測試。但是，因為運是費力和困難的， ELISA型測試用于快速篩選和檢測，并且各種商業(yè)測試可用于檢測CSFV抗原或CSFV抗體。此 類測試綜述于Blome等人（2006, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), vol. 25, P. 1025) dCSFV抗原的巧聯(lián)檢測全病毒或特定病毒(包膜)蛋白，諸如化ns或E2。類似地，CSFV抗 體的測試檢測病毒-、E2-或Erns抗體。檢測目標動物中的抗體比檢測抗原或病毒更靈敏，因 為抗體在動物中存在更長時間，為檢測提供更寬的時間窗口。此外，因為攝病毒間的交叉反 應(yīng)性，在BVD和/或BVDV高流行地區(qū)，基于化ns抗原或抗體的檢測的CSFV的診斷測試是不可 靠的。因此，CSFV診斷目前聚焦于抗CSFV E2蛋白抗體的檢測。對于綜述：Schroeder等人 (2012, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), vol. 31, p. 997)〇
[0012] CSFV E2蛋白（W前稱為糖蛋白El或即51-54)從CSFV多蛋白的氨基酸(aa)位置690 起進行編碼。成熟CSFV E2蛋白長度為約370 aa，其不具有與El C-末端重疊的約22 aa的N- 末端信號序列，但包括約40 aa的C-末端跨膜區(qū)（Ganges等人，2005, vaccine vol. 23, p. 3741)。在E2上，免疫顯性A結(jié)構(gòu)域位于多蛋白的氨基酸位置766和866之間（van Ri化等 人，1993. J. of Gen. Virol.，vol. 74，P. 2053)。在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)，已經(jīng)鑒定一個引發(fā) 病毒中和抗體的線性B-細胞表位:TAVSPTTLR表位(SEQ ID NO: 1)。此表位位于CSFV多蛋白 的氨基酸位置829 - 837處，其對應(yīng)于E2 aa序列的aa 140-148,并且在CSFV毒株之間是高 度保守的，但不與BVDV-或BVD抗體交叉反應(yīng)化in等人，2000，J. of Virol.，vol. 74， p. 11619)。
[0013] 已經(jīng)開發(fā)了采用該抗原的特異性的許多商業(yè)E2抗體測試:PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 (W前命名為 Ceditest? CSFV 2.0)(均購自 Prionics AG, Schlieren-Zurich, Switzerland)和IDEXX CSFV Ab Test? (IDEXX Europe B.V.，Hoofddorp, The Netherlands)。運些測試是使用固定化的CSFV E2蛋白的競爭性化ISA試劑盒。當任何E2抗 體存在于測試樣品中時，它們結(jié)合固定化的CSFV E2,所W與標記的指示劑抗體競爭，所述 標記的指示劑抗體是酶綴合的對于野生型CSFV E2的TAVSPTTLR表位特異性的單克隆抗體； 運些試劑盒中用作指示劑的標記的單克隆抗體被稱為V2 (Prionics)或A18 (IDEXX)，并且 與Lin等人(2000，同上)使用的WH303單克隆抗體具有相同的特異性。
[0014] 針對CSF的疫苗是已知的，并且正在CSFV流行的國家常規(guī)使用。由于滅活CSFV疫苗 是不切實際的，因為活減毒病毒疫苗已經(jīng)使用多年；最有效的疫苗基于所謂的化ina-或C- 毒株。它具有非?？煽康亩嗄晔褂酶櫽涗?，并且也是歐盟允許的唯一活減毒疫苗，盡管僅 用于在CSF爆發(fā)的情況下緊急接種疫苗。經(jīng)常通過禁止抗CSFV抗體血清陽性的豬的運輸?shù)?貿(mào)易限制體系來支持CSF的政府控制計劃(例如抓Council Directive 2001/89/EC)。
[0015] 但是，一些國家可能遭受野生豬和野豬頻繁再感染CSFV的天然儲庫。因此，發(fā)生 CSF的偶爾爆發(fā)，許多豬(感染的和未感染的)被撲殺。運導(dǎo)致大量的倫理問題W及相當大的 成本。此外，進行緊急接種疫苗的豬可能不再被出口，因為它們已經(jīng)變?yōu)殛栃浴＿\導(dǎo)致豬腐 的過度擁擠和進一步的經(jīng)濟損失。
[0016] 因此，努力集中于開發(fā)允許血清學(xué)"區(qū)分感染的動物與接種疫苗的動物"或:DIVA 的疫苗。此類型的區(qū)分測試背后的基本原理是，可W將用具有陽性或陰性'標記'功能的疫 苗對目標動物接種疫苗與野生型微生物感染動物在血清學(xué)上區(qū)分開。例如，該標記疫苗可 W是野生型微生物中存在的一種或多種抗原缺陷的。受感染的目標然后將變?yōu)樵摽乖?陽性的，而接種疫苗者仍然是該抗原血清陰性的。
[0017] 開發(fā)用于針對CSF使用的一類DIVA疫苗基于病毒亞單位，諸如E2和/或化ns。但是， 運些保護性較差，并且比全病毒疫苗具有較慢的免疫開始。
[0018] 此外，在未接種疫苗和撲殺CSFV的方案下，允許此類CSFV標記疫苗上市的唯一方 式是與可靠的伴侶診斷測試組合。
[0019] 為了努力將強烈和早期的保護W及DIVA能力組合于一種疫苗中，用Kodekaas等 人(2010，J. of Virol. Methods, vol. 163，P. 175)的重組DNA技術(shù)修飾現(xiàn)有的C-毒株 活減毒CSFV疫苗，由此它們聚焦于CSFV E2蛋白的A結(jié)構(gòu)域中的TAVSPTTLR表位。突變或缺失 表位中的一些氨基酸，在此之后，使突變的CSFV病毒進行受迫病毒進化。獲得具有 TAVSPTTLR表位的不同突變的活突變病毒。
[0020] 在E2的C-毒株CSFV突變體的vFlc- Δ PT系列中，選擇一種用于進一步研究，命名 為:vFlc-APTal。此病毒具有E2的TAVSPTTLR表位的通過取代一個氨基酸和缺失兩個氨基 酸形成的突變版本，對應(yīng)于原始TAVSPTTLR表位的表位則變?yōu)?TAGS化RTE (SEQ ID NO: 2)。 此突變病毒顯示良好的活力，并誘導(dǎo)針對E2的強烈抗體應(yīng)答。此外，針對突變E2的兔抗體確 實不再識別親本C-毒株病毒的野生型E2。因此，運被認為是允許DIVA的有效活CSFV標記疫 苗的理想候選。
[0021] 然后在目標動物中測試vFlc-APTal突變病毒的疫苗效力（Kortekaas等人， 2011, Vet. Microbiol., vol. 147, P. 11)，其中發(fā)現(xiàn)它誘導(dǎo)的保護水平接近于親本毒 株的保護水平，并且有效地防止攻擊病毒的脫落。但是，作者們失望地發(fā)現(xiàn)，來自用該突變 病毒接種疫苗的豬的血清不能與來自用親本C-毒株病毒接種疫苗的豬的血清清楚地區(qū)分。 運是因為，E2突變病毒在豬中誘導(dǎo)抗體，所述抗體在E2 ELISA中得到中等至全強度假陽性 評分。因此，運排除了新的DIVA標記疫苗的市場引入，因為其缺乏可靠的區(qū)別性CSFV抗體檢 測。
[0022] 為了努力克服來自用標記疫苗接種疫苗的豬的血清在E2 ELISA中的假陽性評分， Kortekaas等人(2011，同上)考慮對化ISA進行幾種修改，諸如:通過使用Ξ級結(jié)構(gòu)預(yù)測修飾 使用的膚;使用將允許更好地區(qū)分的新的單克隆抗體;使用不同的封閉抗體改變化ISA，因 為運已為其他人證明有效化olinka等人，2009，Virology, vol. 384，P. 106);和:改變 讀出的截止值，同時保持可接受的靈敏度。發(fā)現(xiàn)所有運些方法對于克服假陽性的發(fā)生是無 效的。
[0023] 如所指出，Holinka等人(2009,同上）的結(jié)果，當測試來自用不同的重組CSF標記物 接種疫苗的豬的血清時，沒有在類似E2 ELISA中顯示假陽性結(jié)果。但是，它們的結(jié)果不能被 認為是顯著的：一方面是因為它們測試合并的血清，而不是個體血清，并且在另一方面是因 為它們的讀數(shù)在檢測的底部范圍內(nèi)（0.100至0.350 0D單位;參見化linfoi等人，2009，同上； 圖3A)，其中信噪比太不利，無法為可靠的大規(guī)模診斷測試形成基礎(chǔ)。
[0024] -個更好的實例是Reimann等人（2010, Vet. Microbiolvol. 142, P. 45)的 出版物，其通過將來自CSFV E2的TAVSPTTLR表位替代為來自BVDV E2的對應(yīng)序列而構(gòu)建了 非常像化linka等人的疫苗的重組CSF疫苗。與Kodekaas等人（2011，同上）的結(jié)果一致， Reimann等人還發(fā)現(xiàn)用其突變E2病毒接種疫苗的豬的血清中的交叉反應(yīng)性抗體，其結(jié)合未 修飾的E2表位。所W同樣在此情況下，獲得了假陽性分數(shù)，并且不能開發(fā)DIVA測試。為了解 決此問題，Reimann等人建議調(diào)整成本與靈敏度之比的截止值，或改變突變病毒骨架序列W 減少假陽性評分。
[0025] 所W，發(fā)現(xiàn)對TAVSPT化R表位的不同突變導(dǎo)致基于此類突變表位的CSFV標記疫苗 的相同問題:在基于vFlc-APTal病毒的CSFV疫苗的情況下，對TAVSPTTLR表位的突變改變 了該基因座中的9個氨基酸中的6個。類似地，對于Reimann等人(2010,同上），在測試E2蛋白 的相應(yīng)基因座中的9個中的5個不同氨基酸時，此問題也會發(fā)生。
[0026] 因此，獲自用包含CSFV E2蛋白的突變的TAVSPTTLR表位的CSFV(標記)疫苗接種疫 苗的動物的血清中的野生型CSFV E2抗體在化ISA中的假陽性評分的問題，因此具有普遍性 質(zhì)，并且直到今天，仍然沒有得到解決。在CSF候選疫苗的最近綜述中，Ebl6等人（2013， Vet. Microbiol., vol. 162，P. 437)確認了此困境:對于CSFV，還沒有得到CSFV疫苗和 相應(yīng)的DIVA測試的最佳組合。
