。在4%的甲醛中 固定細(xì)胞30分鐘，然后用30mM甘氨酸處理10分鐘。用0.5%曲通X-100(tritonX-100) 對細(xì)胞進(jìn)行透化5分鐘，接著用2%BSA預(yù)處理1小時。于4°C下用FITC標(biāo)記的E-鈣粘蛋 白一級抗體（BioLegend公司，美國）處理細(xì)胞16-18小時。最后，用用于染色細(xì)胞核的 DAPI(4'，6-雙脒-2-苯基吲哚，藍(lán)色）溶液處理細(xì)胞，引起DAPI染色。一完成染色，即將附 著有染色的細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，接著封固。在熒光顯微鏡（Olympus公司，日本） 下觀察染色的細(xì)胞。
[0227] 結(jié)果，如圖2C中所示，正常HCT116細(xì)胞和KRS過表達(dá)細(xì)胞系中的細(xì)胞粘附區(qū)中觀 察到E-鈣粘蛋白的正常表達(dá)，而當(dāng)KRS表達(dá)被抑制時，細(xì)胞粘附區(qū)中E-鈣粘蛋白表達(dá)被 抑制。然而，細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合或粘附未被影響。使用β-連環(huán)蛋白即用于確定細(xì)胞-細(xì)胞 粘附的另一種標(biāo)記物的測試顯示一致的結(jié)果（圖2C)。如圖2D中所示，將KRS敲除細(xì)胞系 (shKRS2ushKRS5 4)與KRS表達(dá)HCT116親本細(xì)胞和KRS過表達(dá)細(xì)胞系（Myc-KRS-WT)進(jìn)行 比較。結(jié)果，與EMT(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）標(biāo)記蛋白表達(dá)的模式不同，shKRS2挪shKRS5 4中 的細(xì)胞-細(xì)胞接觸沒有變化，并因此，細(xì)胞正常形成集落（圖2D)。盡管二維環(huán)境中EMT標(biāo) 記蛋白表達(dá)已改變，板上生長的那些細(xì)胞的形態(tài)和形狀沒有變化，表明KRS表達(dá)未引起完 全EMT，但導(dǎo)致不完全EMT。
[0228] 實施例4:對層粘連蛋白（10 u g/ml)預(yù)涂覆的二維培養(yǎng)環(huán)境中的其中已講行調(diào)棹 伸KRS被表汰或不被表汰的細(xì)朐系中的細(xì)朐粘附信號傳導(dǎo)閔子的研究
[0229] 據(jù)以前報道，KRS已從細(xì)胞質(zhì)移入細(xì)胞質(zhì)膜后，KRS涉及與細(xì)胞迀移層粘連蛋白劑 量依賴性相關(guān)的信號傳導(dǎo)活性（KimDG等，F(xiàn)ASEBJ. 20120ct;26(10) :4142-59)。因此，為 了研究KRS表達(dá)和細(xì)胞-ECM粘附之間的相關(guān)性，發(fā)明人制備了細(xì)胞懸浮液，混合1小時， 然后將其再分布至層粘連蛋白涂覆的培養(yǎng)皿上。通過測量與粘著斑如FAK、Src、粧蛋白和 ERK有關(guān)的那些蛋白的表達(dá)和磷酸化來研究KRS介導(dǎo)的細(xì)胞粘附相關(guān)的信號傳導(dǎo)活性。
[0230] 具體而言，從培養(yǎng)皿分離HCT116親本細(xì)胞、KRS敲除細(xì)胞系和KRS過表達(dá)細(xì)胞系， 接著離心以從培養(yǎng)液分離細(xì)胞。其后，已使用用補(bǔ)充有2%FBS(用以獲得健康細(xì)胞，同時 最小化血清的作用）和1%BSA的無血清RPMI1640培養(yǎng)基制備的重鋪緩沖液作為培養(yǎng)基。 通過使用血細(xì)胞計數(shù)器計算細(xì)胞數(shù)量，然后額外向其中加入重鋪緩沖液以使細(xì)胞密度為 0. 2X106個細(xì)胞或2X10 6個細(xì)胞，接著分布在e管中。用重鋪緩沖液裝管將總體積調(diào)節(jié)為 lml。將已用YH16899處理的HCT116親本細(xì)胞與重鋪緩沖液混合（最終濃度：10μΜ)。