一種血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺類毒品的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于藥代動力學(xué)、生物樣本含量測定領(lǐng) 域，尤其設(shè)及一種血清中6484細(xì)11、04、5-町及苯丙胺類毒品的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] W甲基苯丙胺（Methamphetamine，簡稱MA，俗稱：冰毒，其它苯丙胺類化合包括 Amphetamine :Amp ; 3 , 4-Methylenedioxyamphetamine :MDA; 3 , 4-Methylenedioxymethamphetamine:MDMA;3,4-Methylenedioxyethylamphetamine:MDEA)為 代表的新型毒品正成為全球范圍內(nèi)濫用最廣泛、蔓延最迅速、危害最嚴(yán)重的毒品。研究表 明，甲基苯丙胺可損害中樞神經(jīng)細(xì)胞，在一定的大腦區(qū)域，使濫用者出現(xiàn)多己胺和5-徑色胺 水平下降、酪氨酸徑化酶及色氨酸徑化酶活性下降、多己胺和5-徑色胺吸收轉(zhuǎn)運能力下降 W及組織學(xué)可見的末端損傷，提示多己胺和5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量變化與吸毒人員 濫用程度具有相關(guān)性。此外，研究顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA、Glu含量變化與苯丙胺類毒品 的濫用程度存在關(guān)聯(lián)。通過測定血清中上述四種神經(jīng)遞質(zhì)和苯丙胺類化合物的含量變化規(guī) 律，可間接反映神經(jīng)系統(tǒng)中上述神經(jīng)遞質(zhì)與苯丙胺類毒品成癒之間的關(guān)系。
[0003] 6484、6111、04、5-肌及苯丙胺類均屬于小分子極性化合物，04、5-肌及苯丙胺類為 含氨基的堿性化合物，GABA和Glu為即含氨基又含簇基的兩性化合物。此外，GABA、Glu、DA及 5-HT是血液中內(nèi)源性存在的化合物，且濃度相差較大，運些特點給同時測定上述化合物造 成極大困難。目前，將上述內(nèi)源性氨基酸、兒茶酪胺與苯丙胺類等九種化合物同時測定的 LC-MS/MS方法尚未見報道。
[0004] 相關(guān)技術(shù)中測定此S類化合物的方法包括HPLC法、電化學(xué)法、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 法、衍生化法、固相微萃取法及GC-MS法等。上述方法存在如下問題:HPLC操作簡便，但靈敏 度較低，選擇性差，常需衍生化或固相萃取等復(fù)雜耗時的樣品前處理過程;電化學(xué)方法靈密 度低;離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需用到緩沖鹽離子對，常無法與質(zhì)譜檢測器兼容;GC-MS法樣品 處理過程繁瑣，費時費力，且平均檢測時間較長，不適合大樣本檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對吸毒人員血清中6484、6111、04、5-肌及苯丙胺類含量測定 的技術(shù)難題，避免現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足之處而提供一種建立樣本處理簡便、方法靈敏、及 實用性強的同時測定上述化合物的，用于評價吸毒人員血清樣本中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化與苯 丙胺濫用程度相關(guān)性的LC-MS/MS檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 提供了一種血清中6484、6111、04、5-肌及苯丙胺類毒品的檢測方法，其特征在于： 包括W下步驟：
[000引81:標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：包括6484、6111、04、5-1'山和苯丙胺類儲備液、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作 溶液、質(zhì)控工作溶液的配制W及內(nèi)標(biāo)化合物儲備液和工作溶液的配制;其中，所述苯丙胺類 儲備液為商品化的Img ? m[i的甲醇溶液，所述Glu采用內(nèi)標(biāo)一點法測定，無標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶 液；
[0009] S2:"空白"血清樣本和吸毒人員血清樣本的處理:吸取"空白"血清樣本，分別加入 GABA、DA、5-TH及苯丙胺類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液或質(zhì)控工作溶液，再依次加入含Glu-(15;氯乙酸溶液和含DA-cU和Amp-d6的乙臘溶液，滿旋震蕩、離屯、，吸取上清液待測；未知生 物樣本除不添加標(biāo)準(zhǔn)曲線或質(zhì)控工作溶液外，其它處理方式同上，并采用50%的甲醇-水溶 液補齊預(yù)設(shè)體積；
[0010] S3:液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測：將步驟S2中獲得的上清液進行檢測，檢測的化合 物包括GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺類，所述苯丙胺類包括Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA;
[0011 ] S4:標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，其中，所述Glu采用內(nèi)標(biāo)一點法測定，無標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] 優(yōu)選地，所述S氯乙酸溶液、乙臘、"空白"血清樣本或吸毒人員血清樣本的體積比 為1:1:1;所述滿旋設(shè)置為4000巧m、5min，離屯、為4°C14000巧m、10min。
[0013] 優(yōu)選地，步驟S2中"空白"血清樣本和吸毒人員血清樣本的體積為80化，所述添加 的GABA、DA、5-TH及苯丙胺類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液或質(zhì)控工作溶液的體積為20化，含 Glu-dsS氯乙酸溶液的體積為80化，含DA-Ck和Amp-d6的乙臘溶液體積為80化;所述S氯乙 酸溶液濃度為0.6N，其中，所述Glu采用內(nèi)標(biāo)一點法測定，無標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，樣本的預(yù)設(shè) 體積采用50%的甲醇-水溶液補齊至預(yù)定值。
