同時測定小檗皮中四種生物堿成分含量的hplc方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藏藥材質(zhì)量控制方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及同時測定小檗皮中四種生物 堿成分含量的HPLC方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藏藥小檗皮始載于《四部醫(yī)典》，藏文譯音"吉爾哇"、"杰星"等，來源于小檗科植物 甘肅小檗Berberis kansuensis Schneid.及同屬數(shù)種植物的干燥內(nèi)皮。小檗皮具有清熱解 毒、排黃水等功效，是常用的藏藥材，也是八味小檗皮散、四味姜黃湯散等藏藥復方制劑的 主要組成藥味，可用于治療黃水病、尿路感染、眼病等疾病，具有較好的開發(fā)利用價值。因 此，檢測小檗皮藥材中有效成分的含量，對小檗皮藥材的質(zhì)量進行監(jiān)控，具有十分重要的現(xiàn) 實意義。
[0003] 小檗皮藥材的有效成分主要為生物堿類化合物，如小檗堿、木蘭花堿、巴馬汀和藥 根堿等。目前已有文獻(子巴，HPLC法測定不同產(chǎn)地藏藥小檗皮中鹽酸小檗堿含量比較[J]. 四川中醫(yī)，2011,29(9):45-46.;張琦等，藏藥小檗皮中小檗堿的含量測定[J].中國民族醫(yī) 藥雜志，2000,6(3) :41-42.)報道測定了藏藥小檗皮中小檗堿的含量。
[0004] 然而，考慮到小檗皮藥材中的有效成分繁多，以單一有效成分含量作為質(zhì)量標準 的指標可靠性不高。同時，目前小檗皮藥材的用藥部位界定不清，使用較為混亂：《部頒標 準?藏藥分冊》規(guī)定為干燥內(nèi)皮，但并沒有明確指明是那個部位的內(nèi)皮;六省區(qū)衛(wèi)生局制訂 的《藏藥標準》規(guī)定為莖或根的內(nèi)皮;而且市場調(diào)研也發(fā)現(xiàn)有藏藥材市場和飲片企業(yè)仍然銷 售帶有栓皮的小檗皮藥材的情況。用藥部位的混亂必然影響藥材的質(zhì)量，如果不知道小檗 皮不同部位中各個有效成分含量的差異，在臨床上混亂使用，也對小檗皮的安全性和臨床 療效的穩(wěn)定性造成了極大的隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種同時測定小檗皮中四種生物堿成分含量的 HPLC方法，所述四種生物堿成分為木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀和小檗堿，包括以下步驟：
[0006] (1)制備供試品溶液：
[0007] 取小檗皮粉末，加以鹽酸-甲醇作為提取溶劑提取，過濾得供試品溶液;其中，所述 鹽酸與甲醇的體積比為1:200~1:50;
[0008] (2)制備對照品溶液：
[0009] 取木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品，混合，加甲醇配制成 混合對照品溶液；
[0010] (3)分別將供試品溶液和對照品溶液注入高效液相色譜儀檢測，色譜條件如下：
[0011] 色譜柱:Ci8色譜柱；
[0012] 流動相:流動相A為乙腈，流動相B為0.2 %磷酸水溶液，梯度洗脫程序為0~10分 鐘，17% ~19%A; 10~11 分鐘，19% ~28%A; 11~18 分鐘，28% ~34%A; 18~25 分鐘，34% ~34%A;
[0013] (4)根據(jù)檢測結(jié)果計算得到小檗皮中的木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀和小檗堿含量。
[0014] 進一步地，步驟(1)中，所述甲醇的濃度為70%，鹽酸的濃度為36~37%。
[0015] 進一步地，步驟(1)中，所述提取是超聲或回流提取。
[0016] 進一步地，所述提取的時間是30分鐘。
[0017]進一步地，步驟（1)中，所述樣品重量與提取溶劑的質(zhì)量體積比為60-120g/mL，優(yōu) 選的質(zhì)量體積比為1 〇〇g/mL。
[0018] 進一步地，步驟(1)中，所述鹽酸與甲醇的體積比為1:100。
[0019] 進一步地，步驟⑶中，所述色譜柱的規(guī)格為：內(nèi)徑4.6mm，長度250mm，填料粒徑5μ m〇
[0020] 更進一步地，所述色譜柱為InertSustain Ci8色譜柱。
[0021 ] 進一步地，所述色譜條件的柱溫為25°C~35°C ;流速為1 .OmL/min。
[0022] 進一步地，所述小檗皮的基源品種為鮮黃小檗Berberis diaphana、匙葉小檗 Berberis vernae或甘肅小檗Berberis kansuensis。
[0023 ]進一步地，所述小檗皮的部位為莖木、莖內(nèi)皮、莖栓皮、根木、根內(nèi)皮或根栓皮。