于 37°C下將懸浮液搖晃1小時。已預(yù)涂覆有層粘連蛋白（10μg/ml)過夜的培養(yǎng)皿和蓋玻片 用PBS洗滌兩次，向其中加入重鋪緩沖液，于37°C下靜置。將細(xì)胞混合1小時用于免疫熒 光檢測。精確地，將細(xì)胞以0. 2X106細(xì)胞/孔的密度分布在含層粘連蛋白涂覆的蓋玻片的 6孔板中，并以2X106細(xì)胞的密度分布在為免疫印跡法準(zhǔn)備的層粘連蛋白涂覆的60mm的 皿中，接著在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。將用于免疫熒光檢測的樣品用PBS洗滌兩次，接 著在4%甲醛中固定15分鐘。然后，用30mM甘氨酸處理細(xì)胞10分鐘，接著用0.5 %曲通 X-100透化5分鐘。然后，用3%BSA進(jìn)行封閉1小時。于4°C下用未標(biāo)記的p_ERK(Cell signaling公司）、p-Tyrll8_ 粧蛋白（SantaCruzBiotech公司）或p_Tyr397_FAK(Abeam 公司）抗體對其處理16-18小時，并于室溫下用二級抗體對其處理2小時。使用鬼筆環(huán)肽 (phalloidin)進(jìn)行肌動蛋白染色后，用DAPI(4'，6-雙脒-2-苯基吲哚，藍(lán)色）對其處理用 于細(xì)胞核染色。將用于免疫印跡法的樣品用PBS洗滌兩次，然后通過用裂解緩沖液（50mM Tris-HCl，pH7. 4、1%ΝΡ-40、0. 25%脫氧膽酸鈉、150mMNaCl、lmMEDTA)對其處理提取蛋 白。將蛋白定量，然后對制備的樣品進(jìn)行免疫印跡法。
[0231] 結(jié)果，與KRS表達(dá)親本細(xì)胞系和KRS過表達(dá)細(xì)胞系（Myc-KRS-WT)相比，KRS敲除 細(xì)胞系（shKRS2 ^shKRS5 4)中根據(jù)細(xì)胞粘附的Src、ERK和粧蛋白的磷酸化顯著降低。然而， FAK的磷酸化沒有變化（圖3A)。因此確定在沒有被FAK介導(dǎo)的情況下，認(rèn)為取決于KRS 的ERK和粧蛋白的磷酸化通過KRS信號傳導(dǎo)活性而被誘導(dǎo)。用粘著斑相關(guān)的蛋白如p-ERK 和粧蛋白進(jìn)行免疫染色。結(jié)果，ERK和粧蛋白的磷酸化水平在KRS表達(dá)親本細(xì)胞和KRS過表 達(dá)細(xì)胞系中高，但在KRS敲除細(xì)胞系中降低，這與免疫印跡法的結(jié)果一致（圖3B和3C)。當(dāng) 用10μΜ的YH16899即抑制KRS和層粘連蛋白受體之間的輒合的抑制劑處理細(xì)胞（KimDG 等，NatChemBiol.2014Jan;10(l):29-34.)時，與未用抑制劑處理的對照相比，用抑制劑 處理的KRS表達(dá)親本細(xì)胞和KRS過表達(dá)細(xì)胞系中Scr、ERK和粧蛋白的磷酸化水平降低（圖 3A)。使用p-ERK和粧蛋白的免疫熒光檢測的結(jié)果也是一致的（圖3E和圖3F)。上述結(jié)果 證實KRS在細(xì)胞-ECM粘附相關(guān)的信號傳導(dǎo)因子活性中起重要作用。然而，用KRS抑制劑或 YH16899處理HCT116未引起Tyr397磷酸化的任何變化（圖3B)，同樣細(xì)胞形態(tài)或伸展也沒 有多大差異（圖3D和3G)。
[0232] 實施例5:對二維培養(yǎng)環(huán)境中通討抑制KRS抑制來抑制細(xì)朐-細(xì)朐外基質(zhì)（ECM)粘 附相關(guān)的信號傳導(dǎo)活件的研究
[0233] 進(jìn)行免疫印跡法以研究在二維培養(yǎng)環(huán)境中通過與實施例〈2_1>中描述的相同方 式建立的細(xì)胞系中的細(xì)胞-ECM粘附和粘附相關(guān)的信號傳導(dǎo)活性。將細(xì)胞再分布在特定ECM 預(yù)涂覆的培養(yǎng)容器（無血清）中，用于研究細(xì)胞-ECM粘附信號傳導(dǎo)活性。在兩個小時內(nèi)， 確定細(xì)胞粘附相關(guān)的信號傳導(dǎo)因子活性。這時，通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法進(jìn) 行信號傳導(dǎo)活性的研究（Juliano等，2001)。
