M包括S個(gè)階段。
[0136] 階段I，口腔衛(wèi)生階段（-21天至第0天）：在-21、-14、-7和第0天使用Mazza齒 銀指數(shù)進(jìn)行齒銀炎檢查。在接受牙疾病預(yù)防（表面和銀下預(yù)防）和牙面拋光之后，每天每 名受檢者被命令兩次回到該部位，此時(shí)他們?cè)诒O(jiān)督下用當(dāng)前市售的沒(méi)有任何顯著抗菌活性 的防離牙粉使用MeiLiLiangJie手動(dòng)牙刷（化est，中國(guó)制造）刷牙S分鐘，然后使用牙 線清潔牙齒臨間區(qū)域。在接下來(lái)的21天遵照該刷牙方案同時(shí)在每次就診時(shí)記錄每名受檢 者的MGI。在口腔衛(wèi)生階段期間，如果受檢者出血部位多于1處，則受檢者接受多至S次牙 疾病預(yù)防。
[0137] 階段II，實(shí)驗(yàn)齒銀炎階段（第0天至第21天）：在該階段，受檢者不進(jìn)行任何口腔 衛(wèi)生實(shí)踐，包括刷牙、用任何產(chǎn)品的口腔清洗劑、牙線和牙疾病預(yù)防。在實(shí)驗(yàn)齒銀炎階段的 第7、14和21天受檢者也接受齒銀炎檢查。
[0138] 階段III，恢復(fù)階段：受檢者被命令每天兩次回到該部位，此時(shí)他們?cè)诒O(jiān)督下使用 階段I的產(chǎn)品和技術(shù)刷牙。在恢復(fù)階段受檢者接受牙疾病預(yù)防并且受檢者也接受齒銀炎檢 查，包括測(cè)量出血部位，W記錄和確認(rèn)他們已經(jīng)回到與他們進(jìn)入研究時(shí)等同的健康狀況或 比他們進(jìn)入研究時(shí)更好的健康狀況。如果需要的話，受檢者接受另外的預(yù)防并被監(jiān)視直至 被視為健康狀態(tài)。
[0139] 對(duì)于每名受檢者記錄作為臨床參數(shù)的BOP頻率和平均MGI。MGI測(cè)量炎癥病癥和 出血嚴(yán)重性程度。具體地，由牙科醫(yī)生在每個(gè)牙齒的近中頰和遠(yuǎn)中舌部位（最多為56個(gè)部 位）進(jìn)行探診。分?jǐn)?shù)范圍為0至5,其中0指定為表現(xiàn)正常和健康齒銀一直到5分的自發(fā)出 血（無(wú)緣無(wú)故）。所有受檢者的MGI通過(guò)相同良好訓(xùn)練的牙醫(yī)測(cè)量W減少技術(shù)上的變化。
[0140] 圖IB示出在研究中50名受檢者的W上臨床參數(shù)的值。在圖IB中，框表示四分位 差（IQR)并且內(nèi)部線表示中值。須狀物代表1.5XIQR內(nèi)最低和最高值。在-21天，所有受 檢者表現(xiàn)出某些水平的齒銀炎癥，其表示BOP范圍為5至27并且平均MGI為1. 18至2. 24 的天然存在的齒銀炎（"NG")狀態(tài)。然后，運(yùn)些受檢者經(jīng)歷S周嚴(yán)格的口腔衛(wèi)生實(shí)踐，運(yùn) 導(dǎo)致第O天時(shí)表示健康齒銀狀態(tài)的BOP和MGI(中值BOP和MGI分別為1.OO和1. 02)r基 線"）極大降低。然后，宿主進(jìn)一步經(jīng)歷=周的齒銀炎誘導(dǎo)的口腔衛(wèi)生程序，運(yùn)導(dǎo)致表示實(shí) 驗(yàn)齒銀炎（"EG")狀態(tài)的BOP(中值23)和MGI(中值2. 11)顯著增加。 陽(yáng)141] 銀上牙斑取樣：遵照W下程序，在-21天、第0天和第21天收集每名受檢者的銀上 牙斑樣品。在取樣之前，受檢者不進(jìn)行口腔衛(wèi)生實(shí)踐，包括刷牙、牙線潔齒、漱口。在2小時(shí) 食物或飲料（除水之外）攝入之后收集樣品。在MGI檢查之后，每名受檢者用50ml無(wú)菌水 漱口。在MGI檢查15分鐘之后，由合格的牙醫(yī)用格雷西刮治器（Grac巧curette)收集在 2mm深度內(nèi)沿齒銀線的牙斑。對(duì)于每名受檢者，在兩個(gè)不同的象限（1和3或2和4)收集所 有牙齒的牙斑樣品并一起匯集在一個(gè)管中。用消毒棉簽經(jīng)由擦抹來(lái)收集格雷西刮治器上的 牙斑。將棉簽尖端放入0. 6mlTE20緩沖液中（20mMTris-肥1PH8. 0,2mM邸TA(乙二胺 四乙酸））。在分離DNA之前，將所有樣品儲(chǔ)存在-70°CW下。
