一種原子力顯微鏡測量單個活心肌細(xì)胞動作電位及搏動力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種原子力顯微鏡測量單個活心肌細(xì)胞動作電位及搏動力的方法，屬于工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著納米技術(shù)的發(fā)展，原子力顯微鏡(AFM)作為納米尺度測量的重要工具，使得其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用成為可能，尤其是在對活細(xì)胞操縱及特性檢測的研究中，顯示了它相對于其他活細(xì)胞特性檢測技術(shù)獨有的優(yōu)勢。
[0003]細(xì)胞的電生理特性是像心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等帶電細(xì)胞所具有的性質(zhì)，測量此類細(xì)胞的電生理特性對心臟和神經(jīng)等疾病的診斷，心肌和神經(jīng)細(xì)胞的再生康復(fù)以及高通量藥物篩選等均可帶來重大突破，對心血管和帕金森等神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的治療與防控具有極為重要的社會和經(jīng)濟(jì)意義。
[0004]在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中，往往需要進(jìn)行生物電信號的提取。一般情況下可以通過電極采用一定的導(dǎo)聯(lián)方式來提取生物電信號，然后經(jīng)特定的信號調(diào)理電路進(jìn)行放大、去噪等處理后再對信號進(jìn)行特征識別。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和半導(dǎo)體微細(xì)加工技術(shù)的發(fā)展，以活細(xì)胞作為敏感元件的細(xì)胞傳感器和細(xì)胞芯片，已成為生物傳感器研究領(lǐng)域的一大熱點。已經(jīng)有人將這種細(xì)胞傳感器用于環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選、新藥開發(fā)和基礎(chǔ)神經(jīng)學(xué)等研究。國內(nèi)外很多研究小組在從事關(guān)于細(xì)胞傳感器的研究，也已經(jīng)有比較成熟的技術(shù)用于記錄細(xì)胞生理特性的研究。
[0005]在近幾年研究中，測量心肌細(xì)胞動作電位的技術(shù)主要有兩種。第一種是膜片鉗技術(shù)，自膜片鉗技術(shù)發(fā)明以來，被認(rèn)為是測量細(xì)胞電生理的黃金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)是由微吸管作為微電極來測量細(xì)胞的電壓或者電流特性。芯片膜片鉗技術(shù)能記錄不同細(xì)胞的全細(xì)胞電生理活動。雖然膜片鉗技術(shù)在測量細(xì)胞電生理時能夠獲得較好的信號結(jié)果，但是膜片鉗技術(shù)操作復(fù)雜，需要受過專業(yè)訓(xùn)練的人來進(jìn)行操作，并且在微電極與細(xì)胞之間沒有力反饋系統(tǒng)，對細(xì)胞影響較大，很難對細(xì)胞進(jìn)行精確操縱。
[0006]微電極陣列能夠無損的、長時間記錄帶電細(xì)胞的電生理特性。細(xì)胞直接培養(yǎng)在微電極陣列上，細(xì)胞與微電極之間的界面對精確測量細(xì)胞動作電位信號有著重要的作用。