[0234] 具體而言，這時，使用pY397FAK(Abeam公司，大不列顛）、pY577FAK(SantaCruz公司， 美國）、pY861FAK(SantaCruz公司，美國）、pY925FAK(SantaCruz公司，美國）、FAK(Santa Cruz公司，美國）、p-ERK(cellsignaling公司，美國）、ERK(cellsignaling公司，美 國）、KRS(Abeam公司，大不列顛）、pY416c_Src(cellsignaling公司，美國）、c_Src(Santa Cruz公司，美國）、pYlls粧蛋白（SantaCruz公司，美國）、粧蛋白（BDTransduction Laboratories公司，美國）以及α-微管蛋白（Sigma公司，美國）的一級抗體。
[0235] 將補(bǔ)充有1 %BSA的無血清培養(yǎng)液中的KRS表達(dá)HCT116親本細(xì)胞系、KRS敲除細(xì) 胞系（shKRS2郴shKRS5 4)和KRS過表達(dá)細(xì)胞系再分布在纖連蛋白（10μg/ml)預(yù)涂覆的培 養(yǎng)皿中。兩小時后，獲得細(xì)胞提取物，接著通過與實施例〈1-2>中描述的相同方式進(jìn)行免疫 印跡法。
[0236] 結(jié)果，如圖4A中所示，KRS表達(dá)HCT116親本細(xì)胞系和KRS過表達(dá)細(xì)胞系中觀察到 FAK和ERK的磷酸化，但KRS敲除細(xì)胞系中FAK和ERK的磷酸化顯著降低（圖4A)。如圖4B 中所示，與HCT116親本細(xì)胞系相比，KRS敲除細(xì)胞系中c-Src和粧蛋白的磷酸化顯著降低， 且具體而言，粧蛋白表達(dá)的抑制更顯著（圖4B)。如圖4C中所示，與KRS表達(dá)親本細(xì)胞系 和KRS過表達(dá)細(xì)胞系相比，KRS敲除細(xì)胞系中FAK的磷酸化僅略微降低，但ERK的磷酸化顯 著降低（圖4C)。上述結(jié)果表明KRS在細(xì)胞-ECM粘附相關(guān)的信號傳導(dǎo)因子活性中起重要作 用。
[0237] 實施例6:通討抑制二維培養(yǎng)環(huán)境中的KRS表汰來抑制粘著斑
[0238] 進(jìn)行免疫熒光檢測，以研究細(xì)胞-ECM粘附介導(dǎo)的粘著斑形成是否依賴于KRS表 達(dá)。
[0239] 具體而言，將補(bǔ)充有1%BSA的無血清培養(yǎng)液中的KRS表達(dá)HCT116親本細(xì)胞系、 KRS敲除細(xì)胞系（shKRS2郴shKRS5 4)和KRS過表達(dá)細(xì)胞系再分布在層粘連蛋白（10μg/ ml)或纖連蛋白（10μg/ml)預(yù)涂覆的蓋玻片中。兩小時后，通過與實施例〈3-3>中描述的 相同方式進(jìn)行免疫熒光檢測。這時，使用Tyr397磷酸化的FAK-級抗體（pY397FAK)和DAPI 將細(xì)胞核染色。
[0240] 結(jié)果，如圖3D中所示，富含pY397FAK的粘著斑在纖連蛋白涂覆的二維培養(yǎng)環(huán)境中 的HCT116親本細(xì)胞系和KRS過表達(dá)細(xì)胞系中充分發(fā)展，而KRS敲除細(xì)胞系中的pY397FAK 并沒有很好地染色為斑點，從而相信粘著斑被顯著抑制（圖4D)。上述結(jié)果表明KRS在細(xì) 胞-ECM粘附中起重要作用。然而，在已用對于KRS起作用來說是必需的層粘連蛋白預(yù)處理 的二維環(huán)境中，其中KRS表達(dá)被抑制或用KRS抑制劑處理的細(xì)胞中的pERK和p-Tyrl18粧蛋 白斑點減少。同時，通過KRS表達(dá)或經(jīng)KRS抑制劑處理，Tyr397磷酸化的FAK的位置和相關(guān) 的細(xì)胞形態(tài)沒有差異。因此，確定KRS表達(dá)在包括ERK和粧蛋白的細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM) 粘附信號傳導(dǎo)中起重要作用。
