用于體液中的顆粒和可溶性化學(xué)實(shí)體的體外檢測(cè)的系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明總體上涉及體液中的顆粒和化學(xué)實(shí)體的體外檢測(cè)。具體而言，本發(fā)明涉及
[1] 識(shí)別、分類以及計(jì)數(shù)體液中的顆粒和/或(2)確定體液樣品中的可溶性化學(xué)實(shí)體的濃度 的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外醫(yī)學(xué)診斷測(cè)試廣泛地用于檢測(cè)體液中的異常，作為診斷疾病的輔助。大多數(shù) 的這種測(cè)試在復(fù)雜的、高度自動(dòng)化的、昂貴的儀器中處理大量體液樣品的醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室或參 考實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)生，這些儀器需要昂貴的維護(hù)成本，并且需要高技能的操作人員來執(zhí)行和解 釋測(cè)試并且確保儀器適當(dāng)?shù)夭僮鳌?br>[0003] 由于實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)較大并且復(fù)雜，所以個(gè)人不能在家里、在大部分醫(yī)生的辦公室內(nèi) 或者甚至在門診診所或急診室內(nèi)使用。在這些設(shè)置中存在測(cè)試的需要，來減少將樣品輸送 給遠(yuǎn)程實(shí)驗(yàn)室的需要，并且提供更多立即應(yīng)答，這些立即應(yīng)答可以及時(shí)改變患者行為或者 醫(yī)生介入和治療。
[0004] 為了滿足這種床邊檢測(cè)的需要，已經(jīng)研制了幾種系統(tǒng)。最值得一提的是，廣泛使用 葡萄糖測(cè)試儀來監(jiān)控血糖水平，作為控制胰島素使用的輔助，并且改變糖尿病患者的飲食 習(xí)慣。不用儀器的干化學(xué)測(cè)試條用于檢測(cè)尿液(尿液分析)的異常、大便標(biāo)本的直腸的流血、 以及使用尿液分析試條的懷孕。診斷制造商研制了一些系統(tǒng)，用于檢測(cè)在血液和尿液內(nèi)的 細(xì)胞，這些系統(tǒng)不如中心實(shí)驗(yàn)室等效物復(fù)雜，但是這些系統(tǒng)依然相當(dāng)昂貴并且操作復(fù)雜，因 此，未滿足血液學(xué)的護(hù)理裝置的真正需求點(diǎn)。使用儀器儀表的免疫測(cè)定的床邊檢測(cè)系統(tǒng)迄 今為止在很大程度上不成功。
[0005] 顯然，由于實(shí)驗(yàn)室分析人員使用廣泛不同的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)這些類型的化驗(yàn)所需要的 敏感度和精度的苛刻要求，所以沒有單個(gè)儀器或技術(shù)可以執(zhí)行通常在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行的大 量測(cè)試。由于用戶僅僅想要購(gòu)買一種儀器，所以具有可以執(zhí)行大量測(cè)試的儀器是非常可取 的。這不僅減少了初期投資，而且降低了操作和保持很多不同裝置的復(fù)雜度。
[0006] 直到最近，使用數(shù)字成像的床邊檢測(cè)顯微鏡的設(shè)計(jì)不實(shí)際。顯微鏡樣品在研究實(shí) 驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行了一段時(shí)間的數(shù)字成像。直到最近，用于這些系統(tǒng)內(nèi)的傳感器昂貴。而且，直到 最近，傳感器具有有限數(shù)量的像素，構(gòu)成具有差質(zhì)量的顯微鏡數(shù)字圖像的分辨率并且僅僅 允許具有小視野。這個(gè)限制通常難以精確地識(shí)別和分類體液顆粒，并且同時(shí)難以觀看足夠 大的體積，以提供精確地計(jì)算統(tǒng)計(jì)。而且，直到最近，用于顯微鏡檢查中的傳感器的輻射源 昂貴、難以保持并且難以用于簡(jiǎn)單設(shè)計(jì)中。
