mm寬以及50mm長(zhǎng)（容積 25uL)〇
[0172] 這個(gè)構(gòu)造在用于正面本發(fā)明的原理，這是因?yàn)樵摌?gòu)造可以與易于商用的部件快速 組裝。確實(shí)需要去除等同于在圖30中的輻射濾光器27的濾光器，以通過透射光照明樣品。如 圖3中所示，在最終的原型中，不需要這個(gè)人工干預(yù)。
[0173]為每個(gè)樣品捕捉410nm波長(zhǎng)透射圖像和焚光圖像。使用來自National Institute of Health的ImageJ開源軟件（ImageJ)處理圖像。編寫特殊的插件程序（用于ImageJ的 Reticulocyte Plugin)，其（1)根據(jù)用戶定義的尺寸和強(qiáng)度閾值，計(jì)算在透射或焚光圖像中 觀察的顆粒的數(shù)量，（2)為每個(gè)顆粒透射顆粒，計(jì)算MCH和MCV，并且(3)將網(wǎng)狀細(xì)胞確定為用 戶定義的強(qiáng)度和尺寸的熒光顆粒。確定每個(gè)透射和熒光顆粒的坐標(biāo)，并且用于識(shí)別與發(fā)熒 光的顆粒對(duì)應(yīng)的在透射圖像內(nèi)的紅細(xì)胞。
[0174]圖8概述了由圖像軟件使用的步驟的一個(gè)實(shí)例，在此處是ImageJ插入程序，以識(shí)別 網(wǎng)狀細(xì)胞和紅細(xì)胞并且將其分類。對(duì)于本應(yīng)用，將顆粒閾值設(shè)定為20像素的顆粒的最小直 徑以及80像素的最大直徑。要"匹配"的在熒光和透射圖像內(nèi)的物體需要相隔不超過70像 素。在熒光圖像內(nèi)的物體的強(qiáng)度閾值具有40的最小強(qiáng)度閾值以及255的最大閾值。
[0175] 處理102第一(透射）圖像，然后，處理104第二（熒光）圖像。隨后，在第一和第二圖 像內(nèi)的顆粒被匹配106,并且總結(jié)108網(wǎng)狀細(xì)胞的結(jié)果。
[0176] 處理102第一圖像，包括一個(gè)或多個(gè)步驟：
[0177] 1、使整個(gè)圖像的背景強(qiáng)度均勻；
[0178] 2、減去背景并且將背景設(shè)置為255;
[0179] 3、使用標(biāo)準(zhǔn)的Image J函數(shù)使圖像二值化；
[0180] 4、將ImageJ水分界線用于分離可以接觸的顆粒；
[0181] 5、在水分界線之后確定顆粒數(shù)量，并且校正顆粒；
[0182] 6、如果水分界線僅僅提高顆粒數(shù)量〈5%，那么報(bào)告校正的顆粒數(shù)量;如果>5%，那 么稀釋樣品并且重復(fù)；
[0183] 7、基于在最終產(chǎn)品的開發(fā)期間確定的強(qiáng)度和尺寸的限制，使用ImageJ確定顆粒數(shù) 量、顆粒坐標(biāo)、直徑以及平均強(qiáng)度；以及
[0184] 8、保存在透射圖像中所有顆粒的結(jié)果。
[0185] 處理104(熒光)第二圖像，包括一個(gè)或多個(gè)步驟：
[0186] 1、使整個(gè)圖像的背景強(qiáng)度均勻；
[0187] 2、減去背景；
[0188] 3、將白色電平設(shè)置為255;
[0189] 4、使用標(biāo)準(zhǔn)的Image J函數(shù)使圖像二值化；
[0190] 5、將ImageJ水分界線用于分離可以接觸的顆粒；
[0191] 6、在水分界線之后確定顆粒數(shù)量，并且校正顆粒；
[0192] 7、如果在水分界線之后，顆粒數(shù)量增大〈5%，那么考慮該數(shù)量精確；如果>5%，那 么必須稀釋樣品并且重新運(yùn)行；
[0193] 8、基于強(qiáng)度和尺寸的限制，使用ImageJ確定顆粒數(shù)量、坐標(biāo)、直徑以及平均強(qiáng)度； 以及
[0194] 9、保存在熒光圖像中所有顆粒的結(jié)果。
[0195] 匹配106在第一和第二圖像內(nèi)的顆粒包括一個(gè)或多個(gè)步驟：
[0196] 1、比較在透射和熒光圖像內(nèi)的顆粒的坐標(biāo)；
[0197] 2、如果在透射和熒光圖像內(nèi)的顆粒的坐標(biāo)小于可接受的在開發(fā)期間確定的數(shù)量， 那么在透射圖像內(nèi)的顆粒分類為網(wǎng)狀細(xì)胞;以及
[0198] 3、記錄在透射和熒光圖像內(nèi)匹配的顆粒之間的距離。
[0199] 總結(jié)108網(wǎng)狀細(xì)胞的結(jié)果（即，對(duì)于具有高于預(yù)定尺寸和強(qiáng)度的相應(yīng)熒光圖像的透 射顆粒)包括一個(gè)或多個(gè)步驟：