[0241] 實施例7:通討抑制三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的球狀聚集的細(xì)朐中的KRS表 汰抑制ERK和樁蛋白的表汰和活件
[0242] 〈7_1>三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中HCT116細(xì)朐的培養(yǎng)
[0243] 為了在三維膠原凝膠環(huán)境中培養(yǎng)球狀聚集的細(xì)胞，將10X再生緩沖液（2. 2g碳 酸氫鈉、4.8gHEPES(100ml))、10XRPMI培養(yǎng)基、I型膠原蛋白（BDBioscience公司，美 國）、2N的NaOH和無血清的RPMI-1640完全混合，生成含I型膠原蛋白的溶液（最終濃度： 2. 0-2. 5mg/ml)。在冰上完成所有過程，以防止膠原蛋白凝固。將制備的溶液裝載在與共 焦顯微鏡培養(yǎng)體系或PDMS(聚二甲硅氧烷）配套的磁性4孔室（LiveCellInstrument公 司，韓國）中，孔直徑為1〇_。這時，將不含細(xì)胞的膠原蛋白溶液在孔底板上薄薄地鋪開，以 形成膠原蛋白底層，向該底層加入細(xì)胞和膠原蛋白混合液，接著在37°C培養(yǎng)箱中固化30分 鐘。將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)2天，直到形成球狀聚集的細(xì)胞，使用細(xì)胞篩（SPL公司，韓國）過 濾以除去大小大于70μm的那些聚集的細(xì)胞。因此，收集已通過70μm孔的那些球狀聚集 的細(xì)胞，并用無血清RPMI1640洗滌兩次。然后，通過離心沉淀細(xì)胞。除去培養(yǎng)基后，將膠原 蛋白溶液加入剩余的細(xì)胞中，完全混合。將混合液按80-150μ1傾倒至PDMS、培養(yǎng)容器或 48孔板的各孔中，接著在37°C培養(yǎng)箱中固化30分鐘。當(dāng)混合液完全固化時，向其中加入補(bǔ) 充有FBS的RPMI-1640。
[0244] 結(jié)果，如圖1D中所示，球狀聚集的細(xì)胞系隨時間長得越來越大，在光學(xué)顯微鏡下 觀察為暗色，表明細(xì)胞系增殖（圖1D)。
[0245] 〈7-2>:通討抑制三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中的KRS表汰來抑制ERK和樁蛋白的表汰 和活件
[0246] 確定了與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附相關(guān)的KRS在二維環(huán)境中培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞系 中的重要性。這時，還確定了通過抑制KRS表達(dá)，F(xiàn)AK、ERK、粧蛋白和c-Src的磷酸化以及粧 蛋白的表達(dá)顯著降低。本發(fā)明人進(jìn)行免疫印跡法以研究三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中的球狀聚 集的細(xì)胞中是否觀察到相同的模式。
[0247] 具體而言，本文中使用通過與實施例〈2_1>中描述的相同方式建立的細(xì)胞系。通 過與實施例〈7_1>中描述的相同方式培養(yǎng)KRS表達(dá)HCT116親本細(xì)胞系、KRS敲除細(xì)胞系 (shKRS2pshKI^ 2、shKRS2 3和shKRS5 4)和KRS過表達(dá)細(xì)胞系。這時，將細(xì)胞系置于三維膠原 蛋白凝膠環(huán)境中。3-4小時后，從其獲得樣品。精確地，使用可去掉的黃色槍頭（tipped-off yellowtip)拾取含有在48孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞的膠原蛋白凝膠和培養(yǎng)基，并將其收集在 1. 