但是微電極陣列中的電極位置固定，細(xì)胞隨機(jī)生長在電極上，所以很難定位電極與細(xì)胞的位置，從而不能測量選定細(xì)胞位置的電特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明技術(shù)解決問題:克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種原子力顯微鏡測量單個活心肌細(xì)胞動作電位及搏動力的方法，原子力顯微鏡具有精確的測力的功能，該方法將原子力顯微鏡的測力功能結(jié)合原子力顯微鏡導(dǎo)電探針來測量心肌細(xì)胞的動作電位及跳動力變化信號，該方法將原子力顯微鏡的力反饋系統(tǒng)結(jié)合納米尺度的導(dǎo)電探針來測量心肌細(xì)胞的動作電位及跳動力變化信號，通過原子力顯微鏡光杠桿測力原理及反饋信息，能夠精確定位細(xì)胞位置，在操作上具有高度靈活性，測量電極為納米電極，通過軟件程序?qū)崿F(xiàn)探針恒力跟蹤細(xì)胞跳動，從而獲得較高信噪比電信號。
[0008]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實現(xiàn):一種原子力顯微鏡測量單個活心肌細(xì)胞動作電位及搏動力的方法，其特征在于:原子力顯微鏡導(dǎo)電探針作為納米電極，通過程序控制實現(xiàn)納米電極與跳動細(xì)胞表面恒力接觸測量心肌細(xì)胞的動作電位。在非恒力模式下同時測量心肌細(xì)胞的動作電位及搏動力變化信號。包括以下步驟:
[0009](I)控制納米位移平臺，移動原子力顯微鏡導(dǎo)電探針及樣品臺，將原子力顯微鏡導(dǎo)電探針精確定位到目標(biāo)心肌細(xì)胞上；
[0010](2)在光學(xué)顯微鏡下，觀察心肌細(xì)胞狀態(tài)，移動原子力顯微鏡導(dǎo)電探針將其尖端放到待測細(xì)胞的正上方；
[0011](3)設(shè)定軟件參數(shù)，使原子力顯微鏡導(dǎo)電探針與心肌細(xì)胞膜在非恒力模式下接觸，同時測量心肌細(xì)胞的動作電位及心肌細(xì)胞跳動的形貌變化；
[0012](4)設(shè)定軟件參數(shù)及跟蹤模式，使原子力顯微鏡導(dǎo)電探針與心肌細(xì)胞在恒力模式下接觸，穩(wěn)定測量心肌細(xì)胞的動作電位；
[0013](5)設(shè)定軟件參數(shù)及跟蹤模式，在探針與心肌細(xì)胞恒力接觸模式下，測量心肌細(xì)胞在不同藥物下的動作電位:首先，測量一組未加藥物心肌細(xì)胞的動作電位波形，作為對照組;然后，向心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中直接加入ISO(異丙腎上腺素)藥物，測量心肌細(xì)胞動作電位；最后，向心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中直接加入ACh(乙酰膽堿)藥物，測量心肌細(xì)胞動作電位。
[0014]所述原子力顯微鏡導(dǎo)電探針為導(dǎo)電鉑探針，針尖為四錐形，針尖尖端半徑為20-25nm0
[0015]所述納米位移平臺為壓電陶瓷，位移范圍為100μπιΧ100μπιΧ100μπι，移動精度為
2nm，能夠?qū)崿F(xiàn)精確定位。
[0016]所述步驟(3)中的軟件參數(shù)設(shè)定通過軟件編程實現(xiàn)，設(shè)定為使原子力顯微鏡導(dǎo)電探針進(jìn)針以50nm的步長逐漸接近細(xì)胞，待針尖與心肌細(xì)胞膜接觸后，停止進(jìn)針，同時測量心肌細(xì)胞的動作電位及跳動力變化信號。
[0017]所述步驟(4)中的軟件參數(shù)及跟蹤模式設(shè)定通過軟件編程實現(xiàn)，使原子力顯微鏡導(dǎo)電探針進(jìn)針以50nm的步長逐漸接觸心肌細(xì)胞，并同時啟動原子力顯微鏡導(dǎo)電探針的恒力跟蹤模式，使探針隨心肌細(xì)胞跳動，從而探針與心肌細(xì)胞保持穩(wěn)定的接觸，測量心肌細(xì)胞的動作電位，能夠獲得穩(wěn)定的動作電位波形。