[0200] 1、透射強(qiáng)度；
[0201] 2、每個(gè)顆粒的像素的平均數(shù)量；
[0202] 3、平均顆粒直徑；
[0203] 4、計(jì)算的紅細(xì)胞體積;和/或
[0204] 5、計(jì)算的血紅蛋白濃度。
[0205]表1示出了本發(fā)明的精確數(shù)據(jù)或特征。
[0208]表2示出了本發(fā)明與Sysmex血液分析儀的方法比較。
[0209]表2:
[0211]其中：
[0212] RBC濃度：紅細(xì)胞/uL
[0213] MCH:平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量pg
[0214] MCV:平均(紅細(xì)胞的）紅細(xì)胞容積fL
[0215] MCHr:網(wǎng)狀細(xì)胞的平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量pg JCHr主要是光散射具有某種貢獻(xiàn) 的光學(xué)密度的測(cè)度，并且可以具有細(xì)胞體積的小貢獻(xiàn)。
[0216] CHr:網(wǎng)狀細(xì)胞血紅蛋白含量。Bayer使用Advia 120網(wǎng)狀細(xì)胞血紅蛋白含量的這個(gè) 縮寫詞。這應(yīng)大略等同于MCHr。CHr是光散射測(cè)量。
[0217] RET HE:網(wǎng)狀細(xì)胞血紅蛋白。Sysmex使用網(wǎng)狀細(xì)胞血紅蛋白含量的Sysmex XE-2100確定的這個(gè)縮寫詞。RET HE應(yīng)大略等同于MCHr和CHrAET HE是前向光散射的測(cè)度。細(xì) 胞體積和血紅蛋白含量影響這個(gè)值。細(xì)胞體積的影響通過這個(gè)參數(shù)更明顯。
[0218] 實(shí)例2
[0219] 本發(fā)明的第二實(shí)施方式用于確定在全血內(nèi)的粒細(xì)胞。
[0220] 在這個(gè)實(shí)施方式中，使用包含樣品室的特殊儲(chǔ)存匣，自動(dòng)進(jìn)行在圖6中概述的很多 手動(dòng)樣品和試劑操作人員步驟。在EDTA真空采血管內(nèi)收集全血，并且插入這個(gè)儲(chǔ)存匣內(nèi)。在 儲(chǔ)存匣內(nèi)的流體回路將全血從真空采血管中自動(dòng)移動(dòng)到精確地分割I(lǐng)OOuL的全血的回路 內(nèi)。該裝置將具有IOmL試劑的包含全血的區(qū)段沖入混合室內(nèi)。
[0221 ] 試劑包含535mgm的氯化銨、84mgm的碳酸氫鈉、38mgm的EDTA、IOmgm的疊氮化鈉、 Imgm的吖啶橙以及IOOmL的蒸餾水。叮啶橙是核酸結(jié)合燃料，其僅僅在細(xì)胞核內(nèi)或者在細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)與核酸結(jié)合時(shí)發(fā)光。還可以在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合至一些復(fù)合糖。這個(gè)試劑溶解紅細(xì)胞，允許 更容易檢測(cè)白細(xì)胞。保留了正確地檢測(cè)、分類以及枚舉白細(xì)胞所需要的白細(xì)胞的大部分形 ??τ O
[0222] 使用通過連接至位于儲(chǔ)存匣之下的馬達(dá)的磁鐵旋轉(zhuǎn)的1/8英寸直徑的不銹鋼滾珠 軸承，混合試劑全血混合物。在混合試劑之后，全血混合物在儲(chǔ)存匣以及收集的光學(xué)圖像內(nèi) 自動(dòng)傳送給樣品室。使用空氣壓力，推動(dòng)流體通過通道。本發(fā)明可以可選地包括進(jìn)入樣品室 內(nèi)的這些步驟。
[0223] 顯微鏡設(shè)備包含在圖3中描述的元件。這個(gè)早期原型是顛倒的顯微鏡。透鏡19是來 自Nikon Instruments的IOX物鏡（CFI LU Plan Fluor BD 10Χ)。對(duì)于透射顯微鏡，福射源 15是具有大約640和680nm的峰值發(fā)射波長(zhǎng)的紅色LED。
