一種對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種臨床診斷用的體外檢測試劑盒，具體地說，涉及一種對羥基苯丙 氨酸尿液檢測試劑盒及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥死亡率在所有疾病中占據(jù)首位，是人類健康的第一殺手已成為威脅人類生命 和健康的一大病因，據(jù)統(tǒng)計每隔25年，癌癥患者的人數(shù)就要翻一番。不僅如此，癌癥的死亡 人數(shù)也在全球迅猛上升，2030年這個數(shù)字可能會增至1320萬。
[0003] 早期發(fā)現(xiàn)是治療腫瘤的關(guān)鍵，腫瘤的發(fā)展分為五個階段：良性、腫瘤細(xì)胞啟動期、 腫瘤早期、腫瘤中期、晚期。癌癥的可怕之處，就在于前三個階段，影像學(xué)根本無法檢測出 來，即便到了腫瘤中期，也只有非常專業(yè)的醫(yī)生用較先進(jìn)的設(shè)備才能測出。世界衛(wèi)生組織的 研究認(rèn)為：目前1/3的癌癥是可以預(yù)防的；1/3的癌癥可以通過積極治療而延長患者生命；1/ 3的癌癥是可以通過早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療而痊愈的。
[0004] 癌細(xì)胞的核苷酸代謝異常會生成一種單羥酚類代謝物，具體是指酪氨酸(對羥基 苯丙氨酸）、色氨酸和5-羥吲哚乙酸，且含量遠(yuǎn)高于正常人，而這種物質(zhì)能夠通過尿液排放。 檢測單羥酚類代謝物的含量，可以推斷人體是否患有癌癥，能夠及早的發(fā)現(xiàn)腫瘤，挽救生 命，無需額外的開支，免去病人的恐懼和痛苦。
[0005] 中國專利CN1192532A公開了一種腫瘤病尿樣檢測試劑，由分別存放的A、B、C、D四 個試劑組成，試劑A是含硫酸汞0.5~15 %的硫酸溶解液，試劑B為含亞硝酸0.001~1 %的無 機(jī)酸或水溶解液，試劑C為含對氨基苯磺酸0.01~0.5 %的水或有機(jī)酸溶解液;試劑D是含萘 胺衍生物0.05~10%無機(jī)酸或有機(jī)酸溶解液。CN1192532A公開的方案通過反應(yīng)中顯示的顏 色變化檢測尿樣中單羥酚的含量，該檢測方法有一定的效果，但也存在一定的缺陷。例如， 首先，尿液中的單羥酚先與試劑A中的汞鹽反應(yīng)生成絡(luò)合物，而該絡(luò)合物由于單羥酚中羥基 將其孤對電子供給到金屬離子的空軌道上，而導(dǎo)致羥基對芳環(huán)的供電子能力下降，并且絡(luò) 合后的結(jié)構(gòu)使芳環(huán)上的電子云密度降低，最終導(dǎo)致接下來的重氮化反應(yīng)活性不足，最終導(dǎo) 致檢測不準(zhǔn)確;此外，試劑B中的亞硝酸在存貯和運輸過程中容易發(fā)生分解，導(dǎo)致無法和試 劑C反應(yīng)生成重氮鹽，影響檢測的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，提供一種新的對羥基苯丙 氨酸尿液檢測試劑盒，具有穩(wěn)定性高和靈敏度高的優(yōu)點，能夠應(yīng)用于大規(guī)模腫瘤代謝異常 等的篩查。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒，包括:分別存 放在四個容器中的試劑A、試劑B、試劑C和試劑D，其中，
[0008] 試劑A: 0.01~0.5mol/L的無機(jī)酸水溶液；
[0009] 試劑B: 0.01~0.5mol/L的亞硝酸鈉水溶液；
[0010] 試劑C:苯胺衍生物的無機(jī)酸水溶液，苯胺衍生物的濃度為0.005~0. lmol/L，無機(jī) 酸的濃度為〇. 01~〇. 5mol/L，所述苯胺衍生物中的苯環(huán)上至少含有磺酸基、硝基、氰基或氟 基；
[0011] 試劑D:N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽的水溶液，所述N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽的濃度 為0.01~0.3mol/L;
[0012] 其中，所述試劑C中苯胺衍生物的濃度不高于試劑A中無機(jī)酸的濃度和試劑B中亞 硝酸鈉的濃度，所述無機(jī)酸選自鹽酸、硫酸、四氟硼酸或六氟磷酸。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑C中苯胺衍生物選自對氨基苯磺酸、鄰氨基苯磺酸、對硝基苯胺、 對氨基苯腈、鄰氨基苯腈、對氟苯胺、鄰氟苯胺、2-氟-4-硝基苯胺、2-氯-4-硝基苯胺、2-甲 基-4-硝基苯胺、2-甲基-4-氟苯胺、4-甲基-2-氟苯胺、2，6-二甲基-4-硝基苯胺或2，4-二甲 基 _6_硝基苯胺。
[0014] 本發(fā)明同時提供一種對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒的制備方法，包括以下步 驟：
[0015] 配制試劑A:將無機(jī)酸加入水中得到濃度為0 · 01~0 · 5mol/L的無機(jī)酸水溶液；