7ml微量離心管中。于4°C下以5000Xg離心1分鐘。除去上清液，并將剩下的小顆粒 (pellet)用冷PBS洗滌兩次，接著也以相同的速度離心1分鐘。向小顆粒中加入100μ1的 含1 %SDS、Na3(V^P蛋白酶抑制劑混合物（GenDepot公司，美國）的裂解緩沖液，接著于4°C 下反應(yīng)至少1小時。于4°C下以13000Xg離心30分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管 中。向上清液中加入4X樣品緩沖液，于KKTC下煮沸5分鐘，導(dǎo)致樣品的制備。通過與實 施例〈1-2>中描述的相同方式進(jìn)行后續(xù)流程。這時，使用pY397FAK、pY577FAK、FAK、pY416c-Src、 p-ERK、ERK、粧蛋白、KRS和α-微管蛋白的一級抗體。
[0248] 結(jié)果，如圖5中所示，與表達(dá)KRS的細(xì)胞系相比，三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的 KRS敲除細(xì)胞系中FAK的磷酸化未特別地減少，相反，三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中該磷酸化隨 培養(yǎng)時間增加，表明三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中FAK磷酸化與KRS表達(dá)不相關(guān)。然而，三維膠 原蛋白凝膠環(huán)境中的KRS敲除細(xì)胞系中ERK的磷酸化和粧蛋白的表達(dá)顯著被抑制。在二維 環(huán)境中培養(yǎng)的KRS過表達(dá)細(xì)胞系中，ERK磷酸化甚至在懸浮液條件中顯著增加，表明KRS表 達(dá)與ERK的磷酸化和激活以及粧蛋白表達(dá)密切相關(guān)。
[0249] 實施例8:對KRS表汰抑制、ETK激活抑制或KRS功能抑制對三維（3D)膠原蛋白凝 膠環(huán)境中的ERK活件以及樁蛋白表汰和激活的負(fù)而影響的研究
[0250] 為了研究三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞中是否觀察到粘著斑相關(guān)的蛋白 表達(dá)模式的KRS依賴性變化，對在三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的正常HCT116細(xì)胞、KRS 敲除細(xì)胞系（shKRS2 ^shKRS5 4)和用MEK/ERK選擇性抑制劑U0126和KRS抑制劑YH16899 處理的細(xì)胞系進(jìn)行免疫染色1天，以測量ERK磷酸化和粧蛋白表達(dá)，接著在共焦顯微鏡下觀 察。
[0251] 具體而言，將I型膠原蛋白分布在PDMS中，不進(jìn)行處理（圖6A和圖6B)或用 U0126(50mM)或YH16899(50mM)處理一天（圖6C和圖6D)。使含有培養(yǎng)的細(xì)胞的膠原蛋白 凝膠在4%的甲醛中固定30分鐘，接著用30mM甘氨酸處理30分鐘。通過使用0.5%曲通 X-100誘導(dǎo)透化30分鐘，接著用3%BSA溶液封閉2小時。于4°C下用未標(biāo)記的p_ERK(cell signaling公司）和粧蛋白（BDbioscience公司）抗體對其處理至少16-18小時，接著于 室溫下用二級抗體處理至少4小時。最后，用DAPI(4'，6-雙脒-2-苯基吲哚）溶液對其處 理，以將細(xì)胞核染色。在共焦顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞。