[0027] 因此，本發(fā)明的目標是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，并且通過當測試來自用在CSFV E2 的TAVSPT化R表位中具有突變的CSFV疫苗接種疫苗的動物的樣品時減少針對野生型CSFV的 抗體的診斷測定中的假陽性結(jié)果而適應(yīng)本領(lǐng)域中的需求。
[0028] 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過允許DIVA的野生型CSFV抗體的改進的診斷測試，可W滿足 此目的，且因此可W克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點。所述改進考慮修改野生型CSFV E2抗體的診斷測 定的溫育步驟，其中將測試樣品與包含CSFV E2的TAVSPT化R表位的固定化的載體溫育，并 且現(xiàn)在引入與包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體的共溫育。發(fā)現(xiàn)此修改僅通過對 CSFV E2抗體的現(xiàn)有診斷測定的方案的有限修改而完全減少假陽性結(jié)果。
[0029] 此修改的診斷方法的有益效果是幾個:主要一個是，此修改可完全整合入現(xiàn)有的 測試方案。因此，不需要額外的溫育步驟，并且改進的測試方法不需要比W前更多的時間。 考慮到在區(qū)域中CSF爆發(fā)的情況下可能需要在短時間內(nèi)測試可能非常大量的測試樣品，運 是明顯的優(yōu)點。
[0030] 此外，現(xiàn)在不再需要對相應(yīng)的CSFV疫苗或原始診斷測定進行重大改變。相反，現(xiàn)在 可能使用現(xiàn)有的CSFV E2 ELISA的基本設(shè)置，用于檢測來自用CSFV疫苗接種疫苗的動物的 樣品中的野生型CSFV E2抗體。運允許依賴于確立的CSFV診斷測定法，其具有它們的證明的 可靠性，W及完全確立的特異性和靈敏度概況。
[0031] 在此修改的情況下，CSFV診斷測定現(xiàn)在可W用來有效地區(qū)分感染的動物和接種疫 苗的動物，因此本發(fā)明提供了允許DIVA篩選的野生型CSFV的改進的診斷測試，并且可W用 作CSFV(標記)疫苗的伴侶診斷法，W控制動物的易感群體中CSFV的存在。
[0032] 對于運些有益效果重要的步驟是由本發(fā)明人鑒定區(qū)分針對CSFV的接種疫苗與被 野生型CSFV或C-毒株疫苗感染的失敗原因。
[0033] 發(fā)現(xiàn)此原因是，包含具有突變的TAVSPTTLR表位的E2的CSFV(標記)疫苗誘導(dǎo)抗體， 所述抗體不僅可W特異性結(jié)合疫苗的突變的E2表位，而且可W同樣高親和力結(jié)合野生型 CSFV和C-毒株疫苗中的E2的未修飾TAVSPT化R表位。當對于野生型CSFV的感染測試接種疫 苗的動物的血清樣品時，運導(dǎo)致假陽性評分。相反，沒有發(fā)現(xiàn)由野生型CSFV的感染或用C-毒 株疫苗接種產(chǎn)生的抗體，或針對野生型TAVSPTTLR E2表位的單克隆抗體（例如：V2 (Prionics), A18 (IDEXX), orW冊03化in等人，2000，同上））對于CSFV疫苗的具有突 變的TAVSPTTLR表位的E2蛋白具有任何明顯的親和力。運是為什么與包含野生型CSFV E2蛋 白的TAVSPTTLR表位的載體共溫育沒有解決針對具有突變的TAVSPT化R表位的疫苗的假陽 性評分的問題的原因。
[0034] 目前不知道此現(xiàn)象如何發(fā)生或者為什么發(fā)生。但是，不限于將解釋運些觀察結(jié)果 的任何理論或模型，本發(fā)明人推測有CSFV E2的TAVSPTTLR表位的Ξ維形式的影響；此Ξ維 形式在其線性氨基酸序列的突變后發(fā)生改變。運誘導(dǎo)針對突變的E2表位的抗體，運顯然仍 然能夠特異性結(jié)合CSFV E2的野生型TAVSPT化R表位。此類抗體在基于野生型CSFV E2蛋白 的診斷測定中是交叉反應(yīng)的，從而導(dǎo)致高度特異性的假陽性評分。
[0035] 具有運種對假陽性測試評分的問題的原因的見解，本發(fā)明人然后發(fā)現(xiàn)了解決此問 題的令人驚訝的方式，并且能夠在確立的E2診斷測定法的方案的一個步驟中實施解決方 案:將測試樣品與包含CSFV E2蛋白的TAVSPTTLR表位的固定化載體溫育的步驟，并且此外： 與包含CSFV E2蛋白的突變的TAVSPTTLR表位的載體共溫育。運解決了假陽性評分的問題。
[0036] 診斷方法的修改可W采取共溫育的形式的事實是驚訝的，因為通常會預(yù)期此類程 序?qū)τ跍y試樣品中的CSFV E2抗體與包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體的正確和 完全結(jié)合是破壞性的，因此技術(shù)人員通常不會加 W考慮。
[0037] 因此，在第一方面，本發(fā)明設(shè)及用于檢測測試樣品中針對野生型典型豬攝病毒 (CSFV)的抗體的方法，其中所述樣品還可W包含針對CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的抗 體，所述方法包括將所述測試樣品與包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體溫育的步 驟，特征在于所述方法包括在所述步驟中與包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體共 溫育。
[0038] 本發(fā)明的"檢測方法"是體外方法，其應(yīng)用于測試樣品，W確定測試樣品的值或特 性(通常被稱為"生物標記物"），在此之后，測定的結(jié)果可W被解釋成為其結(jié)果給予特定意 義。此解釋基于使用該方法對于測試樣品獲得的結(jié)果與參考值或w前的測量值的比較，并 且確定測量的值是否存在或不存在，或者是否已經(jīng)增加或減少。
[0039] 對于本發(fā)明，測量的值是對于野生型CSFV E2蛋白的TAVSPTTLR表位特異性的抗體 的定性和定量存在。
[0040] 本發(fā)明方法可W是不同的熟知形式之一的診斷測試，例如為:放射免疫測定法、免 疫擴散測定法、免疫巧光測定法、免疫沉淀測定法、凝集測定法、溶血測定法、中和測定法、 "酶聯(lián)免疫吸附測定法"化LISA)或A1地aLISA ?。
[0041] 幾本教科書描述了各種可用的診斷測試及其具體特征；例如：J.化ebner: Antibody-antigen interactions and measurements of immunologic reactions (第9 章，于：Pier, Lyczak 和Wetzler (編輯；）：Immunology, infection, and immunity, ASM Press, Washington D.C., 2004, ISBN: 1555812465, p. 207-232);'Antibodies: A L曰bor曰tory M曰nu曰 1 '（編車茸：Harlow 和Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, ISBN-10:0879693142);和：'Immunoassays:A Practical A郵roach' (J. P. Gosling編輯，Oxford University press, 2000, ISBN-10:0199637105)。
[0042] 大量商業(yè)公司可W提供診斷測試的材料和試劑，或成品診斷試劑盒，或者可W提 供測試和分析。
[0043] 設(shè)計和優(yōu)化本發(fā)明方法的方案、材料和條件完全在技術(shù)人員的常規(guī)能力之內(nèi)。
[0044] 也如本領(lǐng)域中所熟知，"抗體"是免疫球蛋白，并且通常W5類存在。對于測試樣品， 所述抗體通常是IgG或IgM類型，并且是完整抗體。但是，可W用作本發(fā)明方法中的試劑，例 如作為二抗，或作為標記抗體，的其他抗體，不需要是完整免疫球蛋白，例如單鏈抗體，或免 疫球蛋白的一部分;并且也可W是不同的形式:此類部分的（合成）構(gòu)建體，條件是抗體-部 分仍然含有抗原結(jié)合位點。免疫球蛋白的熟知子片段為:Fab、Fv、scFv、dAb或Fd片段、Vh結(jié) 構(gòu)域或此類片段或結(jié)構(gòu)域的多聚體。
[0045] 用作診斷測定中的試劑的抗體通常通過用目標抗原(過度)免疫供體動物、并從動 物的血清收獲產(chǎn)生的抗體而產(chǎn)生。熟知的供體是兔和山羊。另一個實例是可W在蛋黃中產(chǎn) 生高水平的抗體(所謂的IgY)的雞?；蛘撸贵w可W在體外產(chǎn)生，例如通過熟知的從永生化B 淋己細胞培養(yǎng)物(雜交瘤細胞）的單克隆抗體技術(shù)，并且其工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)是已知的?？?體或其片段本身也可W在重組表達系統(tǒng)中通過表達克隆的Ig重鏈和/或輕鏈基因來表達。 所有運些都是技術(shù)人員熟知的。
[0046] 對于本發(fā)明且在正文始終，抗體將基于它們針對的目標進行命名；例如:針對CSFV 的抗體被稱為' CSFV抗體'，并且' E2抗體'是針對E2蛋白的抗體，也稱為抗-E2抗體等。
[0047] 如本領(lǐng)域中所熟知，"針對"特定目標的抗體是對于該目標上的表位特異性的抗 體，其中所述目標是特定分子或?qū)嶓w。如果抗體(或其片段)能夠選擇性結(jié)合該表位，則它對 于表位是特異性的。
[0048] 抗體和目標之間的相互作用是否是特異性和/或選擇性的，可W由技術(shù)人員容易 地進行評價。例如，可W通過證明抑制與測定中使用的抗原或抗體的濃度相關(guān)來確定基于 抑制的免疫測定法的結(jié)果的特異性。使用例如競爭結(jié)合測定，可W確定需要多少抗原來使 抗體與該包被抗原的結(jié)合抑制50%(B;rudere;r等人，1990, J. of Imm. Meth.，vol. 133, p. 263)。作為本情況的實例:使用野生型CSFV E2蛋白和TAVSP化LR表位特異性(單克 隆)抗體。
[0049] 在診斷免疫測定的背景下非常相關(guān)的是當抗體證明假陽性結(jié)合、導(dǎo)致診斷測定的 假陽性結(jié)果時。運可W由與除了抗體針對生成的表位W外的表位的相對強結(jié)合，或由與其 來源表位、但然后位于與來源目標不同的目標上的來源表位的特異性結(jié)合導(dǎo)致。