[0142] 牙斑DNA提取方案：遵照具有較少修改的LarryFernery博：t的方案從人牙菌 斑中提取總DNA(RavelJ等，（2011)Vaginalmicrobiomeofreproductive-agewomen. Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A. 108:4680-4687)。通常，在DNA分離實(shí)驗(yàn)之前將冷凍的樣品 在冰上解凍。將最初樣品（250yl)轉(zhuǎn)移至干凈的Bead-Beating-管（2mlEppendo計(jì)管） 中。將樣品懸浮液保持在冰上同時(shí)制備溶菌酶混合物。將新鮮制備的溶菌酶混合物主混 合物（IOOul;包含50yl溶菌酶~500KU= 10mg/ml，6yl變?nèi)芫兀?5KU/ml，3yl溶葡 萄球菌酶，4000U/ml于20mM乙酸鋼和41y1TE緩沖液中）加入至所有樣品中并在37°C 下培養(yǎng)45min。向溶解產(chǎn)物混合物中加入750mg干凈的且干燥的0.Imm直徑氧化錯(cuò)-二氧 化娃-珠。使樣品在QiagenTissueLyserLT中于室溫下經(jīng)受2分鐘的珠磨（36次振蕩 /秒）。將180y1粗制溶解物轉(zhuǎn)移至新管中并使用DNeasyS'血液和組織微型試劑盒通過(guò) Qiacube 分離 DNA。
[0143] 細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序：從50名個(gè)體獲得150個(gè)牙斑樣品并對(duì)其進(jìn)行分 析，在NG(-21天）、基線（第0天）和EG(第+21天）的S個(gè)時(shí)間點(diǎn)提供所述個(gè)體的樣品。 使用454鐵的條形碼16SrDNA擴(kuò)增子測(cè)序產(chǎn)生總共3, 181，659個(gè)原始讀數(shù)，從而產(chǎn)生總 共1，093, 922個(gè)處理的讀數(shù)（即，在質(zhì)量評(píng)估和控制測(cè)量之后的讀數(shù)）。每個(gè)樣品的處理 讀數(shù)的數(shù)目范圍為437至28, 456,其中每個(gè)樣品的平均讀數(shù)為7293。所有序列W登錄ID SRA058763儲(chǔ)存于序列片段歸檔。
[0144] 比較牙斑微生物區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)：使用ade4程序包首先在R中進(jìn)行PCA分析 值rayS&DufourAB(2007)The曰de4p曰ck曰ge:Implementingthedu曰Iitydiagramfor ecologists.JournalofStatisticalSoftware22 (4) :1-20),W使不同時(shí)間點(diǎn)間微生物 群落結(jié)構(gòu)的差異可視化。普氏分析（Procrustesanalysis)嘗試將一個(gè)矩陣中的點(diǎn)，諸如 通過(guò)PCA獲得的點(diǎn)，拉伸和旋轉(zhuǎn)為與另一矩陣中的點(diǎn)盡可能接近，從而保留每個(gè)矩陣內(nèi)的 點(diǎn)之間的相對(duì)距離。在變換數(shù)據(jù)的兩個(gè)子集間（即NG-基線、EG-基線和NG-EG的第一-第 四主組分的數(shù)據(jù)矩陣）使用ade4程序包在R中進(jìn)行簡(jiǎn)單普氏旋轉(zhuǎn)，W測(cè)試群組的微生物區(qū) 的不同時(shí)間點(diǎn)間的差異度。