[0007]過去10年見證了 CMOS和CCD技術(shù)的大幅改進(jìn)，大幅降低價(jià)格并且提高了成像傳感 器的分辨率。電磁輻射源（最明顯地，LED技術(shù)）也具有演變，能夠輻射顯微鏡樣品，用于傳 輸、散射、熒光以及磷光。這些技術(shù)進(jìn)步現(xiàn)在允許設(shè)計(jì)通過新型方式使用這些部件的系統(tǒng)， 以實(shí)現(xiàn)便宜、高質(zhì)量以及通用的數(shù)字顯微鏡。通過使用與用于中心實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)內(nèi)的檢測(cè)器 相當(dāng)?shù)膶?duì)輻射和敏感度具有響應(yīng)的CMOS傳感器，能夠使用利用CMOS傳感器的數(shù)字顯微鏡來 執(zhí)行化學(xué)和免疫測(cè)定測(cè)試，具有與醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)相似的特征。
[0008] 現(xiàn)有醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室儀器在其成本和復(fù)雜性方面也具有缺點(diǎn)。例如，在用于血液學(xué)和 尿液分析的實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞儀內(nèi)，假設(shè)流過檢測(cè)器的顆粒與干擾顆粒廣泛地分開，以便所 獲得的任何信號(hào)來自單個(gè)顆粒，沒有背景干擾。這導(dǎo)致例如，在使用Sysmex分析儀分析的尿 液樣品中具有無定形水晶時(shí)，造成紅血細(xì)胞和白血細(xì)胞的識(shí)別和分類具有誤差。甚至在使 用高度敏感并且昂貴的光電放大器檢測(cè)器時(shí)，使用流動(dòng)分析的所有實(shí)驗(yàn)室血細(xì)胞計(jì)數(shù)器 (流式細(xì)胞儀)必須使用昂貴的激光源，來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)高速穿過該激光源的單細(xì)胞的信號(hào)。這 種方法需要輻射、輻射檢測(cè)部件以及復(fù)雜的射流控制，其昂貴并且需要由高度訓(xùn)練的人員 操作和維修。本發(fā)明克服了在顆粒識(shí)別、分類以及計(jì)算中具有更低成本和更低復(fù)雜度的所 有這些限制。
[0009] 免疫測(cè)定通常需要復(fù)雜的儀器，其協(xié)同多個(gè)反應(yīng)步驟，以實(shí)現(xiàn)很多免疫測(cè)定需要 的高敏感度和特異性。通常，免疫測(cè)定需要分離步驟。這個(gè)步驟尤其需要復(fù)雜的機(jī)械和流體 處理操作，這使低成本分析儀不實(shí)際。本發(fā)明不需要洗滌，因此，使使用在本發(fā)明中描述的 檢測(cè)方法的免疫測(cè)定降低成本和復(fù)雜度，這是在床邊檢測(cè)裝置中可取的特征。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本公開涉及一種將在視野內(nèi)的二維物體分類的顯微鏡方法、一種測(cè)量設(shè)備、以及 一種用于測(cè)量設(shè)備的樣品室。進(jìn)一步，公開了一種執(zhí)行免疫測(cè)定的方法以及一種執(zhí)行期望 的化學(xué)實(shí)體的化驗(yàn)的方法。