[0050] 免疫測定技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員知道如何區(qū)分真陽性結(jié)果和假陽性結(jié)果(例如通 過用不同類型的診斷測定證明結(jié)果，或用來自不同時間點的測試樣品證明結(jié)果）。
[0051] 通過本發(fā)明方法，當測試針對野生型CSFV的E2蛋白的抗體時，可W獲得假陽性評 分的顯著減少。如本文所概述和例舉，假陽性評分的減少已經(jīng)達到被錯誤認為CSFV陽性的 動物數(shù)量的高達5倍(例如，超過50% ELISA抑制，低至小于10%抑制)和高達100%的減少。
[0052] 在使用本發(fā)明方法的各種測試中，基于測試結(jié)果，從感染后約3周起，來自被野生 型CSFV感染的豬的所有血清都被證明是陽性的，而來自用基于vFlc-APTal的疫苗重復(fù)接 種疫苗的動物的血清，在第Ξ次接種疫苗后，都沒有變?yōu)殛栃裕钡綔y量的最后一個時間 點。
[0053] 還對來自Central Veterinary Institute (Xelys1:ad, the 化therlands)的保 藏中屯、的約900份測試樣品（包含高、低、陰性或懷疑的CSFV抗體）W及許多含有BVD-或 BVDV-抗體和甚至一些CSFV、BVD和/或BVDV的混合感染的血清的大集合測試本發(fā)明方法。通 過本發(fā)明方法，可優(yōu)異的特異性和靈敏度正確地鑒定幾乎所有樣品，參見W下實施例。
[0054] 事實上，當測試900份樣品收集物時，當應(yīng)用共溫育與本發(fā)明方法時，對于測試的 大多數(shù)樣品甚至觀察到增強的靈敏度。運意味著，與應(yīng)用標準商業(yè)CSFV E2抗體阻斷化ISA 相比，當應(yīng)用本發(fā)明方法時，對于幾份樣品，在野生型CSFV E2抗體的阻斷化ISA中觀察到的 抑制百分率更高。運導(dǎo)致5份W前指示為可疑的樣品現(xiàn)在評分為陽性，且兩份W前陰性的樣 品現(xiàn)在評分為陰性(參見實施例2.3和表2)。
[0055] 對于本發(fā)明，"野生型"豬攝病毒是指自然界中存在的CSFV。運并不意味著此類野 生型CSFV都是相同的，因為遺傳組成和生物特征的許多變化是可想象的或已知的。但是，該 術(shù)語意在排除作為人為干預(yù)的結(jié)果的那些CSFV在本發(fā)明中使用，所述人為干預(yù)諸如通過修 飾或突變，例如通過反復(fù)傳代，或通過經(jīng)由重組DNA技術(shù)的改變其核酸。
[0056] 對于本發(fā)明，"典型豬攝病毒"或乂SFV" -般指來自分類學(xué)攝病毒屬的病毒，其具 有CSFV的熟知特性。運也包括W任何方式從其亞分類的CSFV，例如作為亞種、毒株、分離株、 基因型、血清型、血清變型、血清群、變體或亞型等。此類CSFV共享它們的分類學(xué)家族成員的 表征特征，諸如基因組、物理、電子顯微鏡、生化特征，W及生物特征諸如生理學(xué)、免疫學(xué)或 致病行為。接著血清學(xué)分類，其他測定可W基于如本領(lǐng)域中已知的核巧酸測序或PCR測定 法。
[0057] 對于技術(shù)人員明顯的是，盡管作為本發(fā)明主題的病毒種目前命名為CSFV，但運是 當新見解導(dǎo)致重新分類為新的或不同的分類組群時可W進行改變的分類學(xué)分類。然而，由 于運不改變設(shè)及的微生物或其表征特征，只有其科學(xué)名稱或分類，此類重新分類的生物體 仍然在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0058] 用于本發(fā)明方法中使用的"測試樣品"原則上可W是任何類型的含有抗體的樣品， 例如從來自動物的全血樣品制備的血漿或血清樣品。技術(shù)人員完全知道從動物獲得和制備 此類血漿或血清樣品所需的技術(shù)和材料。
[0059] 優(yōu)選的是血清樣品，因為其更干凈，并且可W通過標準實驗室技術(shù)來制備，例如其 包括步驟:凝血、離屯、和補體失活。
[0060] 任選地，測試樣品可W進一步處理或純化，例如W改進信號強度或降低背景信號。 例如，可W分離出抗體。用于抗體純化的熟知技術(shù)是例如使用辛酸或硫酸錠沉淀此類抗體， 或使用親和色譜。
[0061] 對于本發(fā)明，本文中使用的術(shù)語"包含（comprise r(W及變型諸如"包含 (comprising)"、"包含(^comprises)"和"包含(comprised)")是指其中使用該術(shù)語的文本部 分、段落、權(quán)利要求等覆蓋或其中包括的可想象用于本發(fā)明的所有要素和任何可能的組合， 即使未明確記載此類要素或組合;且不是指排除任何此類要素或組合。因此，任何此類文本 部分、段落、權(quán)利要求等也可W設(shè)及一個或多個實施方案，其中術(shù)語"包含（comprise)"(或 其變型）被替代為術(shù)語諸如"由...組成（consist ofT、"由...組成（consisting of)"或 "基本上由...組成（consist essentially of)"。
[0062] 乂SFV E2的TAVSPTTLR表位"是指具有該名稱的CSFV E2蛋白的A結(jié)構(gòu)域中熟知的 表位，并且是長度為9個氨基酸的線性表位。技術(shù)人員將清楚的是，給予該表位的名稱 "TAVSPTTLR"，當W標準單字母IUPAC代碼(其中蘇氨酸被稱為T，丙氨酸被稱為A，等等..）表 示時，與該表位的氨基酸序列匹配。
[0063] CSFV E2的TAVSPTTLR表位在野生型CSFV中是保守的化in等人，2000,同上），并且 其氨基酸序列在本文中表示為SEQ ID NO: 1。
[0064] 對于本發(fā)明，CSFV E2的"突變的"TAVSPTTLR表位在其氨基酸序列方面與SEQ ID NO: 1的不同在于至少一個位置。突變可W設(shè)及單個或多個改變，并且可W是氨基酸的插入、 缺失、或取代或其組合。
[00化]在本發(fā)明方法中使用的CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的一個實例是突變CSFV 病毒諸如vFlc-APTal中存在的相應(yīng)表位，其中此表位是TAGSTLRTE (SEQ ID N0:2)。另一 個實例是如由Reimann等人（2010,同上）描述的重組CSFV,例如病毒pA/CP7_EW2alf_TLA， 其中相應(yīng)表位是:TLANKDTLA (沈Q ID N0:3)。
[0066] 在本發(fā)明方法中使用的CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位可W獲自多種天然或合 成的來源。最方便的是通過人為干預(yù)，諸如通過修飾或突變，例如通過經(jīng)由重組DNA技術(shù)改 變編碼的核巧酸序列，在CSFV E2的TAVSPTTLR表位中引入突變，隨后在體外重組表達系統(tǒng) 中表達包含突變表位的蛋白（例如CSFV E2蛋白，或其部分）。
[0067] 對于本發(fā)明，"溫育"是指允許抗體和它的特異性表位之間的結(jié)合。運將需要有利 于形成此類分子相互作用的反應(yīng)條件，并且將包括使用正確的緩沖劑、溫度和持續(xù)時間。用 于本發(fā)明的溫育的材料和方法在熟知的手冊和商業(yè)測試供應(yīng)商提供的說明書中描述。
[0068] 在本發(fā)明的上下文中，"載體"是指可W攜帶和呈遞CSFV E2蛋白的表位的大分子 結(jié)構(gòu)。原則上，任何結(jié)構(gòu)可W是合適的，條件是表位可W與抗體結(jié)合。載體可W是生物或礦 物質(zhì)來源的，天然或合成的，大或小的，并且可W例如是金屬顆粒、聚合物、蛋白或碳水化合 物。該表位可W通過共價鍵或通過非共價鍵(包括任何種類的離子、靜電、水動力或分子相 互作用)連接。該表位包含在載體中或載體上，并且因此可W是它的一部分，例如作為蛋白 中的內(nèi)部元件，或者作為融合蛋白。該載體也可W含有其他分子或基團，諸如當包含表位的 蛋白是脂蛋白或糖蛋白，或綴合物等時。將表位連接至載體的方法是本領(lǐng)域中熟知的，并且 可W包含生化或重組DM技術(shù)。
[0069] 對于本發(fā)明，蛋白是氨基酸的分子鏈。該蛋白可W是天然或成熟的蛋白，蛋白前體 或前蛋白，或蛋白的免疫原性片段。特別是:膚、寡膚和多膚包括于蛋白的定義內(nèi)。
[0070] 本發(fā)明的載體是"固定化的"，意味著:通過共價鍵合或通過非共價鍵合，諸如通過 吸附或包被等，連接至固相。運并不暗示固相本身是不動的。固相原則上可W是任何固體支 持物，條件是它允許執(zhí)行本發(fā)明的檢測方法，并且可W是不同的大小、形狀或形式，例如板、 顆粒、膜等等…。
[0071] 將載體固定化到固相的方法和材料是本領(lǐng)域中熟知的，并且可W例如設(shè)及使用碳 酸鹽緩沖液和堿性pH值?；蛘?，固定化可W例如是通過導(dǎo)致共價鍵合的化學(xué)反應(yīng)，或通過載 體的生物素化和與抗生物素蛋白包被的固體載體的結(jié)合。
[0072] 優(yōu)選地，固相是微量滴定板的孔，或A1地aL ISA測定中使用的載體珠。
[0073] 對于本發(fā)明，"共溫育"表明包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體與包含 CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體和測試樣品一起溫育。在實踐中，運將意味著，包含 CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體存在于溫育混合物中，所述溫育混合物應(yīng)用于將包 含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體和測試樣品溫育該溫育所需的時間的至少實質(zhì) 部分的步驟中。多少時間構(gòu)成"實質(zhì)部分"取決于所采用的診斷測定的特定方案的細節(jié)。例 如，IDEXX CSFV Ab測試的制備商的說明書表明，用于將測試樣品和固定化的E2蛋白溫育的 步驟的時間段為2小時或過夜（12 - 18小時）。