[0018]所述步驟(5)中的軟件參數(shù)及跟蹤模式設(shè)定通過軟件編程設(shè)定，設(shè)定為探針恒力跟蹤模式，使探針與心肌細(xì)胞穩(wěn)定接觸，并在培養(yǎng)皿中直接測量一組未加藥心肌細(xì)胞的動作電位;然后，直接在心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入IS0，待藥物作用3min之后，測量穩(wěn)定動作電位信號;最后，直接在心肌細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入ACh，待藥物作用3min后，測量穩(wěn)定的動作電位信號。
[0019]所述步驟(5)和(6)中通過軟件程序控制，使得探針與心肌細(xì)胞膜之間恒力接觸，探針能夠跟蹤心肌細(xì)胞跳動，通過原子力顯微鏡中光杠桿原理形成的力反饋模塊，當(dāng)心肌細(xì)胞收縮時，探針跟隨細(xì)胞向上移動；當(dāng)心肌細(xì)胞舒張時，探針跟隨細(xì)胞向下移動，從而在心肌細(xì)胞跳動周期內(nèi)，探針與心肌細(xì)胞始終為恒力接觸，因此，探針與心肌細(xì)胞膜的封接穩(wěn)定，獲得可靠的信號波形。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有方法和系統(tǒng)相比有以下優(yōu)點:
[0021](I)結(jié)合測量心肌細(xì)胞的電生理特性，通過原子力顯微鏡光杠桿測力原理及反饋信息，能夠?qū)崿F(xiàn)精確測量，操作具有高度靈活性、精確性。
[0022](2)導(dǎo)電探針作為納米電極測量心肌細(xì)胞動作電位，能夠獲得較高信噪比的電學(xué)信號。
[0023](3)通過原子力顯微鏡光杠桿測力原理及反饋信息，納米電極能夠精確定位待測心肌細(xì)胞，能夠恒力跟蹤心肌細(xì)胞跳動，從而獲得穩(wěn)定的封接阻抗，對心肌細(xì)胞進(jìn)行無損、實時測量，獲得穩(wěn)定的動作電位波形。
[0024](4)通過軟件可以設(shè)定兩種測量模式:納米電極與心肌細(xì)胞的恒力接觸模式和非恒力接觸模式，在非恒力接觸模式下能夠同時測量心肌細(xì)胞的動作電位和搏動力變化信號，能夠同時觀測到心肌細(xì)胞動作電位和心肌細(xì)胞搏動規(guī)律的一致性。
【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明原理框圖；
[0026]圖2為本發(fā)明原子力顯微鏡導(dǎo)電探針跟蹤心肌細(xì)胞跳動的原理圖；
[0027]圖3為本發(fā)明在光學(xué)顯微鏡下探針定位待測細(xì)胞的光學(xué)圖像；
[0028]圖4為本發(fā)明原子力顯微鏡導(dǎo)電探針即納米電極電鏡圖像，其中(a)為原子力顯微鏡導(dǎo)電探針的懸臂，(b)為原子力顯微鏡導(dǎo)電探針的針尖；
[0029]圖5為本發(fā)明在探針和細(xì)胞非恒力接觸模式下同時記錄的電學(xué)和力學(xué)信號波形，其中(a)為心肌細(xì)胞動作電位信號波形，(b)為心肌細(xì)胞的搏動力信號波形；
[0030]圖6為本發(fā)明在探針和細(xì)胞在恒力接觸模式下不同藥物作用下記錄的動作電位波形，其中(a)為加藥前心肌細(xì)胞動作電位信號，(b)為加入ISO對心肌細(xì)胞作用后的動作電位信號，(C)為加入ACh對心肌細(xì)胞作用后的動作電位信號。
【具體實施方式】
[0031]如圖1所示，為本發(fā)明原理框圖，其中I為導(dǎo)電探針測量細(xì)胞模塊，包括原子力顯微鏡導(dǎo)電探針，心肌細(xì)胞，激光器和四象限光電檢測器組成的光杠桿系統(tǒng)，2為壓電陶瓷納米位移平臺，3為四象限光電檢測器電壓采集及心肌細(xì)胞動作電位采集模塊，4為壓電陶瓷納米位移平臺控制模塊，5為光學(xué)顯微鏡模塊，6為計算機(jī)控制系統(tǒng)；
[0032]如圖2所示，為本發(fā)明原子力顯微鏡導(dǎo)電探針跟蹤心肌細(xì)胞跳動的原理圖，其中，I為激光器，2為四象限光電探測器，3為原子力顯微鏡導(dǎo)電探針，4為樣品臺，5為舒張狀態(tài)下的心肌細(xì)胞，6為收縮狀態(tài)下的心肌細(xì)胞。
[0033]圖1和圖2所示，本發(fā)明實現(xiàn)為:
[0034](I)控制壓電