[0016] 配制試劑B:將亞硝酸鈉加入水中得到濃度為0.01~0.5mol/L的亞硝酸鈉水溶液；
[0017] 配制試劑C:將苯胺衍生物和無機(jī)酸加入水中得到苯胺衍生物的無機(jī)酸水溶液，所 述苯胺衍生物中的苯環(huán)上至少含有硝基、氰基或氟基，所述試劑C中苯胺衍生物的濃度為 0 · 005~0 · lmol/L，無機(jī)酸的濃度為0 · 01~0 · 5mol/L;
[0018] 配制試劑D:將N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽加入水中，得到N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽 的水溶液，所述N-1 -萘基乙二胺二鹽酸鹽的濃度為0.01~0.3mo 1/L;
[0019] 其中，所述試劑C中苯胺衍生物的濃度不高于試劑A中無機(jī)酸的濃度和試劑B中亞 硝酸鈉的濃度，所述無機(jī)酸選自鹽酸、硫酸、四氟硼酸或六氟磷酸。
[0020] 優(yōu)選地，所述試劑C中苯胺衍生物選自對氨基苯磺酸、鄰氨基苯磺酸、對硝基苯胺、 對氨基苯腈、鄰氨基苯腈、對氟苯胺、鄰氟苯胺、2-氟-4-硝基苯胺、2-氯-4-硝基苯胺、2-甲 基-4-硝基苯胺、2-甲基-4-氟苯胺、4-甲基-2-氟苯胺、2，6-二甲基-4-硝基苯胺或2，4-二甲 基 _6_硝基苯胺。
[0021] 本發(fā)明的理論基礎(chǔ)在于：
[0022] 尿液是人體不斷產(chǎn)生、不斷排泄的代謝產(chǎn)物，當(dāng)體內(nèi)腫瘤因子活動時，體內(nèi)相對部 分的分子量為4000~6000的蛋白代謝異常使尿液中的硫脲、硫乙醇胺、酪氨酸、色氨酸等多 種有機(jī)物含量與含毒激素明顯增加，而健康人的尿液中單羥酚含量極少，通過檢測尿液中 諸如對羥基苯丙氨酸等單羥酚的含量，來判定被測試者體內(nèi)是否有相關(guān)的細(xì)胞異常代謝， 以此作為細(xì)胞內(nèi)代謝異常類疾病篩查的輔助診斷指標(biāo)。
[0023] 具體地說，向待測尿液中加入試劑A、試劑B，充分震蕩后，加入試劑C，得到混合液 M，充分震蕩。酸性條件下，試劑A、試劑B和試劑C反應(yīng)生成重氮鹽，并與尿液中的對羥基苯丙 氨酸反應(yīng)生成偶氮化合物。由于偶氮基是一個發(fā)色基，芳香偶氮化合物一般都具有顏色，并 且該顏色與底物顏色相比變化非常明顯。若上述試劑混合后產(chǎn)生顏色反應(yīng)，則表明尿液中 含有對羥基苯丙氨酸。進(jìn)一步將試劑D加入上述混合液中，若尿液中含有對羥基苯丙氨酸， 由于與尿液中對羥基苯丙氨酸相比，試劑C中的苯胺衍生物是不足量的，則試劑C中的苯胺 衍生物被消耗掉，加入試劑D后，試劑D中的N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽無法與試劑C中的苯胺 衍生物反應(yīng)生成具有紫紅色的物質(zhì)，則表明混合液Μ中的苯胺衍生物被消耗掉，進(jìn)一步表明 尿液中含有對羥基苯丙氨酸。
[0024] 若尿液中對羥基苯丙氨酸含量極少，則混合液Μ中苯胺衍生物沒有被消耗掉，混合 液Μ震蕩后顏色基本無變化。加入試劑D后，混合液Μ中苯胺衍生物與Ν-1-萘基乙二胺二鹽酸 鹽反應(yīng)生成具有紫紅色的偶氮化合物，表明尿液中基本沒有對羥基苯丙氨酸。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒及其制備方法至少具 有以下有益效果：
[0026] 1、本發(fā)明通過優(yōu)化設(shè)計試劑盒的特定試劑組成，意外得到試劑盒中各試劑的一組 特定濃度配比數(shù)據(jù)，而該試劑盒的各試劑在該組濃度配比下檢測尿液中的對羥基苯丙氨酸 具有非常高的穩(wěn)定性和靈敏度。
[0027] 2、本發(fā)明的苯胺衍生物通過選用特定的取代基團(tuán)，使其在與對羥基苯丙氨酸或Ν-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽的重氮偶聯(lián)反應(yīng)中具有較高的反應(yīng)活性，并顯示特定的顏色，具有 非常好的識別效果，保證了檢測結(jié)果的可靠性。
[0028] 3、將無機(jī)酸水溶液與亞硝酸鈉水溶液分開存放，避免了亞硝酸水溶液在存放過程 中可能發(fā)生的分解反應(yīng)，并且單獨存放的無機(jī)酸水溶液與亞硝酸鈉水溶液在混合時具有較 高的反應(yīng)活性，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行。
[0029] 4、本發(fā)明的對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒使用時操作簡單、反應(yīng)快、顏色明顯， 普通消費者可自行進(jìn)行操作和識別判斷。
[0030] 5、本發(fā)明的對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒具有廣譜性，可適用于多種腫瘤代謝 異常的篩查。
[0031] 6、本發(fā)明的對羥基苯丙氨酸尿液檢測試劑盒制