[0074] 對于本發(fā)明，'時間的實質(zhì)部分'是指用于將包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定 化載體和測試樣品溫育的步驟的時間的至少25%。優(yōu)選為該時間的50%，更優(yōu)選該時間的 75、90、95、99或100 %，W該優(yōu)先順序。
[0075] 此共溫育設(shè)置將本發(fā)明方法與將被視為預(yù)溫育的溫育分開，其將采用單獨和額外 的將測試樣品和包含突變的TAVSPTTLR表位的載體溫育的步驟，并且其可W在與包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體溫育之前進行。此類預(yù)溫育將是技術(shù)人員當優(yōu)化溫育方 案時的標準選擇，因為它允許減少任何不希望的結(jié)合反應(yīng)的良好控制的可能性。但是，本發(fā) 明的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，運些溫育可W有利地整合入一個步驟中作為共溫育，而沒有對測 試的選擇性和特異性的不利影響。
[0076] 如所述，突出的優(yōu)點之一是，共溫育不需要額外的時間來進行診斷測定。一個進一 步優(yōu)點是，可W使用標準商業(yè)E2 ELISA的基本方案，而無需對測試組分或它的方案進行明 顯修改。
[0077] 在本發(fā)明方法的一個實施方案中，檢測是通過酶免疫測定法，更優(yōu)選通過化ISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法）。
[0078] ELISA是熟知的，并且形式和方案的各種類型是已知的。一般優(yōu)點是它們提供快速 和可靠的結(jié)果，并且可W容易按比例放大。
[0079] 在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，ELISA是間接阻斷化ISA。如本領(lǐng)域中已知， 運暗示來自測試樣品的抗體與標記的檢測抗體競爭結(jié)合固定化的表位。測試樣品中存在的 抗體越多，它越結(jié)合固定化的表位，并且可W保留較少標記的抗體，導(dǎo)致標記結(jié)合的最大水 平的下降(抑制）。
[0080] 本發(fā)明方法的示例性方案（由此檢測是通過間接阻斷化ISA)可W包括一些或所有 連續(xù)步驟： -將包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的載體包被于固相， -將測試樣品和包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體與包被載體共溫育，隨 后洗涂， -與標記的二抗溫育，然后洗涂， -顯色反應(yīng)，和 -讀取結(jié)果。
[0081] -些步驟可W分開進行，或由不同方面進行。例如，當作為商業(yè)測試應(yīng)用時，供應(yīng) 商也提供準備用于與測試樣品共溫育的預(yù)包被固相。
[0082] 任選地，所述方案可W另外含有用于阻止假陽性結(jié)合反應(yīng)的一個或多個步驟。通 常，運設(shè)及在用于溫育和/或洗涂步驟的緩沖液(例如，脫脂奶，或血清白蛋白）中與過量的 非特異性蛋白溫育。
[0083] ELISA可W通過如下進一步優(yōu)化:調(diào)整其試劑和過程步驟，諸如溫育步驟的溫度和 持續(xù)時間；用于固定化或用于檢測的抗體或抗原的特異性和種類;應(yīng)用的固定化的量和方 法;和所用的溫育和洗涂緩沖液的組成。
[0084] 酶免疫測定的一般參考文獻存在于各種出版物中，尤其是標準實驗室教科書，諸 女日：'The Immunoassay Handbook (第4片反：Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques'； D. G. Wild edt., 2013, ISBN-10: 0080970370);和：'The ELISA 加 idebook' （Methods in Molecular Biology, vol. 149， J. R. Crowther, Humana Press, 2000，ISBN-10:0896037282)。替代品是供應(yīng)商的手冊， 諸如："Technical guide for ELISA", Κ化 Inc., Gaithersburg, MD, USA, 2013;和： Eli Lilly &Co.的"Assay guidance manual"，章節(jié)：Immunoassay methods, K.Cox等人， 2012年5月。
[0085] 在一個進一步優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的化ISA基本上類似于CSFV E2抗體的商業(yè) ELISA，例如：PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 ELISA，W前命名為Ceditest? CSFV 2.0 ELISA， 均購自Prionics AG (Schlieren-Zurich, Switzerland),或IDEXX CSFV Ab測試，購自 IDEXX Europe B.V.巧oofddo;rp, The Netherlands)。在運方面，'基本上類似的'是指用 于運些商業(yè)測試的方案和材料。
[0086] 也可W設(shè)計本發(fā)明方法的可替代方案。例如，可W基于本領(lǐng)域中熟知的A1地aLISA 測試的方案的特征設(shè)置本發(fā)明方法。在此類測試中，不需要洗涂步驟，而可W手動進行測 定，優(yōu)選自動化的A1地aLISA。
[0087] AlphaLISA方案的特征是，抗原(運里:包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的載體)和抗 體(運里:CSFV E2的TAVSPTTLR表位特異性的（單克?。┛贵w)結(jié)合載體珠，可通過發(fā)光檢測 它們的結(jié)合。
[008引包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的載體可W例如生物素化，并固定在抗生物素蛋白 包被的受體珠上，并與綴合至供體珠的抗體一起使用。此類AlphaLISA測試中的一個步驟然 后包括共溫育用包含CSFV E2的TAVSPrrLR表位的載體包被的受體珠與測試樣品和包含 CSFV E2的突變的TAVSPT化R表位的載體。周圍的其他方法（包含包被CSFV E2的突變的 TAVSPTTLR表位的載體），或中間形式(從而包被兩種載體），是同樣可行的。下一步驟然后可 w是與抗體包被的供體珠溫育，最后讀出結(jié)果。
[0089] 因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，檢測是通過具有A1曲aLISA?的特征的診 斷測試。
[0090] 本發(fā)明方法對于測試來源于易受CSFV感染的動物的樣品是最有利的。運些是豬科 的各種動物。
[0091] 因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，測試樣品來源于豬類動物。
[0092] 對于本發(fā)明，"豬類"是指豬科的動物，并且優(yōu)選是指豬屬(Sus屬）的動物，例如:野 生豬或家豬、豬（3￥；[]1日）、闡豬化0旨）、野豬、鹿豚化日13；[1'113日)或痛豬(>日1'1110旨）。運也包括設(shè) 及它們的性別或年齡的任意名稱所指明的豬類諸如:母豬、公豬、闡豬化Og)、小母豬、斷奶 豬或仔豬。
[0093] 本發(fā)明方法的一種進一步有利的應(yīng)用是測試已經(jīng)用CSFV標記疫苗針對CSFV接種 疫苗的豬類動物的樣品。
[0094] 如所熟知，并且如上所述，標記疫苗中的抗原在抗原性上不同于作為其基礎(chǔ)的野 生型抗原，例如，與野生型版本相比，缺乏表位，或具有不同版本的表位。通常地，標記疫苗 中的抗原已經(jīng)通過生物化學(xué)或重組DNA技術(shù)改變或修飾，結(jié)果是，針對標記疫苗的修飾抗原 的抗體應(yīng)答可W與針對未修飾的野生型抗原的抗體應(yīng)答區(qū)分開。運將允許血清學(xué)"區(qū)分感 染的動物與接種疫苗的動物"或:DIVA。
[00M]因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，測試樣品來源于已經(jīng)用CSFV標記疫苗針 對CSFV接種疫苗的豬類動物。
[0096] 當CSFV(標記）疫苗包含作為CSFV抗原的通過CSFV E2的TAVSP化LR表位中的突變 而不同于野生型E2的CSFV E2蛋白時，本發(fā)明方法的一個特別有利的應(yīng)用變得明顯。如上所 述，在用此類疫苗接種疫苗的動物的樣品中，當使用現(xiàn)有的CSFV抗體的診斷測試時，發(fā)現(xiàn)假 陽性評分。但是，本發(fā)明方法僅顯示真陽性評分。運對于豬養(yǎng)殖的獸醫(yī)健康和經(jīng)濟學(xué)具有重 大意義。
[0097] 因此，在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，測試樣品獲自已經(jīng)用包含CSFV E2蛋 白（包含突變的TAVSPTTLR表位)的CSFV疫苗針對CSFV接種疫苗的豬類動物。
[009引如上所述，原則上，CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的許多形式可W想象用于本 發(fā)明方法中的共溫育。但是，在共溫育中采用的CSFV E2的突變的TAVSPT化R表位與標記 CSFV疫苗中的表位相同的情況下，該方法是最有利的。
[0099] 因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，用于本發(fā)明方法中的共溫育中的載體中 包含的CSFV E2的突變的TAVSPT化R表位與CSFV標記疫苗的CSFV E2蛋白中存在的突變的 TAVSPTTLR表位是相同的。
[0100] 進一步考慮適用于CSFV標記疫苗中的CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位:該疫苗必 須仍然能夠誘導(dǎo)目標動物中針對CSFV的有效免疫應(yīng)答，盡管存在TAVSPTTLR表位的突變。