[0014] 優(yōu)選地，步驟Sl中的所述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備方法如下：
[00巧](I)GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品11 .OOmg,置IOmL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì) 控工作溶液要求，W純水溶解得GABA 1. IOmg ? m[i標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，W純水依次稀釋得到系 列工作溶液和質(zhì)控溶液；
[0016] (2)Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取Glu 21.OOmg于IOmL容量瓶內(nèi)，W純水溶解，得到2. IOmg ? m[i標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，依據(jù)需要配制相應(yīng)濃度的Glu質(zhì)控工作溶液；
[0017] (3)DA和5-HT標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取DA ? HCl 11.37mg和5-HT ? HCl 10.37mg標(biāo)品，置于 IOmL棟色容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度;按照標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控工作溶液要求，用甲醇梯度 稀釋獲得DA和5-HT混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液和質(zhì)控工作溶液；
[0018] (4)苯丙胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液:苯丙胺類儲備液為商品化的1.OOmg ? mL-i的甲醇溶液，標(biāo) 準(zhǔn)曲線工作溶液和質(zhì)控工作溶液由母液用甲醇進行梯度稀釋獲得；
[0019] (5)內(nèi)標(biāo)化合物工作溶液：
[0020] ①Glu-d日內(nèi)標(biāo)工作溶液:每次稱取約2mg Glu-d日，使用約ImL純水溶解，作為Glu-ds 內(nèi)標(biāo)儲備液，Glu-ds儲備液用0.6N立氯乙酸水溶液稀釋成100(K)ng ? ml/i內(nèi)標(biāo)工作溶液；
[0021] ②DA-cU和Amp-ds混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：每次稱取約Img DA-Ck-肥1樣品，使用約ImL 甲醇溶解，獲得DA-d冷量為Img ? mL-i，作為DA-Ck儲備液;Amp-d6內(nèi)標(biāo)工作溶液為lOOiig/mL 甲醇溶液，混合DA-ck和Amp-ds母液，用乙臘稀釋，配制成二者濃度分別為250ng ? mL-哺 200ng ? ml/i的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液；
[0022] 上述兩組內(nèi)標(biāo)化合物工作溶液均作為血清蛋白沉淀劑使用。
[0023] 優(yōu)選地，步驟S4中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品配制方法如下：
[0024] (1)使用"空白"血清配制含藥濃度如下述的標(biāo)準(zhǔn)曲線血清樣本：
[0025] @6484:25、62.5、125、313、625、及1250雌.111[1;
[0026] ② DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA:5、10、25、62.5、125、250、及500ng?mL-l;
[0027] @5-冊：15、30、75、188、375、750、及1500。邑.111[1;
[002引④Glu采用內(nèi)標(biāo)一點法定量，未配制標(biāo)準(zhǔn)曲線血清樣本；
[0029] 在上述各含藥血清樣本中分別加入80化含各內(nèi)標(biāo)化合物的乙臘和S氯乙酸溶液， 滿旋振蕩、離屯、；W各待測物的濃度為橫坐標(biāo)，各待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐 標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸；
[0030] (2)配制質(zhì)控血清樣品：質(zhì)控血清樣品的處理方法與步驟S2-致，上述各個化合物 的質(zhì)控樣本低濃度和高濃度依次為GABA:71.4、46化g ? mL-i;Glu:10000,65600ng ? mL-i; DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA:15、400ng ? mL-i;5-HT:45、1200ng ? mL-1。
[0031] 優(yōu)選地，所述步驟S3中采用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為美國Agilent HPllOO四元 低壓高效液相色譜系統(tǒng)，包括自動進樣器、柱溫箱;美國API4000QQQ型質(zhì)譜儀，控制軟件為 Analyst 1.4版本;所述液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法的操作條件如下：
[0032] ①色譜柱：ES Epic Polar Hy化O C18 150mmX4.6mm，5]im，接菲羅口Security Guard Cl8保護柱；
[0033] ②柱溫:室溫；
[0034] ③流動相：甲醇(B相）：0.1%甲酸-水(A相）；
[0035] @流速:0.91111^.111111-1，梯度洗脫，0~6.00111111，8相5%~95%;6.01~6.50111111，8相 95%~95% ;6.51 ~12.OOmin B相5%B;
[0036] ⑤進樣量化L分流比48:52，48 %洗脫液進質(zhì)譜儀；
[0037] ⑥質(zhì)譜條件：ESI離子源，正離子檢測模式；碰撞氣：化? h-i;氣簾氣：2化? h-i; 051:4化-11-1，652:401^*11-1;毛細(xì)管電壓:5000￥;霧化溫度:500°(：;多級反應(yīng)監(jiān)測，各化合 物碰撞能均為：16.0V，解簇電壓:55.0V。
[003引優(yōu)選地，采用多級反應(yīng)監(jiān)測方式，監(jiān)測的待測化合物離子對：GABA( 104.000一 87.000) Xlu( 148.000^84.200) ^DA( 154.200^137.000) ^5-HT( 177.200^160.000) ^Amp (136.000一9