[0011] 本公開涉及一種體外診斷測(cè)試系統(tǒng)和方法，用于執(zhí)行血液學(xué)、化學(xué)、尿液分析以及 與使用體液的免疫測(cè)定相似的測(cè)試。本發(fā)明可以使用具有有線或無線連接性的任何計(jì)算 機(jī)，例如，USB端口或藍(lán)牙連接能力，分別用于與單獨(dú)顯微鏡測(cè)量設(shè)備通信。本發(fā)明可以使用 嵌入測(cè)量設(shè)備內(nèi)的計(jì)算機(jī)。
[0012] 計(jì)算機(jī)可以與臺(tái)式計(jì)算機(jī)一樣復(fù)雜，或者與平板電腦一樣簡(jiǎn)單，例如，微型iPad或 Samsung Galaxy。包含應(yīng)用軟件，其允許用戶識(shí)別樣品，選擇要進(jìn)行的測(cè)試，并且開始測(cè)試 序列。使用藍(lán)牙無線地或者通過USB連接硬連線地將高電平信號(hào)傳輸給顯微鏡設(shè)備?？商娲?地，計(jì)算機(jī)可以嵌入測(cè)量設(shè)備內(nèi)。
[0013] 公開一種將在視野內(nèi)的作為二維物體的顆粒分類的顯微鏡方法。所述方法可以包 括通過第一電磁輻射源，照射所述視野;并且投射所產(chǎn)生的圖像(第一圖像)在圖像傳感器 上，以獲得所述視野的第一數(shù)字表示。所述方法可以包括使用所述第一數(shù)字表示來識(shí)別在 所述第一數(shù)字表示內(nèi)的第一物體;并且使用所述第一物體邊緣的邊緣坐標(biāo)來限定包含在所 述第一物體的第一數(shù)字表示內(nèi)的限制所述第一物體的區(qū)域的區(qū)域，然后，確定所述第一物 體的一個(gè)或多個(gè)物體特性?？蛇x地，該方法包括通過從所述第一物體的第一數(shù)字表示的邊 界中減去一個(gè)像素來分離接觸的顆粒。所述方法可以包括使用所述邊緣坐標(biāo)或至少一些邊 緣坐標(biāo)來限定與第一物體的邊緣相鄰但是位于所述第一物體外面的區(qū)域，以計(jì)算所述第一 電磁輻射的背景強(qiáng)度，并且補(bǔ)償背景強(qiáng)度，例如，通過從所述第一物體的電磁強(qiáng)度中減去這 個(gè)平均背景強(qiáng)度。所述方法可以包括使用在所述第一物體(第一圖像)的邊緣內(nèi)的區(qū)域的電 磁強(qiáng)度，來通過參考標(biāo)準(zhǔn)曲線或其他參考曲線，確定在吸收光的第一物體內(nèi)的顆粒特性。
[0014] 還公開了一種顯微鏡測(cè)量設(shè)備，其包括圖像傳感器、物鏡以及一個(gè)或多個(gè)電磁輻 射源，包括用于照射顯微鏡鏡臺(tái)的第一電磁輻射源和/或用于照射顯微鏡鏡臺(tái)的第二電磁 輻射源。所述圖像傳感器可有線或者無線連接至單獨(dú)計(jì)算機(jī)，所述計(jì)算機(jī)被配置為從在所 述顯微鏡設(shè)備內(nèi)的所述圖像傳感器收集的圖像中識(shí)別物體并且將物體分類。
[0015] 進(jìn)一步，公開了一種供顯微鏡測(cè)量設(shè)備使用的樣品室，所述樣品室包括相隔5和50 微米的兩個(gè)平面，用于包含樣品，所述樣品室被配置為包含介于5與IOOuL之間的液體，所述 樣品室的形狀允許使樣品均勻地并且可再現(xiàn)地填充至所述樣品室，并且防止在完成分析之 前移動(dòng)樣品或者蒸發(fā)樣品。
[0016] 公開了一種進(jìn)行免疫測(cè)定的方法，所述方法使用顯微鏡測(cè)量設(shè)備，所述顯微鏡測(cè) 量設(shè)備包括圖像傳感器、物鏡、用于修改輻射、發(fā)射或散射輻射的光特性和/或用于引導(dǎo)透 射、散射的電磁福射以及發(fā)射的電磁福射的可選的濾光器組件、可以導(dǎo)通和斷開的至少一 個(gè)電磁輻射源，并且所述顯微鏡測(cè)量設(shè)備被配置為與單獨(dú)計(jì)算機(jī)有線或者無線通信，該計(jì) 算機(jī)包含成像軟件并且被配置為從在所述顯微鏡設(shè)備內(nèi)的所述圖像傳感器收集的圖像中 識(shí)別物體并且將物體分類。所述方法包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟：