[0101] 對于本發(fā)明，在一方面用于對本發(fā)明方法中待測試的測試樣品來源的動物接種疫 苗的CSFV標記疫苗中的CSFV E2的突變的TAVSPT化R表位和另一方面用于本發(fā)明方法中的 共溫育中的載體中包含的CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位之間優(yōu)選存在匹配。
[0102] 因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，用于共溫育中的載體中包含的CSFV E2的 突變的TAVSPTTLR表位與用于對獲得測試樣品的豬類動物接種疫苗的CSFV疫苗的CSFV E2 蛋白中包含的突變的TAVSPTTLR表位是相同的。
[0103] 技術(shù)人員完全能夠確定哪些突變的TAVSPTTLR表位允許包含含有此類突變表位的 CSFV E2蛋白的CSFV標記疫苗是有效的免疫原。
[0104] 例如通過監(jiān)測接種疫苗后或攻擊感染后的免疫應(yīng)答，例如通過監(jiān)測目標的疾病的 臨床體征，臨床評分，血清學(xué)參數(shù)，或通過病原體的重新分離，且將運些結(jié)果與模擬接種疫 苗的動物中看到的應(yīng)答進行比較。
[0105] 注：由于CSFV是高度感染性的，并且在許多國家是通報感染病，可能含有感染性 CSFV(無論是野生型或減毒的）的樣品的任何實驗室或畜牧業(yè)用途必須用與國家或國際指 南一致的適當?shù)纳锇踩A(yù)防措施進行。
[0106] 包含可W與用于本發(fā)明方法中的共溫育中的包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表 位的載體匹配的具有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗的實例是本領(lǐng)域中 已知的，且如上所述。例如從Kcxrtekaas等人（2010，同上）；一個實例是被稱為vFlc-Δ PTal 的突變CSFV,其具有包含氨基酸序列為TAGSTLRTE的突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白， 如表示為沈Q ID NO:2。
[0107] 另一個實例來自Reimann等人（2010,同上）：被稱為pA/CP7_EW2alf_TLA的突變 〇5尸￥，其具有包含氨基酸序列為化4^(0化4(如表示為569 10^:3)的突變的了4￥5?1'化尺表 位的CSFV E2蛋白。
[0108] 因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，用于共溫育中的載體中包含的CSFV E2的 突變的TAVSPTTLR表位具有氨基酸序列:TAGSTLRTE (沈Q ID NO: 2)。
[0109] 在本發(fā)明方法的一個可替代實施方案中，用于共溫育中的載體中包含的CSFV E2 的突變的TAVSPTTLR表位具有氨基酸序列:TLANKDTLA (沈Q ID N0:3)。
[0110] 在一個進一步實施方案中，本發(fā)明的測試樣品來源于已經(jīng)用如Kortekaas等人 (2011，同上）中所述的CSFV疫苗、諸如基于如上所述的被稱為vFlc-APTal的突變CSFV的疫 苗接種疫苗的豬類動物。
[0111] 因此，在本發(fā)明方法的一個進一步實施方案中，所述CSFV疫苗基于vFlc-APTal病 〇
[0112] 對于本發(fā)明方法中使用所述的載體的兩個不同的實施方案是:用于固定化到固相 的包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的載體，和用于共溫育的包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR 表位的載體。運些載體可W具有不同的形式，并且突變型表位和野生型TAVSPTTLR表位的載 體可W是相同或不同的類型；它們也可W是單獨的，或者可W是相同的實體，例如一種包含 兩種類型的TAVSPTTLR表位的載體。
[0113] 在本發(fā)明方法的一個實施方案中，包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體， 或包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體，是蛋白，或者兩種載體是蛋白。
[0114] 運些蛋白可W是相同的或不同的。
[0115] 在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載 體，或包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體，是CSFV E2蛋白，或者兩種載體是CSFV E2蛋白。
[0116] 除了具有野生型或突變的TAVSPTTLR表位W外，CSFV E2蛋白載體的剩余部分也可 W氨基酸序列不同；CSFV E2的幾個實例已經(jīng)描述于文獻中，并且它們的序列可W從公共數(shù) 據(jù)庫諸如GenBank?得到。
[0117] 當包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體是CSFV E2蛋白時，運為從測試樣 品檢測抗CSFV抗體提供了最佳機會。
[011引類似地，當包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體是CSFV E2蛋白時，運為捕 獲動物測試樣品中可存在且可另外導(dǎo)致假陽性結(jié)果的任何交叉反應(yīng)性抗體提供了最佳機 會。運是因為CSFV E2蛋白將提供最接近于此表位的天然形式的CSFV E2的突變的 TAVSPTTLR表位的3D表示。
[0119] 因此，在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，兩種載體都是完整成熟CSFV E2蛋 白。
[0120] 但是，如本領(lǐng)域中已知，C-末端跨膜區(qū)，和實際上E2的C末端一半，對于結(jié)合抗體不 那么相關(guān)（van Rijn等人，1994, J. of Virology, vol. 68, P. 3934;化ang等人， 2010, Virus Res.，vol. 149，p. 183)。因此，在本發(fā)明方法的背景下，技術(shù)人員將完全 能夠開發(fā)和優(yōu)化本發(fā)明的檢測野生型CSFV抗體的方法，在其中任一載體或無一載體是完整 成熟E2蛋白，而是其部分，條件是（突變的）TAVSPTTLR表位本身仍然存在，其仍然允許很好 檢測野生型CSFV抗體，并且很好減少假陽性評分。
[0121] 在本發(fā)明方法中使用CSFV蛋白或其部分作為包含CSFV E2的（突變的）TAVSPTTLR 表位的載體可W通過改變共溫育的量和條件來進一步優(yōu)化。例如，本發(fā)明人已在熟知的桿 狀病毒表達載體系統(tǒng)中表達具有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白，純化蛋白，并且使 用重組表達的E2蛋白對于共溫育測定。
[0122] 可W評價表達的E2蛋白的純度和量，例如通過SDS-凝膠電泳、蛋白染色和通過光 密度測定的定量。一種可替代方法是在E1 i sa中使用結(jié)合E2的抗體、通過除了 TAVSPTTLR W 外的另一表位和已知濃度的參考樣品進行定量。
[0123] 取決于蛋白的純度，選擇包含（突變的）TAVSPTTLR表位的E2蛋白的量，W獲得野生 型CSFV抗體的最佳檢測，同時最佳減少假陽性評分。如本文所例舉，96孔微量滴定板的每孔 通常地需要小于2 pg E2蛋白。每孔1 yg或甚至0.5 yg的量也是有效的。
[0124] 如上所述，野生型CSFV抗體的現(xiàn)有的商業(yè)診斷測試已經(jīng)基于用于確定它們的特異 性和特異性概況的大量測試數(shù)據(jù)確立其可靠性。運通過國際認可的標準陽性和陰性參考樣 品的集合來維持。在測定和參照樣品的運種組合中的置信度是它們的銷售授權(quán)和它們在用 此類測定測試的動物的政府控制的出口認證中的用途的基礎(chǔ)。
[0125] 為了使本發(fā)明方法實現(xiàn)用此類確立測定法的參考值和現(xiàn)有測試評分充分整合，可 W進行測試方案的進一步改變。具體地，可W改變測定方案中的溫育條件W在共溫育步驟 中容納其它組分，其中引入CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位。
[0126] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如果不調(diào)整所述步驟的溫育條件，本方法發(fā)明在減少假陰性評 分中仍然是有功能的，并且是高度有效的；但是，當使用本發(fā)明方法測試建立的標準樣品 時，然后獲得的精確0D評分可W不同于先前那些標準(或高或低）的結(jié)果。運是因為加入其 它化合物可能需要將一定體積的液體加入溫育混合物，運可導(dǎo)致溫育緩沖液和其可包括的 組分(諸如鹽類、穩(wěn)定劑、去污劑或阻斷劑)的稀釋，導(dǎo)致與標準評分的偏差。
[0127] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明方法包括改變包括與包含CSFV E2的突變的 TAVSPTTLR表位的載體共溫育的步驟的溫育條件W適應(yīng)于加入所述載體。
[012引有幾種可W進行運種"改變"的方式。最直接的方式是將包含含有CSFV E2的突變 的TAVSPTTLR表位的載體的溶液納入本發(fā)明方法中使用的溫育緩沖液中，由此溫育緩沖液 的濃度與該方法中使用的其最終濃度相比增加。例如，當合并等體積的包含含有CSFV E2的 突變的TAVSPTTLR表位的載體的溶液和溫育緩沖液時，然后可W提供溫育緩沖液作為其最 終使用的2x濃度的儲備溶液。也可需要校正包含含有CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載 體的溶液中已經(jīng)存在的任何鹽或緩沖劑。此原則容易適應(yīng)于其他體積比和相應(yīng)濃度的溫育 緩沖液儲備溶液。