[0224] 對(duì)于熒光，使用一圈紅藍(lán)交替的LED照明樣品。該配置對(duì)于在圖3中的子鏡臺(tái)輻射 源18相同。藍(lán)色LED具有在450nm與500nm之間的峰值波長(zhǎng)發(fā)射，并且紅色LED具有在640與 680nm之間的峰值發(fā)射。在這圈內(nèi)具有6個(gè)藍(lán)色和6個(gè)紅色LED。將其定位成通過位于樣品室 16的水平平面之下的10°與45°之間的角度照明在圖5中的樣品室16。通過這種方式定位LED 的目的是將照明源放置成與物鏡的軸盡可能接近90°。在這個(gè)位置中，接近直角散射的光可 以由物鏡捕捉。粒細(xì)胞通過直角密集地散射光，而單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞不通過直角散射光， 因此，直角散射光可以用于將粒細(xì)胞分類。
[0225] 裝置具有直角反射鏡20,與在圖3中一樣。
[0226] 在圖3中的傳感器26是0.5MP CXD照相機(jī)。見照相機(jī)放置成與物鏡相距某個(gè)距離， 以在傳感器上實(shí)現(xiàn)物體的5X到IOX的放大。
[0227] 圖像捕捉軟件是專用的，但是執(zhí)行與ImageJ軟件的步驟相似的圖像處理步驟，在 圖8中描述的這個(gè)匹配的透射和熒光圖像內(nèi)具有插件。然而，在這種情況下，第一數(shù)字圖像 是熒光圖像，并且第二數(shù)字圖像是直角散射光的圖像。
[0228] 在使用這種方法的15個(gè)樣品中在粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法比較中，這種方法具有0.86的 相關(guān)系數(shù)，并且由用于醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器產(chǎn)生?；貧w線的斜率是0.98,并且回歸 線的截距是0.0。
[0229] 還公開了根據(jù)任何以下實(shí)施方式的方法和設(shè)備：
[0230] 實(shí)施方式1. 一種將在視野內(nèi)的二維物體分類的顯微鏡方法，具有以下步驟：
[0231] a)通過第一電磁輻射源，照射在視野內(nèi)的物體；
[0232] b)在CMOS或C⑶傳感器上投射所產(chǎn)生的圖像，
[0233] c)使用在視野內(nèi)的物體的所產(chǎn)生的數(shù)字表示來識(shí)別顆粒作為在數(shù)字表示內(nèi)的物 體，例如，使用圖像軟件，例如，Image J軟件，
[0234] d)使用每個(gè)物體的邊緣的坐標(biāo)來限定包含在所述物體的數(shù)字表示內(nèi)的限制每個(gè) 物體的區(qū)域的區(qū)域，
[0235] e)確定每個(gè)物體的數(shù)字表示的面積、直徑以及平均強(qiáng)度，
[0236] f)通過從所述物體的數(shù)字表示的邊界中減去一個(gè)像素來可選地分離接觸的顆粒， 以便可以識(shí)別、枚舉并且適當(dāng)?shù)胤诸惤佑|的顆粒；
[0237] g)使用所述邊緣坐標(biāo)來限定與物體的邊緣相鄰但是位于所述物體外面的區(qū)域，以 計(jì)算所述電磁輻射的背景強(qiáng)度，并且從包含在每個(gè)物體的數(shù)字表述的邊緣內(nèi)的物體的電磁 強(qiáng)度中減去這個(gè)平均背景強(qiáng)度；
[0238] h)使用在所述物體的邊緣內(nèi)的區(qū)域的電磁強(qiáng)度，來通過參考標(biāo)準(zhǔn)曲線確定在吸收 光的物體內(nèi)的化學(xué)實(shí)體的濃度；
[0239] i)根據(jù)進(jìn)一步將第一組物體分成子集的需要，根據(jù)提供關(guān)于在所述物體內(nèi)的數(shù)字 表示的預(yù)定邊界內(nèi)的物體的唯一光學(xué)信息的需要，利用盡可能多的電磁輻射源順序詢問相 同的第一物體，以及
[0240] j)通過η個(gè)額外的第一電磁輻射源詢問相同的視野，每個(gè)電磁源通過基于所述物 體的電磁特性來唯一地區(qū)分在所述視野內(nèi)的物體的某種電磁特性區(qū)分開;然后，利用盡可 能多的額外電磁輻射源暴露所述物體，以再細(xì)分包含在由第一輻射源識(shí)別的邊界內(nèi)的物 體。
[0241] 實(shí)施方式2.根據(jù)實(shí)施方式1所述的方法，其中，所述電磁輻射源輻射是具有從 IOOnm到2000nm的波長(zhǎng)的光，所述光包括紫外線、可見以及紅外線光譜的部分。