[0017] a)使用連接至以介于每分鐘0 · Imm與每分鐘2mm之間的速率沉淀在水溶液中的分 散的固相顆粒的特異性抗體以及特異性地結(jié)合于全血中的分析物的顆粒上的抗體；
[0018] b)競(jìng)爭(zhēng)性使用標(biāo)記的分析物或者非競(jìng)爭(zhēng)性地使用標(biāo)記的覆蓋抗體，檢測(cè)連接至抗 體結(jié)合的固相的分析物，其中，分散的顆粒沉淀到觀察室的底部，選擇觀察室的高度以提供 足夠濃度的顆粒，使得實(shí)現(xiàn)化驗(yàn)的期望敏感度不需要洗滌步驟，其中，沉淀顆粒的圖像由第 一電磁輻射來識(shí)別，并且確定該第一圖像的物體的邊界或邊緣，以及
[0019] c)在暴露到第二電磁福射中之后，確定位于由第一電磁福射限定的邊界內(nèi)的電磁 輻射的強(qiáng)度；以及
[0020] d)在暴露到第二電磁福射中之后，確定位于由第一電磁福射限定的邊界外的電磁 輻射的強(qiáng)度，并且從位于由第一電磁輻射限定的邊界內(nèi)的電磁輻射的強(qiáng)度中減去位于由第 一電磁輻射限定的邊界外的電磁輻射的強(qiáng)度，有效地減去背景電磁輻射，由此比較第二電 磁輻射的強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線，以推導(dǎo)出化驗(yàn)的分析物的濃度。
[0021] 進(jìn)一步地，公開了一種使用結(jié)合伴侶進(jìn)行期望化學(xué)實(shí)體的化驗(yàn)的方法，用于連接 至可分散的固相物體的期望化學(xué)實(shí)體，所述顯微鏡測(cè)量設(shè)備包括圖像傳感器、物鏡、用于修 改輻射、發(fā)射或散射輻射的光特性和/或用于引導(dǎo)透射、散射的電磁輻射以及發(fā)射的電磁輻 射的可選的濾光器組件、能夠?qū)ê蛿嚅_的至少一個(gè)電磁輻射源，并且所述顯微鏡測(cè)量設(shè) 備被配置為與單獨(dú)的計(jì)算機(jī)有線或者無線地通信，所述計(jì)算機(jī)包含成像軟件并且被配置為 識(shí)別并且分類從所述顯微鏡測(cè)量設(shè)備中的所述圖像傳感器收集的圖像中的物體，并且控制 用于按照通過以下將視野內(nèi)的二維物體分類的方法來操作顯微鏡的軟件：
[0022] a)利用第一電磁輻射源來輻射所述視野內(nèi)的物體，
[0023] b)將生成的圖像投射到圖像傳感器上，
[0024] c)使用所述視野內(nèi)的物體的生成的數(shù)字表示，來使用ImageJ軟件識(shí)別顆粒作為所 述數(shù)字表示內(nèi)的物體，
[0025] d)使用每個(gè)物體的邊緣的坐標(biāo)來限定在所述物體的所述數(shù)字表示內(nèi)包含的圍繞 每個(gè)物體的區(qū)域的區(qū)域，
[0026] e)確定每個(gè)物體的數(shù)字表示中的面積、直徑和平均強(qiáng)度，
[0027] f)通過從所述物體的所述數(shù)字表示的邊界中減去一個(gè)像素來分離接觸的顆粒，使 得接觸顆粒能夠被識(shí)別、枚舉和適當(dāng)?shù)胤诸悾?br>[0028] g)使用所述邊緣坐標(biāo)來限定與物體的邊緣相鄰但是位于所述物體外面的區(qū)域，以 計(jì)算電磁源的背景強(qiáng)度，并且從每個(gè)物體的數(shù)字表示的邊緣內(nèi)包含的物體的電磁強(qiáng)度中減 去平均的該背景強(qiáng)度，