[0129] 可選地，可W提供溫育緩沖液的即用預(yù)混合溶液，所述溫育緩沖液已經(jīng)包含含有 CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體，其中所述溫育緩沖液為其最終使用濃度。
[0130] 前面實例依賴于在溶液中提供包含CSFV E2的突變的TAVSPrrLR表位的載體。但 是，由于運可能對于蛋白的穩(wěn)定性不是最佳的，替代方案是鄰近于最終使用濃度的溫育緩 沖液的容器的冷凍干燥形式的單獨容器中提供包含CSFV E2的突變表位的蛋白。當然后在 使用之前不久用溫育緩沖液重構(gòu)蛋白時，運不影響蛋白的穩(wěn)定性，并且所述重構(gòu)不（顯著） 改變溫育緩沖液的濃度。
[0131] 技術(shù)人員將能夠設(shè)計和優(yōu)化其他組合W獲得類似溶液。
[0132] 如所描述，應(yīng)用本發(fā)明方法的一種有利方式是通過使用診斷測試試劑盒，其包含 應(yīng)用所述方法所需的各種組分。
[0133] 因此，本發(fā)明的一個進一步方面設(shè)及用于實施本發(fā)明方法的診斷測試試劑盒。
[0134] 對于本發(fā)明，"診斷測試試劑盒"設(shè)及用于執(zhí)行本發(fā)明方法的部件試劑盒。所述試 劑盒包含用于執(zhí)行所述方法的一種或多種組分，具體地：固定化到固相的包含CSFV E2的 TAVSPTTLR表位的載體，和包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體。運些應(yīng)該W方便形 式和容器中出現(xiàn)，任選具有用于樣品稀釋和溫育、封閉或洗涂的緩沖液，并且任選具有如何 執(zhí)行所述方法和如何閱讀和解釋結(jié)果的說明書。
[0135] 在一個實施方案中，所述試劑盒可W包含具有多個孔的容器，諸如微量滴定板。容 器的孔可W經(jīng)處理W含有用于本發(fā)明方法中使用的一種或多種組分。
[0136] 在本發(fā)明的診斷測試試劑盒的一個優(yōu)選實施方案中，將具有TAVSPT化R表位的 CSFV E2蛋白固定化到微量滴定板的孔。
[0137] 本發(fā)明的診斷測試試劑盒任選包含的說明書，例如可W寫在含有試劑盒的成分的 盒上;可W存在于該盒中的小冊子上；或者可W是在試劑盒的經(jīng)銷商等的因特網(wǎng)網(wǎng)站上可 見或可下載。
[0138] 對于本發(fā)明，診斷測試試劑盒也可W是所述部件的提供(設(shè)及商業(yè)銷售），例如在 因特網(wǎng)網(wǎng)站上，用于在包含本發(fā)明方法的測定法中組合使用。
[0139] 在一個實施方案中，本發(fā)明的測試試劑盒可W基于野生型CSFV E2抗體的已知商 業(yè)測試試劑盒之一，即，與PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 (Prionics)或IDEXX CSFV Ab Test ? (IDEXX)基本相同，其經(jīng)修改W適應(yīng)于與其他組分共溫育。該修改可設(shè)及經(jīng)修改的用戶 說明書，W提供共溫育的說明書。此外，所述試劑盒可W額外提供包含冷凍干燥的制備物的 容器，所述冷凍干燥的制備物包含含有CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體，其再懸浮 于例如溫育緩沖液中?？蛇x地，所述測試試劑盒可W包含含有濃度高于其最終使用濃度的 溫育緩沖液的儲備溶液的容器，和包含含有載體(其包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位） 的溶液的容器，所述溶液與溫育緩沖液儲備溶液一起用于共溫育中。技術(shù)人員可設(shè)想并入 本發(fā)明的診斷測試試劑盒的組分的幾個其他實施方案。因此，此類實施方案落入本發(fā)明的 范圍之內(nèi)。
[0140] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的檢測試劑盒包含容器，所述容器包含含有CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體。
[0141] 在一個進一步方面，本發(fā)明設(shè)及包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體用于 本發(fā)明方法中或本發(fā)明的診斷測試試劑盒中的共溫育的用途。
[0142] 此類用途提供了動物測試樣品、特別是來自已經(jīng)用包含CSFV E2蛋白（包含突變的 TAVSPTTLR表位)的CSFV疫苗針對CSFV接種疫苗的動物的樣品中的野生型CSFV抗體的檢測。 此用途提供了如上所述的任何假陽性評分的減少。
[0143] 在一個實施方案中，本發(fā)明的用途設(shè)及使用包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位 的載體。所述載體優(yōu)選為蛋白，所述蛋白優(yōu)選為CSFV E2蛋白，所述CSFV E2蛋白優(yōu)選為完整 成熟蛋白。
[0144] 本發(fā)明的檢測方法的一種進一步有利的應(yīng)用是其應(yīng)用于CSFV接種疫苗和檢測的 DIVA方法。運允許區(qū)分針對CSFV接種疫苗的動物和被CSFV感染的動物。只有用本發(fā)明方法， 并且隨后消除假陽性分數(shù)，該方式的血清學(xué)區(qū)分是可能的，此時接種疫苗是通過使用包含 含有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的針對CSF的疫苗。
[0145] 因此，在一個進一步方面，本發(fā)明設(shè)及用于區(qū)分被野生型CSFV感染的動物和用 CSFV疫苗（其中所述疫苗包含含有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白）針對CSFV接種疫 苗的動物的方法，并且所述方法包括使用本發(fā)明的檢測方法，或者包括使用本發(fā)明的診斷 測試試劑盒。
[0146] 本發(fā)明的區(qū)分方法是使用如上所述的動物測試樣品的體外診斷方法。技術(shù)人員將 意識到，本發(fā)明的區(qū)分方法因此包括所研究的測試樣品的診斷評分中的結(jié)果。具體地，CSFV E2蛋白抗體的檢測，通過它們的存在或不存在，或它們的絕對值水平，或與對照樣品的值相 比的相對值。
[0147] 方法的輸入值是來自受試者的測試樣品；所述受試者優(yōu)選為豬類動物;所述測試 樣品優(yōu)選為血液樣品，更優(yōu)選血清或血漿的樣品。
[0148] 為了最終區(qū)分感染的動物和接種疫苗的動物，測試評分需要被解釋為陽性或陰 性;在實踐中，運意味著:高于或低于特定闊值。運可W通過向測試中在測試樣品旁邊并入 許多標準參考樣品而方便地進行。運描述于實施例中。陽性和陰性參考樣品可W在動物中 制備，或者可W獲自幾個機構(gòu)和參考實驗室，例如在University of veterinary medicine, Hannover, Germany的CSF的Community Reference Laboratory。
[0149] 將測試樣品評分為陽性、陰性或懷疑之后，可W將其外推為將獲得測試樣品的供 體動物診斷為關(guān)于野生型CSFV的感染陽性、陰性或懷疑野生型CSFV的感染。
[0150] 在動物被診斷為陽性(或懷疑）的情況下，然后與管理規(guī)則一致，所述動物可W通 過接種疫苗和/或留出檢疫而進行治療，或者W負責任的方式進行撲殺。
[0151] 因此，在本發(fā)明的區(qū)分方法的一個實施方案中，所述方法還包括選自W下的一個 或多個步驟： -獲得測試樣品的步驟 -通過與陽性和陰性參考樣品的結(jié)果比較而解釋獲得的測試結(jié)果的步驟。 -將獲得的樣品測試結(jié)果與預(yù)定的截止值比較的步驟， -將樣品評分為含有針對野生型CSFV的抗體陽性、陰性或懷疑含有針對野生型CSFV 的抗體的步驟， -將樣品供體診斷為野生型CSFV的感染陽性、陰性或懷疑被野生型CSFV感染的步驟， -基于診斷野生型CSFV的感染的陽性或懷疑結(jié)果，通過接種疫苗、檢疫和/或撲殺而 (推薦)處理樣品供體的步驟。
[0152] 在一個或多個優(yōu)選實施方案中，所述樣品是血清樣品，或:所述測試結(jié)果是化ISA 抑制百分率的評分。
[0153] 在一個優(yōu)選實施方案中，測試樣品來源于已經(jīng)用包含CSFV E2蛋白（包含突變的 TAVSPTTLR表位)的CSFV疫苗針對CSFV接種疫苗的豬類動物。
[0154] 在一個可替代方面，本發(fā)明設(shè)及診斷CSFV感染的體外方法，所述方法包括使用本 發(fā)明的檢測方法，或包括使用本發(fā)明的診斷測試試劑盒，并且其中就陽性和陰性參考樣品 的評分而言確定針對野生型CSFV的抗體的存在。
[0155] 在本發(fā)明的一個進一步方面，本發(fā)明的檢測方法，或本發(fā)明的診斷測試試劑盒，用 于根治CSFV疾病，或者在國家監(jiān)控計劃中，作為與用CSFV疫苗接種疫苗一起的伴侶診斷法。
[0156] 用此組合，可W應(yīng)用CSFV的DIVA方法，其允許區(qū)分感染的動物和接種疫苗的動物。
[0157] 因此，在一個進一步方面，本發(fā)明設(shè)及通過組合使用包含含有突變的TAVSPTTLR表 位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗和本發(fā)明的診斷測試試劑盒而控制豬類動物群體中野生型 CSFV感染的方法。
[0158] 由于本發(fā)明提供了假陽性評分的強烈減少，來自接種疫苗的動物的(血清)樣品現(xiàn) 在可W可靠地鑒定為針對野生型CSFV的抗體陰性。只有真陽性動物需要被挑出來，并在監(jiān) 控、撲殺或根治計劃的背景下進行適當?shù)目刂坪蜋z疫措施。
[0159] 因此，運種組合使用CSFV疫苗和診斷方法允許用結(jié)構(gòu)化的基于疫苗的CSFV根治計 劃代替不期望且非常昂貴的撲殺政策，從而減少動物痛苦和經(jīng)濟成本。