[0242] 實(shí)施方式3.根據(jù)實(shí)施方式1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述電磁輻射源輻射是 從IOOnm到1000 nm的光，所述光促使熒光激發(fā)天然存在的熒光團(tuán)或認(rèn)為導(dǎo)入的熒光團(tuán)，由所 述激發(fā)的熒光團(tuán)發(fā)射的光用于產(chǎn)生幫助將相應(yīng)的物體分類的圖像。
[0243] 實(shí)施方式4.根據(jù)實(shí)施方式1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述電磁輻射源輻射是 由在所述物體內(nèi)的化學(xué)實(shí)體吸收的從IOOnm到2000nm的光，以便包含所述吸收實(shí)體的相應(yīng) 圖像具有更低強(qiáng)度的檢測(cè)的電磁輻射。
[0244] 實(shí)施方式5.根據(jù)實(shí)施方式1-4中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用通過不同的角 度與所述樣品相貫穿的電磁源，來造成在所述視野內(nèi)的物體具有不同強(qiáng)度的電磁輻射散 射。
[0245] 實(shí)施方式6.根據(jù)實(shí)施方式1-5中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用通過與所述檢 測(cè)的傳感器區(qū)域〇到80度垂直地貫穿在所述視野內(nèi)的物體的電磁輻射，以便所述顯微鏡的 物鏡捕捉通過不同的角度散射的光。
[0246] 實(shí)施方式7.根據(jù)實(shí)施方式1-6中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用具有不同的偏 振特性的電磁源。
[0247] 實(shí)施方式8.根據(jù)實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用引起天然存在 的磷光體或人工導(dǎo)入的磷光體的磷光的電磁源。
[0248] 實(shí)施方式9.根據(jù)實(shí)施方式1-8中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用透射的光源從 血紅蛋白的俗特譜帶創(chuàng)建來自動(dòng)物或人的血液中的紅細(xì)胞的圖像，并且使用這些圖像來計(jì) 算紅細(xì)胞的面積、直徑以及容積、在紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白的濃度，并且其中，通過激發(fā)連接 至在網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)硬蛋白的核酸結(jié)合熒光團(tuán)，在所有紅細(xì)胞之中確定網(wǎng)狀細(xì)胞，并且識(shí) 別具有熒光發(fā)射的那些紅細(xì)胞。
[0249] 實(shí)施方式10.根據(jù)實(shí)施方式1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使用激發(fā)光源檢測(cè)通 過熒光團(tuán)處理的動(dòng)物或人的血液中的白細(xì)胞，并且在檢測(cè)傳感器上投射所述發(fā)射光，以形 成熒光白細(xì)胞的數(shù)字表示。
[0250] 實(shí)施方式11.根據(jù)實(shí)施方式10所述的方法，其中，動(dòng)物或人的血液的白細(xì)胞的檢測(cè) 使用核酸結(jié)合的熒光團(tuán)。
[0251] 實(shí)施方式12.根據(jù)實(shí)施方式11所述的方法，其中，所述核酸結(jié)合的熒光團(tuán)例如但不 限于吖啶酯、或噻唑橙、或溴化乙啶。
[0252] 實(shí)施方式13.根據(jù)實(shí)施方式10-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，計(jì)算所述熒光發(fā)射 實(shí)體的直徑、濃度以及與所述二維熒光圖像對(duì)應(yīng)的物體的容積，并且用于幫助將白細(xì)胞分 成淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞。
[0253] 實(shí)施方式14.根據(jù)實(shí)施方式10-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，兩個(gè)或多個(gè)熒光激 發(fā)源或者兩個(gè)或多個(gè)熒光發(fā)射檢測(cè)波長(zhǎng)用于檢測(cè)不同的熒光種類，以便可以檢測(cè)在白細(xì)胞 內(nèi)的不同實(shí)體，并且熒光的強(qiáng)度和量用于進(jìn)一步將白細(xì)胞的子集分類。