[0029] h)使用在物體的邊緣內(nèi)的區(qū)域的電磁強(qiáng)度，來通過參考標(biāo)準(zhǔn)曲線確定在吸收光的 物體內(nèi)的化學(xué)實(shí)體的濃度，
[0030] i)根據(jù)將所述第一組物體進(jìn)一步分類到子集的需要，根據(jù)提供關(guān)于所述物體的所 述數(shù)字表示的預(yù)定邊界內(nèi)的物體的唯一光學(xué)信息的需要，利用盡可能多的電磁源順序地詢 問相同的第一物體，以及
[0031] j)利用η個(gè)額外的第一電磁輻射源詢問相同視野，每個(gè)電磁輻射源因以下而區(qū)分 開:基于物體的電磁特性來唯一地區(qū)分所述視野內(nèi)的物體的一些電磁特性;然后，利用盡可 能多的額外電磁輻射源曝光物體，以細(xì)分包含在由第一電磁輻射源識(shí)別的邊界內(nèi)的物體，
[0032] k)使用連接至分散的固相的任何結(jié)合伴侶，來捕捉體液中的期望的化學(xué)實(shí)體，并 且競(jìng)爭(zhēng)性地使用所述化學(xué)實(shí)體的第二標(biāo)記的捕捉伴侶或者非競(jìng)爭(zhēng)性地使用所述期望的化 學(xué)實(shí)體的標(biāo)記的衍生物來檢測(cè)所述期望的化學(xué)實(shí)體；
[0033] 1)其中，分散的顆粒沉淀到觀察室的底部，選擇觀察室的高度以提供足夠濃度的 顆粒，使得實(shí)現(xiàn)化驗(yàn)的期望敏感度不需要洗滌步驟；
[0034] m)其中，沉淀顆粒的圖像由第一電磁輻射來識(shí)別，并且確定該第一圖像的物體的 邊界或邊緣；
[0035] η)以及在暴露于第二電磁福射中之后，確定位于由所述第一電磁福射限定的邊界 內(nèi)的電磁輻射的強(qiáng)度；以及
[0036] 〇)在暴露于第二電磁福射中之后，確定位于由所述第一電磁福射限定的邊界外的 電磁輻射的強(qiáng)度，并且從位于由所述第一電磁輻射限定的邊界內(nèi)的電磁輻射的強(qiáng)度中減去 位于由所述第一電磁輻射限定的邊界外的電磁輻射的強(qiáng)度；以及
[0037] ρ)比較所述第二電磁輻射的強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線，以推導(dǎo)化驗(yàn)的分析物的濃度。
[0038] 顯微鏡設(shè)備的寬度和高度與iPad相似，但是幾英寸的厚度(雖然具有更大的版本） 在某些應(yīng)用中有用。該設(shè)備的設(shè)計(jì)具有簡(jiǎn)單的概念，并且制造和操作成本低。
[0039]顯微鏡設(shè)備使用顯微鏡檢測(cè)來檢測(cè)在體液內(nèi)的顆粒，例如，白血細(xì)胞或紅血細(xì)胞。 為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，該設(shè)備具有利用不同波長(zhǎng)、方向以及特性的照射依次照射樣品的陣列。 樣品吸收、散射并且可以重新發(fā)射由物鏡放大的電磁輻射的并且投射在CMOS或CCD傳感器 上。傳感器的數(shù)字圖像傳送給計(jì)算機(jī)，其中，圖像處理軟件識(shí)別、分類并且枚舉在圖像內(nèi)物 體。
[0040] 本發(fā)明的獨(dú)特特征是使用物體的不同照射裝置獲得視野的多個(gè)圖像的概念，而視 野保持靜止。通過使用不同照射裝置獲得視野的多個(gè)圖像，最終能夠正確地識(shí)別和分類物 體。
[0041] 本發(fā)明的另一個(gè)特征在于，使用電磁輻射的一個(gè)源的第一數(shù)字圖像用于基于在這 個(gè)圖像內(nèi)的每個(gè)物體的一個(gè)照射特性來識(shí)別物體坐標(biāo)和邊界，然后，使用不同的電磁輻射 捕捉一個(gè)或多個(gè)額外圖像。由于具有使每個(gè)圖像注冊(cè)(registering)至第一個(gè)圖像的裝置， 所以能夠驗(yàn)證每個(gè)數(shù)字圖像的特性是第一物體的特性。在基于單個(gè)圖像的普通顯微鏡中， 背景信號(hào)可以誤解為屬于物體。
