一種基于單克隆抗體的重金屬汞檢測的免疫層析試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可分泌抗重金屬汞的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體，以及一種基于單克隆抗體的重金屬汞檢測免疫層析試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]重金屬汞是自然界存在的一種重要的金屬元素。由于具有多種優(yōu)良特性，汞及其化合物在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。然而，汞是一種對人體和高等生物具有很強(qiáng)毒性的金屬污染物。早在20世紀(jì)50年代日本熊本水俁病爆發(fā)之后，汞的污染問題就引起了人們的關(guān)注。近年來，隨著城市化進(jìn)程的不斷加快和工業(yè)化水平的迅速提升，由生產(chǎn)、生活所致的汞及其化合物污染日趨嚴(yán)重并再度成為全球熱點(diǎn)問題之一。
[0003]當(dāng)前，含汞顆粒物的大氣沉降、農(nóng)用含汞殺菌劑的大量使用、工業(yè)及生活含汞廢水的排放等問題不僅使環(huán)境中汞污染現(xiàn)象十分嚴(yán)重，造成農(nóng)產(chǎn)品中重金屬污染超標(biāo)，嚴(yán)重影響我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和國際競爭力，而且還嚴(yán)重危害人類的身體健康。汞對人體的危害主要表現(xiàn)在導(dǎo)致腎損傷(以無機(jī)汞形式存在)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、智障、甚至死亡(以有機(jī)汞形式存在)。汞污染和其它重金屬污染往往會造成二種或多種重金屬元素的復(fù)合污染，并具有普遍性、復(fù)雜性等特點(diǎn)，給生態(tài)環(huán)境帶來了更大的壓力。因此，對環(huán)境中重金屬汞污染的檢測工作越來越受到人們的關(guān)注。
[0004]傳統(tǒng)的重金屬檢測方法多采用化學(xué)儀器檢測，如利用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、離子色譜儀、X射線熒光光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，這些檢測方法雖然能夠精確測量樣品中單種金屬的總量，但檢測相對費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，費(fèi)用昂貴，需要具備大型分析儀器設(shè)備的室內(nèi)進(jìn)行，不適應(yīng)實(shí)踐中快速簡便的需要。
[0005]重金屬的免疫檢測方法具有快速、廉價(jià)、簡便、特異的優(yōu)點(diǎn)，便攜而有利于進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測，克服了傳統(tǒng)檢測方法的缺點(diǎn)。但重金屬離子本身免疫原型低，很難制備出針對重金屬離子的單克隆抗體。因此，為克服該困難，本發(fā)明通過化學(xué)合成高選擇性重金屬離子捕獲螯合劑，制備重金屬離子螯合物，與載體蛋白偶聯(lián)獲得完全抗原，篩選出能夠分泌針對環(huán)境水中重金屬汞離子的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。并利用該雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體建立了針對環(huán)境水中重金屬汞離子的免疫層析試紙條，所建立的免疫層析試紙條對水體中重金屬汞離子的檢測靈敏度可達(dá)到0.5ng/mL。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種可穩(wěn)定分泌抗重金屬汞離子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種基于單克隆抗體的重金屬汞離子檢測免疫層析試紙條。
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]本發(fā)明提供提供了雜交瘤細(xì)胞株2F2，該細(xì)胞株已于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCN0.C201512。
[0010]識別重金屬汞的單克隆抗體，由保藏編號為CCTCC N0.C201512的雜交瘤細(xì)胞株2F2分泌產(chǎn)生。
[0011]本發(fā)明提供的抗重金屬汞單克隆抗體來自于BALB/C小鼠腹腔。該小鼠經(jīng)過液體石蠟預(yù)處理后，注射雜交瘤細(xì)胞株2F2，并采集該小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化，收集得到抗重金屬汞單克隆抗體。
[0012]本發(fā)明提供的一種基于單克隆抗體的重金屬汞離子檢測試紙條，其特征在于:它包括襯板，襯板的一面自上而下依次黏貼吸水紙、檢測墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接。所述檢測墊為硝酸纖維素膜，該膜自上而下設(shè)計(jì)I條質(zhì)控線和I條檢測線；所述質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG ;所述檢測線包被有MNA-OVA偶聯(lián)物；所述金標(biāo)墊為玻璃纖維素膜，噴涂有納米金標(biāo)記的抗重金屬汞單克隆抗體，該單克隆抗體為由保藏編號為CCTCCNO:C201512的雜交瘤細(xì)胞株2F2分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0013]有益效果
[0014](I)本發(fā)明提供的基于單克隆抗體的重金屬汞離子檢測免疫層析試紙條，檢測線上所使用的包被源不含有金屬汞，可避免在試紙條使用過程中產(chǎn)生的二次污染；可實(shí)現(xiàn)對水體中的重金屬汞離子的直接檢測，無需螯合劑的預(yù)處理
[0015](2)本發(fā)明提供的基于單克隆抗體的重金屬汞離子檢測免疫層析試紙條，具有靈敏度高、特異性高的特點(diǎn)，該試紙條對水體中的重金屬汞離子的檢測靈敏度可達(dá)到0.5ng/mL ;對 CH3Hg, Fe3、Ca2、Mg2' Zn2、Pb2、Mn2' Cd2+的交叉反應(yīng)率在 0.1 % 以內(nèi)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株2F2的篩選
[0017]1.動物免疫
[0018]將重金屬汞人工免疫原免疫6周齡的BAIB/C小鼠。第一次免疫將重金屬汞人工免疫原與等體積的福氏完全佐劑乳化后，于小鼠腹腔注射。第二次免疫將重金屬汞人工免疫原與等體積的福氏不完全佐劑乳化，注射方式與第一次免疫相同，間隔3周。第三、四、五次免疫分別于第二次免疫程序一致，且間隔均為3周。從第3次免疫后，每次免疫后7-8天，小鼠尾部靜脈采血，分離血清，利用間接ELISA檢測小鼠血清效價(jià)。最后一次免疫后，對血清進(jìn)行效價(jià)監(jiān)測之外同時(shí)對血清靈敏度進(jìn)行評價(jià)。選擇效價(jià)、靈敏度均相對較高的血清所對應(yīng)的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為前面的2倍，不加福氏佐劑，注射方式相同。
[0019]重金屬汞人工免疫原為MNA-Hg與牛血清蛋白的偶合物，包被源為MNA與雞卵清白蛋白的偶合物。
[0020]2.細(xì)胞融合
[0021]最后一次加強(qiáng)免疫3天后取其脾臟，脾細(xì)胞和對數(shù)生長期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞通過雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞，37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-12天后，通過檢測融合孔上清篩選雜交瘤細(xì)胞；
[0022]3.雜交瘤篩選:
[0023]用1000倍稀釋的重金屬汞包被源包被酶標(biāo)板，I %明膠封閉，取雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，采用非競爭間接ELISA法初步進(jìn)行篩選，選取呈陽性的細(xì)胞孔，細(xì)胞上清留存用于下一步檢測，呈陰性的孔若重復(fù)一次后仍為陰性則可舍棄。
[0024]對于上一步呈陽性的細(xì)胞孔則采用間接競爭ELISA法進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，間接競爭ELISA法的具體操作如下:
[0025](I)包被:用包被緩沖液(0.05mol/L，pH9.6)將包被抗原稀釋1000倍加入酶標(biāo)板，每孔50 μ 1，37°C溫箱中孵育2h ;
[0026](2)洗板:用洗滌液PBST (0.05%吐溫20，0.01mol/L，pH 7.4)洗滌5次，吸水紙