[0254] 實(shí)施方式15.根據(jù)實(shí)施方式1-14中任一項(xiàng)所述的方法，并且使用從300nm到800nm 的可見光，所述可見光通過與所述傳感器從60到90°垂直的角度照亮粒細(xì)胞，以便在白細(xì)胞 內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)顆粒激烈地散射光，而沒有顆粒的細(xì)胞質(zhì)不散射光或者散射具有非常低的強(qiáng)度 的光。
[0255] 實(shí)施方式16.在通過與所述傳感器從60到90°垂直的角度利用300到800nm的光照 亮相同物體所再細(xì)分的這些圖像之中分類粒細(xì)胞，粒細(xì)胞是具有強(qiáng)度的散射光的那些圖 像。
[0256] 實(shí)施方式17.根據(jù)實(shí)施方式1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中，首先使用熒光來確定 人類或動(dòng)物血液的白細(xì)胞，然后，將淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞確定為具有可以忽略的散射光的 圖像。
[0257] 實(shí)施方式18.根據(jù)實(shí)施方式1-17中任一項(xiàng)所述的方法，并且使用1到50個(gè)兆像素 CMOS或CCD傳感器。
[0258] 實(shí)施方式19.根據(jù)實(shí)施方式1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，可以通過電子開關(guān)打 開和關(guān)閉所述電磁源，提供2-10個(gè)不同的電磁源依次詢問相同視野的能力，這僅僅由電磁 源的空間的約束條件以及用于成像所述視野的時(shí)間的約束條件限制。
[0259]實(shí)施方式20.根據(jù)實(shí)施方式1-19中任一項(xiàng)所述的方法，并且具有一次性或者可再 用的觀察室，其包含感興趣顆粒的液體分散并且允許計(jì)算在統(tǒng)計(jì)上的大量顆粒。
[0260]實(shí)施方式21.根據(jù)實(shí)施方式20所述的方法，其中，所述觀察室具有介于50微米與 IOmm之間的厚度。
[0261]實(shí)施方式22.根據(jù)實(shí)施方式18所述的方法，其中，將物鏡放在所述檢測(cè)CMOS或CCD 傳感器之間，所述物鏡提供足夠的放大倍數(shù)，以確定物體尺寸，且還具有充分的視野，以允 許在統(tǒng)計(jì)上大量計(jì)算在所述視野內(nèi)的物體。
[0262]實(shí)施方式23.根據(jù)實(shí)施方式22所述的方法，其中，所述物鏡具有介于2X與15X之間 的放大倍數(shù)。
[0263]實(shí)施方式24.根據(jù)實(shí)施方式1-23中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用用于識(shí)別紅 細(xì)胞的紅細(xì)胞俗特譜帶以及用于檢測(cè)白細(xì)胞的核酸結(jié)合熒光團(tuán)的熒光來檢測(cè)在體液內(nèi)的 紅細(xì)胞和白細(xì)胞，而不分離或溶解紅細(xì)胞。
[0264] 實(shí)施方式25.根據(jù)實(shí)施方式1-23中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法使用球形化試劑， 例如但不限于N-十二烷基-N，N_二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鈉，來將紅細(xì)胞從雙凹圓盤轉(zhuǎn)換 成均勻的球體，并且不影響白細(xì)胞的形態(tài)或散射特性。
[0265] 實(shí)施方式26.根據(jù)實(shí)施方式25所述的方法，所述方法不使用成球形的試劑，而是使 用保持紅細(xì)胞的自然雙凹圓盤形狀的試劑。
[0266] 實(shí)施方式27.根據(jù)實(shí)施方式1-23中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法在30秒到10分鐘 內(nèi)選擇性溶解紅細(xì)