[0145] 還進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA)W確認(rèn)齒銀炎群體與健康群體之間微生物區(qū)結(jié)構(gòu)的 差異。在每個(gè)樣品中，基于UCLUST通過(guò)選擇最長(zhǎng)序列來(lái)挑選來(lái)自每個(gè)OUT(操作分類單 位）的代表性序列巧dgarRC(2010).Searchandclusteringordersofma即itude fasterthanBLAST.Bioinformatics26(19):2460-2461)。使用BLAST的meg油last， 每個(gè)序列被指定為在CORE的系統(tǒng)發(fā)育中其最近的相關(guān)物（GriffenAL等，（2011) CORE:曰phylogenetic曰lly-cur曰tedl6SrDNAd曰t曰b曰seofthecoreor曰Imicrobiome。 PLoS化e6(4) :el9051)。將所得樣品ID(識(shí)別）映射文件和范疇映射文件用作輸入 至FastUniFrac(HamadyM,LozuponeC,feKnightR(2010)FastUniFrac:facilitating high-throughputphylogeneticanalysesofmicrobialcommunitiesincluding analysisofpyrosequencingandPhyloQiipdata.ISMEJ4 (I) :17-27),其允許基于分 離生物體的進(jìn)化史部分的群落間距離的成對(duì)比較。然后，使用PCoA將運(yùn)些距離聚合W減少 維數(shù)，其中主坐標(biāo)（PC)W降序描述在新空間的各個(gè)軸解釋的變異度。此外，使用MOT皿R進(jìn) 行基于目YC的群落結(jié)構(gòu)比較（SchlossPD,GeversD,&Westcott化(2011)Reducingthe effectsofPCR(PolymeraseChainReaction)amplificationandsequencingartifacts on16SrRNA-basedsUidies.PLoSOne6(12):e27310)。0YC測(cè)量?jī)蓚€(gè)群落之間的結(jié)構(gòu)相 異點(diǎn)。創(chuàng)建所有樣品間成對(duì)的基于0YC距離的矩陣W用于聚類和PCoA分析。
[0146] 統(tǒng)計(jì)分析：為檢驗(yàn)微生物區(qū)的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，使用標(biāo)準(zhǔn)化屬（或0TU)豐度的 Jensen-化annon離散量（JSD)通過(guò)圍繞中屯、點(diǎn)的分割算法（PAM)進(jìn)行牙斑微生物區(qū)間的聚 類?；谳喞笖?shù)（si化ouetteindex)的最大值挑選簇的最佳值。
[0147] 然后，使用ade4程序包在R中進(jìn)行PCA分析W使基于PAM的聚類可視化。在分 析之前，數(shù)據(jù)為樣品大小標(biāo)準(zhǔn)化的并去除極低豐度的屬（如果所有樣品中其平均豐度低于 0. 1% )W降低噪音。識(shí)別和突出與PCl表現(xiàn)出最高相關(guān)性的細(xì)菌屬。