【附圖說明】
[0042]圖1示出了通過利用第一電磁輻射，接著利用第二電磁輻射照射樣品中沉淀到樣 品室的底部的物體所創(chuàng)建的數(shù)字圖像的實(shí)施例；
[0043]圖2示出了與包含圖像處理應(yīng)用程序和用戶界面軟件的計(jì)算機(jī)一起使用的顯微鏡 測(cè)量設(shè)備的構(gòu)造；
[0044] 圖3示出了顯微鏡測(cè)量設(shè)備的部件的示意圖；
[0045] 圖4不出了樣品室的側(cè)視圖和頂視圖的不意圖；
[0046] 圖5示出了計(jì)算機(jī)上的軟件應(yīng)用程序和顯微鏡測(cè)量設(shè)備上的固件應(yīng)用程序以及軟 件和固件應(yīng)用程序如何協(xié)同處理的示例性步驟；
[0047] 圖6示出了操作人員可以執(zhí)行的用于處理血液樣品的步驟；
[0048] 圖7示出了使用本發(fā)明的免疫測(cè)定應(yīng)用；以及 [0049 ]圖8示出了針對(duì)網(wǎng)狀細(xì)胞應(yīng)用的圖像處理步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 在本發(fā)明的以下描述中，參照構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖的描述，并且在附圖中 通過說明的方式，示出了說明本發(fā)明的原理的示例性實(shí)施方式以及可以實(shí)踐本發(fā)明的方 式。要理解的是，其他實(shí)施方式可以用于實(shí)踐本發(fā)明，并且在不背離本發(fā)明的范圍的情況 下，可以對(duì)其作出結(jié)構(gòu)和功能的變化。進(jìn)一步，關(guān)于附圖記載的特征不必限于在圖中公開的 特征的具體組合。
[0051] 所述方法可以包括根據(jù)將第一物體進(jìn)一步分類成第一子集的需要，根據(jù)提供關(guān)于 第一物體的第一數(shù)字表示的預(yù)定邊界內(nèi)的第一物體的唯一光學(xué)信息的需要，利用盡可能多 的電磁福射源，例如至少2個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)來順序地詢問（interrogating)第一物體。
[0052] 所述方法可以包括通過第二電磁輻射源詢問所述視野，以獲得所述視野的第二數(shù) 字表示，所述第二電磁輻射源與第一電磁輻射源由一些電磁特性來區(qū)分開，基于第二物體 的電磁特性唯一地區(qū)分在所述視野內(nèi)的第二物體。然后，所述方法可以包括根據(jù)進(jìn)一步將 所述第二物體分成第二子集的需要，根據(jù)提供關(guān)于所述第二數(shù)字表示的第二物體的唯一光 學(xué)信息的需要，利用盡可能多的額外電磁輻射源來暴露所述第二物體，以再細(xì)分包含在由 第一電磁輻射源識(shí)別的邊界內(nèi)的物體。
[0053]所述電磁輻射源輻射可以被配置為輻射具有從IOOnm到2000nm的范圍中選擇的波 長(zhǎng)的光。所述光可以包括紫外線、可見以及紅外線光譜的部分。
[0054]所述電磁輻射源輻射可以被配置為輻射從IOOnm到1000 nm的范圍中選擇的波長(zhǎng)的 光。所述光可以促使天然存在的熒光團(tuán)或人工導(dǎo)入的熒光團(tuán)的熒光激發(fā)。由所述激發(fā)的熒 光團(tuán)發(fā)射的光可以用于產(chǎn)生幫助將相應(yīng)的物體分類的圖像。
[0055]所述電磁輻射源輻射可以被配置為輻射從IOOnm到2000nm的范圍中選擇的波長(zhǎng)的 光?？梢杂稍谒鑫矬w內(nèi)