[0024] 由于中國食品藥品檢定研究院提供的法定對照品只有鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿和 鹽酸巴馬汀，因此參照《中國藥典》2015版一部"黃柏"藥材中小檗堿的HPLC含量測定方法 (國家藥典委員會.中國藥典2015年版一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015，305)，本發(fā)明 實際測定的藥根堿含量是以鹽酸藥根堿計，巴馬汀含量是以鹽酸巴馬汀計，小檗堿含量是 以鹽酸小檗堿計。
[0025] 本發(fā)明通過對提取方法和色譜條件的篩選，成功建立了同時測定小檗皮中四種生 物堿成分一一木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿和小檗堿含量的HPLC方法，該方法準確可靠、簡便 快速，為提高小檗皮的質(zhì)量控制水平、促進藥材的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。同時，本發(fā)明的方 法還準確檢測出了不同基源品種不同部位中四種生物堿成分，為小檗皮的臨床應用提供了 有效的參考。
[0026] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0027]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0028]圖1-4依次為木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的紫外光譜圖。 [0029]圖5為流動相為乙腈-0.02m〇L/L磷酸二氫鉀溶液時樣品色譜峰的分離情況。
[0030]圖6為流動相為乙腈-水溶液時樣品色譜峰的分離情況。
[0031]圖7為流動相為乙腈-0.2 %磷酸溶液時樣品色譜峰的分離情況。
[0032] 圖8流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液時樣品色譜峰的分離情況。
[0033] 圖9為在梯度洗脫條件1下樣品色譜峰的分離情況。
[0034] 圖10為在梯度洗脫條件2下樣品色譜峰的分離情況。
[0035] 圖11為在梯度洗脫條件3下樣品色譜峰的分離情況。
[0036] 圖12為在梯度洗脫條件4下樣品色譜峰的分離情況。
[0037] 圖13為在梯度洗脫條件5下樣品色譜峰的分離情況。
[0038] 圖14為小檗皮HPLC圖譜(60min)。
[0039] 圖15為柱溫為25 °C時樣品色譜峰的分離情況。
[0040] 圖16為柱溫為30°C時樣品色譜峰的分離情況。
[0041]圖17為柱溫為35°C樣品色譜峰的分離情況。
[0042] 圖 18為InertSustain Cis色譜柱（4·6X250mm，5μm，S/N:4GR98105，C/N:5020-07346)下的色譜圖。
[0043] 圖19為1仙『8^1005-3色譜柱（250\4.6臟，54111，511厶7143038，(：/^:5020-01732)下的色譜圖。
[0044] 圖20為WondaSil Cis-WR色譜柱（250X4·6mm，5μm，SN:3D5701-15，C/N:5020-39033)下的色譜圖。
[0045] 圖21為混合對照品溶液(A)和小檗皮樣品溶液(B)的HPLC色譜圖，峰1為木蘭花堿； 峰2為鹽酸藥根堿;峰3為鹽酸巴馬汀;峰4為鹽酸小檗堿。
[0046] 圖22為小檗皮不同藥用部位的HPLC色譜圖，峰1為木蘭花堿;峰2為鹽酸藥根堿;峰 3為鹽酸巴馬汀;峰4為鹽酸小檗堿。
[0047] 圖23為小檗皮不同部位中四種生物堿成分及總生物堿含量的比較:數(shù)據(jù)以平均值 土標準偏差表示。根據(jù)方差分析和Tukey s多重比較，誤差棒上相同的字母表示組間沒有顯 著性差異，而不同的字母則表示組間具有顯著性差異(P〈〇.05)。
【具體實施方式】 [0048]儀器與試藥：
[0049] 美國Agilent 1200高效液相色譜儀，配置二極管陣列（DAD)檢測器；Sartorius BP121s電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；CQ-250超聲波清洗器(上海必能信有 限公司）。
[0050] 鹽酸藥根堿(批號110733-201108)、鹽酸巴馬汀(批號11073-201108)、鹽酸小檗堿 (批號0713-9605)均購于中國食品藥品檢定研究院，木蘭花堿購于成都曼思特生物科技有 限公司（批號MUST-14122416,含量>98% )，乙腈為色譜純(Fisher)，水為超純水，鹽酸為濃 度36~37 %的市售鹽酸，其余試劑均為分析純。
[0051] 18批小檗皮藥材，其中8批商品藥材從各地藏醫(yī)藥或藥材市場收集，另10批藥材均 為野外實地采集，分別為小檗科植物鮮黃小檗(Berberis diaphana)、匙葉小檗(Berberis vernae)和甘肅小檗(Berberis kansuensis)具體如下所不：
[0052] _

[0053] 實施例1本發(fā)明方法的工藝參數(shù)篩選