[0148] 結(jié)果對(duì)于150個(gè)牙斑微生物區(qū)中的每一個(gè)，識(shí)別細(xì)菌n、屬和種W及針對(duì)參 考數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)由分類學(xué)分配來(lái)定量其相對(duì)豐度（CORE(GriffenAL等，（2011)C0RE:a phylogenetic曰lly-cur曰ted16SrDNAdatabaseofthecoreor曰Imicrobiome.PLoSOne 6(4) :el9051))。
[0149] 在口水平下，幾乎所有序列來(lái)自13個(gè)細(xì)菌口，包括口腔中通常遇到的6個(gè)主要的 細(xì)菌口：厚壁菌口、變形菌口、擬桿菌口、放線菌口、梭桿菌口和TM7(每個(gè)在至少一個(gè)時(shí)間 點(diǎn)的平均相對(duì)豐度>1% )。在齒銀炎狀態(tài)（NG和EG)與健康齒銀狀態(tài)（基線）之間，在5 個(gè)主要口中發(fā)現(xiàn)顯著差異（P<〇.〇l;成對(duì)t-檢驗(yàn)）：放線菌口、厚壁菌口、TM7、擬桿菌口和 梭桿菌口。沿NG-基線-EG進(jìn)展的群落結(jié)構(gòu)的時(shí)間轉(zhuǎn)換為顯而易見的，其通過(guò)基線處放線 菌口和厚壁菌口升高的相對(duì)豐度W及NG和EG處TM7、擬桿菌口和梭桿菌口升高的相對(duì)豐度 來(lái)表征。
[0150] 在屬水平下，27個(gè)細(xì)菌屬（每個(gè)在至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均相對(duì)豐度〉0. 1% )在 基線和齒銀炎（NG和EG)之間差異分布（p<0. 05,成對(duì)t-檢驗(yàn)；抑R(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）q<0. 2)。 其間，5個(gè)（鏈球菌屬、羅氏菌屬、放線菌屬、嗜血菌屬和勞特羅普氏菌屬）在基線處顯示 升高的豐度，而22個(gè)（纖毛菌屬、普氏菌屬、梭桿菌屬、TM7、化嘟單胞菌屬、坦納菌屬、月 形單胞菌屬、不可培養(yǎng)的_毛螺菌科、未分類的_叢毛單胞菌科、消化球菌屬、桿菌屬、卡 托氏菌屬、密螺旋體屬、SR1、彎曲桿菌屬、真細(xì)菌屬、消化鏈球菌屬、未分類的_擬桿菌科、 Solobacterium、約翰森氏菌屬、化ibacterium和未分類的_韋榮球菌科）富含在NG和EG 中。圖2示出運(yùn)27個(gè)屬水平細(xì)菌生物標(biāo)記，據(jù)信其代表齒銀健康和齒銀炎（對(duì)于天然存在 的齒銀炎和實(shí)驗(yàn)齒銀炎）。還顯示在不同階段的微生物群落中識(shí)別的口腔微生物的相對(duì)豐 度。運(yùn)些細(xì)菌分類群可潛在地用作疾病標(biāo)記物。 陽(yáng)151] 沿RPM，在相同屬內(nèi)的不同菌種通常表現(xiàn)出相對(duì)豐度變化的相同圖案，除了隧二氧 化碳細(xì)胞菌屬、放線菌屬和鏈球菌屬的幾個(gè)種類W外。
[0152] 在PCl上給出的微生物區(qū)的投影坐標(biāo)似乎沿疾病退化和進(jìn)展捕獲微生物區(qū)結(jié)構(gòu) 的梯度樣異質(zhì)性和形成，因?yàn)槭軝z者內(nèi)和群組中PCl的變化在很大程度上與健康與患病微 生物區(qū)之間結(jié)構(gòu)分離相一致（參見圖3A和3B)。而且，沿使用所有150個(gè)樣品限定的PCl的 微生物區(qū)的相對(duì)次序類似于單獨(dú)使用僅健康、僅NG或僅EG微生物區(qū)限定的那些（Spearman 相關(guān)性；所有相對(duì)于僅健康：P= 0. 95,於0.OOl;所有相對(duì)于NG:P= 0. 97,於0.OOl;所 有相對(duì)于EG :P= 0. 97,p<0. 001)。因此，