[0160] "豬類動物群體"可被認為在本地(農(nóng)場）、區(qū)域或者甚至在國家水平的組群。"組合 使用"的細節(jié)和方案將取決于為待施用的特定(標記)CSFV疫苗開出的接種疫苗方案。組合 使用的表現(xiàn)還將取決于篩選的要求和理由，或甚至取決于可能需要遵守的特定政府法規(guī)。 [0161 ] -些實例:在常規(guī)接種疫苗的情況下，豬將在幼齡針對CSFV接種疫苗一次或兩次， 并且例如每年接受加強接種疫苗。無論何時懷疑發(fā)生野生型CSFV感染，都可W測試運些動 物?？蛇x地:已經(jīng)接種疫苗的意在用于出口的豬，可W在它們的預(yù)期出口日期前不久進行測 試。同樣:在懷疑CSFV感染的情況下或在CSFV爆發(fā)的情形下，可W在數(shù)周、可能甚至數(shù)天的 短時間間隔內(nèi)執(zhí)行接種疫苗和測試。技術(shù)人員可想到的運些和其他實施方案都在本發(fā)明的 范圍之內(nèi)。
[0162] 在實踐中，當樣品被評分為野生型CSFV抗體陽性或陰性時，可W通過重新測試來 自相同目標、但來自不同時間點的樣品，或者通過測試來自相同畜群或區(qū)域的其他動物來 獲得確認?；蛘?，可W使用不同的技術(shù)，和不同類型的樣品，例如通過經(jīng)由病毒中和測定檢 測血液、組織、鼻拭子或糞便中的病毒，或通過檢測病毒核酸(例如通過PCR)來確認結(jié)果。
[0163] 本發(fā)明現(xiàn)在將通過W下非限制性實施例進一步描述。 實施例
[0164] 實施例1:豬樣品的測試: 1.1.測試樣品： 實施例1中使用的測試樣品從Central VeterinaiT Institute化elystad, the 化therlands)獲得，并且在Kodekaas等人，2011(同上）中描述。簡而言之：8周齡血清陰 性豬用活CSFV疫苗接種疫苗:基于C-毒株或vFlc-APTal病毒。在數(shù)周始終取血液樣品。制 備血清用于測試。在接種疫苗后28天，用野生型CSFV攻擊感染動物。
[01化]1.2.現(xiàn)有技術(shù)ELISA測試： 如Kodekaas等人，2011 (同上)所述，獲得的豬血清使用商業(yè)化ISA:PrioC肥CK ? CSFV Ab 2.0 (Prionics)進行測試。運根據(jù)制備商的說明書進行，簡而言之:使用預(yù)包被的微量 滴定板，并且分配試劑盒的樣品緩沖液。將對照樣品加入特定孔中，將測試樣品（豬血清)加 入其他中。接著將板溫育，洗涂，并分配綴合物。再次溫育并洗涂板，最后加入顯色試劑，溫 育，然后終止。接著通過測量0D讀板。基于陽性標準計算化ISA抑制的百分比。結(jié)果作為比較 的結(jié)果描述于圖1中，基本上重復(fù)了Kcxrtekaas等人，2011(同上）的圖4A。對于此化ISA，正/ 負分離的闊值為40%抑制。
[0166] 從運些結(jié)果明顯可知：C-毒株接種疫苗的豬的血清樣品（虛線），W及用vFlc-Δ PTal病毒標記疫苗接種疫苗的豬的樣品（實線），都隨著時間推移陽性響應(yīng)；即，誘導(dǎo)40%或 更多的抑制。因此，在用C-毒株疫苗或用標記CSFV疫苗（即vFlc-APTal病毒)接種疫苗的動 物之間不能進行明確的區(qū)分。
[0167] 1.3.現(xiàn)有技術(shù)樣品的重新測試： 然后使用CSFV E2抗體的不同商業(yè)化ISA:IDEXX CSFV Ab Test? (IDEXX)，根據(jù)制備 商的說明書和與上述Prionics ELISA基本上相同的方案重新測試Kodekaas等人的運些血 清樣品。
[0168] 結(jié)果描述于圖1B，并且灰色水平條表示在此測定中的正/負分離的闊值，由此：陰 性為30%或更少的抑制；陽性為40%或更多的抑制;30和40%抑制之間的得分是可疑樣品。 其中抑制水平為負值的結(jié)果表示0D值高于陰性對照的0D值的樣品。運些可W被認為是零％ 抑制值。
[0169] 如從圖明顯可知且與Prionics ELISA中的結(jié)果類似，幾乎所有樣品都隨著時間推 移陽性反應(yīng)；只有一種標記接種疫苗(豬編號3161)保持完全陰性。來自豬編號3163和3164 的兩個樣品在接種疫苗后42或49天得到尖峰值，運可能與攻擊反應(yīng)相關(guān);樣品不能針對材 料缺少進行重新測試。
[0170] 1.4. E2蛋白 從C-毒株的CSFV病毒和vFlc-APTal病毒的E2基因產(chǎn)生E2蛋白，其用于本發(fā)明的方法 的共溫育。首先，針對桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)中的表達對它們的E2基因的核巧酸序列 進行密碼子優(yōu)化，同時只使用沉默突變。接著，根據(jù)優(yōu)化的序列化學(xué)合成DNA并克隆入 pFastBac ?質(zhì)?；痠fe technologies)中的多角體蛋白啟動子的后面。通過位點特異性轉(zhuǎn) 位將表達盒轉(zhuǎn)移入重組桿粒DNA，并在DHlOBac感受態(tài)大腸桿菌感受態(tài)細菌中擴增。接著，分 離桿粒DNA，并用于轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞。使用從轉(zhuǎn)染上清液獲得的重組桿狀病毒W(wǎng)感染新鮮 的Sf9昆蟲細胞。分離并使用桿狀病毒感染W(wǎng)感染在2L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的Sf21昆蟲細胞。 在運些生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中表達兩種E2蛋白，主要在上清液中。將其收獲，并且在 Sepharose柱上通過親和柱色譜分離E2蛋白，所述Se地arose柱已經(jīng)偶聯(lián)TAVSPTTLR表位特 異性單克隆抗體。從柱收集純化的E2蛋白，并通過抑制化ISA定量。
[0171] 使用SDS-凝膠電泳，標準表達和純化的E2蛋白：觀察到約80kDa的單一條帶，純度 為約80%。然后在化ISA中鄰近于標準樣品定量E2。重組表達的具有突變的TAVSPTTLR表位 的CSFV E2蛋白可W常規(guī)地獲得為約800 pg/ml的純化的儲備溶液。
[0172] 1.5.通過本發(fā)明的方法檢測 對上述Kodekaas等人，2011 (同上)應(yīng)用本發(fā)明的檢測測試樣品中的野生型CSFV的抗 體的方法。
[0173] 該方案很大程度上基于IDEXX ELISA的方案，除了共溫育。簡而言之：根據(jù)制備商 的說明書使用IDEXX CSF Ab測試試劑盒，一個例外是：用2x濃縮的版本替換試劑盒的標準 樣品稀釋液。然后將25μ1(即，測試試劑盒的方案中規(guī)定的體積的一半)的此2X樣品稀釋液 在Ε2包被的孔中與50μ1血清樣品和25 桿狀病毒表達的具有突變的TAVSPTTLR表位的 CSFV E2蛋白的溶液共溫育，使得每孔存在約1 pg E2。
[0174] 運些共溫育中使用的具有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白是vFlc-APTal疫 苗病毒中包含的E2。
[0175] 獲得的結(jié)果描述于圖1C中，并且立即例舉說明與沒有共溫育的相同測定的結(jié)果 (圖1B);或與沒有共溫育的類似測定的結(jié)果（圖1A)的差別。C-毒株接種疫苗的豬的所有樣 品都陽性反應(yīng)，而標記接種疫苗的豬的所有樣品都陰性反應(yīng)。沒有發(fā)現(xiàn)加強接種疫苗的效 果，并且甚至對于豬編號3163和3164觀察到的尖峰值低于闊值。W此方式，有效的DIVA測試 最終對于活減毒CSFV疫苗是可能的！ 當使用野生型CSFV的E2蛋白用于共培育(運里不介紹）重復(fù)此實驗時，結(jié)果是完全不同 的:所有樣品評分為陰性，甚至是C-毒株接種疫苗的豬的樣品。因此，運不是有用的替代方 案。
[0176] 還在PrioC肥CK? CSFV Ab 2.0 ELISA (Prionics)的基本方案中引入共溫育。觀 察到基本上相同的結(jié)果:假陽性結(jié)果的非常有效的減少，只留下評分為陽性的真陽性樣品 (此處為:高于40%的化ISA抑制）。
[0177] 1.6.來自現(xiàn)有技術(shù)樣品的重新測試的結(jié)果的概述 表1中組裝上述實驗的結(jié)果。運表明，來自Kodekaas 2011 (同上)實驗的接種疫苗的動 物將接受的分類，當被測試為CSFV抗體陽性/懷疑具有CSFV抗體時，是不同的，運取決于將 應(yīng)用哪種檢測E2抗體的方法?？蒞明顯看出，僅通過使用與包含CSFV E2的突變的 TAVSPTTLR表位的載體共溫育，用包含突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗接 種疫苗的動物可W與野生型CSFV感染-或C-毒株接種疫苗的動物明確區(qū)分。
[0178] 表1:使用不同的檢測CSFV E2抗體的方法評分為懷疑具有CSFV抗體或CSFV抗體 陽性的來自Kodekaas 2011實驗的動物的數(shù)量。
[0179] 實施例2:建立測試特異性和靈敏性 為了確定本發(fā)明方法的特異性和靈敏性與標準商業(yè)CSFV E2抗體化ISA的特異性和靈 敏性至少相當，使用本發(fā)明方法之一測試大量樣品（約900份）。樣品由collection of the Virology Division, Central Veterinary Institute, Lelystad,荷蘭的W丄.Loeffen 博±提供，并且包括一組來自荷蘭的超過400份CSFV陰性野外豬血清，一組在幾周內(nèi)取樣的 來自實驗CSFV感染的豬的超過400份樣品，和一組混合來源的約80份豬血清樣品；運最后一 組含有來自針對BVDV接種疫苗的豬或被CSFV感染的豬W及被BVDV或抓V毒株感染W(wǎng)及具有 一些混合感染的豬的陽性和陰性血清。
[0180] 對于本發(fā)明方法的應(yīng)用，使用IDEXX CSF Ab測試試劑盒的方案和材料、使用預(yù)包 被的板、陽性和陰性對照樣品、A18單克隆抗體綴合物、顯色反應(yīng)底物、終止溶液和洗涂溶液 測試所有樣品。唯一偏差是在于樣品稀釋液被替換為該稀釋劑的2x濃縮形式，其W根據(jù)測 試方案的體積的一半使用；體積的另一半通過加入包含具有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白（即，vFlc-APTal病毒中包含的E2蛋白）的溶液來提供。一式兩份測試對照樣品，單 次測試測試樣品。