[0252] 由于p-ERK免疫染色，在正常HCT116球狀細(xì)胞中的細(xì)胞核內(nèi)部和周圍區(qū)域中觀察 到染色的斑點（圖6A和6C)。還確定了粧蛋白染色強(qiáng)陽性，從而在粘著斑區(qū)域中觀察到粧 蛋白斑點（圖6B和6D)。然而，確定了在KRS敲除細(xì)胞系和用U0126和YH16899處理的細(xì) 胞系的球狀體中，ERK磷酸化水平非常低（圖6A和6C)，并且粧蛋白免疫染色水平顯著降低 (圖6B和6D)。上述結(jié)果表明細(xì)胞從三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的HCT116的球狀體的 KRS依賴性播散與ERK活性和粧蛋白表達(dá)密切相關(guān)。
[0253] 實施例9:枏據(jù)三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的球狀聚集的細(xì)朐中的KRS表汰的 信號傳導(dǎo)激活劑的表汰樽式
[0254] 〈9_1>枏據(jù)三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的球狀聚集的細(xì)朐中的KRS表汰的信號 傳導(dǎo)激活劑的蛋白水平
[0255] 由于早期確定了KRS在與二維培養(yǎng)環(huán)境中的HCT116中的細(xì)胞-ECM粘附有關(guān)的 ERK磷酸化以及粧蛋白表達(dá)和激活中起重要作用，本發(fā)明人通過免疫印跡法進(jìn)一步研究了 與三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中表達(dá)KRS的HCT116親本細(xì)胞中細(xì)胞-ECM粘附有關(guān)的ERK活性。
[0256] 具體而言，用濃度為50或100μΜ的ERK抑制劑U0126處理三維膠原蛋白凝膠環(huán)境 中培養(yǎng)為球狀聚集的細(xì)胞的HCT116親本細(xì)胞，接著培養(yǎng)24小時。收集全細(xì)胞提取物，接著 通過與實施例〈7-2>中描述的相同方式進(jìn)行免疫印跡法。這時，使用pY397FAK、FAK、p-ERK、 ERK、pY118粧蛋白、粧蛋白、E-鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白、KRS、α-微管蛋白、pAktl/2/3和 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的一級抗體。
[0257] 結(jié)果，如圖7A中所示，當(dāng)三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的HCT116親本細(xì)胞中ERK 被抑制時，細(xì)胞-ECM粘附相關(guān)的信號傳導(dǎo)因子FAK和粧蛋白的磷酸化同時降低，并且特別 地，粧蛋白的表達(dá)顯著降低。E-鈣粘蛋白的表達(dá)也降低（圖7A)。上述結(jié)果與通過抑制KRS 表達(dá)誘導(dǎo)的結(jié)果一致。即，確定了HCT116親本細(xì)胞中ERK的磷酸化與粧蛋白表達(dá)和磷酸化 密切相關(guān)，并且也確定了KRS在細(xì)胞-ECM粘附中起重要作用。
[0258]〈9_2>枏據(jù)三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的球狀聚集的細(xì)朐中的KRS表汰的信號 傳導(dǎo)激活劑的mRNA水平
[0259] 進(jìn)行實時PCR，以根據(jù)如實施例〈9_1>中所示的三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的 球狀聚集的細(xì)胞中KRS的表達(dá)，研究信號傳導(dǎo)激活劑之一，E-鈣粘蛋白的mRNA水平。
[0260] 具體而言，不用U0126(U0126為濃度為50或100μΜ的ERK抑制劑）處理或用 U0126處理三維膠原蛋白凝膠環(huán)境中培養(yǎng)的HCT116親本細(xì)胞，接著培養(yǎng)24小時。然后，通 過與實施例〈2_3>中描述的相同方式進(jìn)行實時PCR。這時，本文中使用的引物是表2中列出 的hEcad-5(SEQ.ID.Ν0:5)和hEca