[0181] ELISA抑制結(jié)果的解釋與商業(yè)化ISA是相同的：陰性為30%或更少的抑制；陽性為 40%或更多的抑制;30和40%抑制之間的得分是可疑樣品。
[0182] 2.1. CSFV陰性野外樣品： 陰性野外血清組通常評分為-20至0% ELISA抑制。結(jié)果描述于圖2中。413份樣品的平 均評分為:-11 % ± 5.2 %。運與預(yù)期一致:所有樣品評分遠低于懷疑/陽性的闊值(30% ELISA抑制），并且用于檢測的方法和用于區(qū)分的方法(均根據(jù)本發(fā)明）的使用沒有從真陰性 樣品產(chǎn)生任何假陽性評分。
[0183] 2.2. CSFV陽性實驗樣品： 隨著時間推移采集的一組超過400份CSFV陽性樣品的分析證明了本發(fā)明方法的靈敏度 是優(yōu)異的。結(jié)果表示于圖3中，并且顯示特別是在感染后早期，本發(fā)明方法提供運樣的結(jié)果， 與商業(yè)CSFV E2抗體化ISA相比，其允許更多樣品被歸類為陽性，更少的樣品被歸類為懷疑 或陰性。運在感染后14天最突出，并且在感染后21天還有點如此。
[0184] 因此，運證明了本發(fā)明方法在正確地檢測真陽性中的靈敏度至少與商業(yè)CSFV E2 抗體化ISA的靈敏度一樣好，或者相反不同放置:將共溫育引入現(xiàn)有的CSFV E2抗體化ISA的 一個步驟沒有損害測試的靈敏度。
[01化]2.3.混合樣品： 使用本發(fā)明方法測試一組各種類型的約80份樣品，W便將結(jié)果與來自標準商業(yè)化ISA 的結(jié)果進行比較。各種樣品來自被稱為'Erns workshop'、乂SFV抓參考實驗對象組'和CVI Lelystad內(nèi)部'攝病毒參考實驗對象組'的實驗對象組。
[0186]樣品和它們的代碼與來自使用本發(fā)明方法(在列中表示為'本發(fā)明'）或使用商業(yè) CSFV E2抗體化ISA(在列中表示為'商業(yè)'）的檢測抗CSFV E2抗體的結(jié)果一起列于表2中。具 有樣品編號的列僅用于參考目的:樣品1 - 54是來自被CSFV的不同毒株感染或針對CSFV接 種疫苗的動物的野外樣品的血清;樣品在不同的感染后天數(shù)(dpi)或接種疫苗后天數(shù)(dpv) 采集;樣品55-60是真陰性;樣品編號61 -67是來自BVDV感染的血清;樣品68來自抓V感染;且 樣品69-76來自混合感染。
[0187] 結(jié)果表示為百分比化ISA抑制評分，并且根據(jù)商業(yè)化ISA的評分表進行分類。
[0188] 如從表2中的結(jié)果明顯可知，對于測試的絕大多數(shù)樣品，使用本發(fā)明方法獲得的結(jié) 果得到化ISA抑制百分率的評分，具有比商業(yè)化ISA更高區(qū)分度。在只有兩種情況下，與商業(yè) ELISA相比，使用本發(fā)明方法的結(jié)果W陰性方式偏離:樣品23和75。不知道運些是否是測試 表現(xiàn)中的誤差。因此，對于CSFV E2抗體，本發(fā)明方法至少與商業(yè)化ISA-樣靈敏。
[0189] 運可W具有明顯的后果，因為對于幾種樣品，商業(yè)化ISA和本發(fā)明方法產(chǎn)生了不同 的分類。實例是：樣品編號8、25、28、38和45，運被商業(yè)化154歸類為'懷疑'具有〔5。￥62抗 體，但本發(fā)明方法將需要歸類為CSFV E2抗體'陽性的'。類似地，樣品編號37將需要分類從 陰性變?yōu)閼岩伞?br>[0190] 對于只有兩種樣品，編號23和75,本發(fā)明方法的結(jié)果是陰性的，而商業(yè)E2抗體 ELISA的評分是陽性的。在任一測定中的實驗誤差可能是原因。
[0191] 表2:混合樣品集合中CSFV E2抗體的檢測結(jié)果，其表示為化ISA抑制百分比。
[0192]
【附圖說明】 圖1: 通過Kodekaas等人，2011(同上)描述的樣品中的CSFV E2抗體的阻斷化ISA的分析結(jié) 果:比較的是通過標準商業(yè)測定的分析和通過本發(fā)明方法的分析。
[0193] 虛線表示來自用C-毒株CSFV疫苗接種疫苗的豬的樣品（'CS'樣品）的結(jié)果;實線表 示來自用基于vFlc-APTal病毒的標記疫苗接種疫苗的豬的樣品（'VS'樣品）的結(jié)果。
[0194] 水平灰色條表明不同測定中的闊值評分，將樣品解釋為野生型CSFV E2抗體陽性， 懷疑含有野生型CSFV E2抗體，或野生型CSFV E2抗體陰性。
[0195] 圖1 A:比較結(jié)果：再現(xiàn)Kortekaas等人，2011(同上）的圖4 A。使用的E2 ELISA是 PrioCHECK? CSFV Ab 2.0 (Prionics)〇
[0196] 圖 1 B:使用不同的商業(yè)E2 ELISA，IDEXX CSFV Ab Test? (IDEXX)重新測試 Kortekaas等人，2011 (同上）的樣品的結(jié)果。
[0197] 圖1 C:使用本發(fā)明的檢測方法(將共溫育引入IDEXX CSFV Ab測試的一個步驟中） 重新測試Kortekaas等人，2011 (同上）的樣品的結(jié)果。
[019引圖2: 來自超過400份陰性野外樣品中的CSFV抗體的分析的結(jié)果。根據(jù)IDEXX CSFV Ab測試? (IDEXX)、修改為在本發(fā)明方法中引入共溫育的方案，進行測試。結(jié)果表示為每微量滴定板 檢測到的化ISA抑制百分比的平均值，對于所有樣品合并結(jié)果，并且將所有板合并為一。最 高值和最低值由黑色菱形表示，通過黑條連接，并且平均值通過灰色菱形表示。
[0199]圖3: 來自被CSFV實驗感染的豬且在接種后2、3或4周取樣的超過400份樣品的分析結(jié)果。不 是每個動物都有Ξ份樣品。檢測方法是本發(fā)明方法，表示為'Inv.'；或者是商業(yè)化ISA (IDEXX CSFV Ab檢測），表示為'Comm. '。分類：陰性、懷疑和陽性基于測量的百分比化ISA抑 審IJ，并且分別根據(jù)商業(yè)化ISA的評分表指定為低于30%、30-40%或超過40% ELISA抑制。
【主權(quán)項】
1. 用于檢測測試樣品中針對野生型典型豬瘟病毒(CSFV)的抗體的方法，其中所述樣品 還可以包含針對CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的抗體，所述方法包括將所述測試樣品與 包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定化載體溫育的步驟，其特征在于所述方法包括在所述 步驟中與包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體共溫育。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法）。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述測試樣品獲自已經(jīng)用CSFV疫苗針對CSF接 種疫苗的豬類動物，所述CSFV疫苗包含含有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中用于共溫育中的載體中包含的CSFV E2 的突變的TAVSPTTLR表位與用于對獲得所述測試樣品的豬類動物接種疫苗的CSFV疫苗的 CSFV E2蛋白中包含的突變的TAVSPTTLR表位是相同的。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中用于共溫育中的載體中包含的CSFV E2 的突變的TAVSPTTLR表位具有氨基酸序列：TAGSTLRTE(SEQ ID N0:2)。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述CSFV疫苗基于vFlc- △ PTal病毒。7. 根據(jù)權(quán)利要求1 -6中任一項所述的方法，其中包含CSFV E2的TAVSPTTLR表位的固定 化載體，或包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體，是CSFV E2蛋白，或者兩種載體都 是CSFV E2蛋白。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其包括改變包括與包含CSFV E2的突變的 TAVSPTTLR表位的載體共溫育的步驟的溫育條件以適應(yīng)于加入所述載體。9. 診斷檢測試劑盒，其用于執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法。10. 包含CSFV E2的突變的TAVSPTTLR表位的載體用于根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述 的方法中的共溫育或根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷檢測試劑盒中的用途。11. 用于區(qū)分被野生型CSFV感染的動物和用CSFV疫苗針對CSFV接種疫苗的動物的方 法，其中所述疫苗包含含有突變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白，并且所述方法包括使用 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法的檢測方法，或者包括使用根據(jù)權(quán)利要求9所述的診 斷測試試劑盒。12. 用于控制豬類動物群體中野生型CSFV的感染的方法，其通過組合使用包含含有突 變的TAVSPTTLR表位的CSFV E2蛋白的CSFV疫苗和根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷測試試劑盒而 實現(xiàn)。
【文檔編號】G01N33/569GK105829892SQ201480069404
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月18日
【發(fā)明人】U.P.布魯?shù)吕?
【申請人】英特維特國際股份有限公司