一種肝微粒體中4’-羥基美芬妥因濃度的uplc/ms/ms檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物的檢測(cè)方法，具體涉及肝微粒體中4' -羥基美芬妥因濃度的 UPLC/MS/MS檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP450酶是參與藥物代謝的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等與藥物代謝密切相關(guān)的同工酶。研究表明，大部分藥物-藥 物相互作用的發(fā)生與CYP450酶活性的誘導(dǎo)和抑制相關(guān)，其中主要由酶抑制引起。利用體外 方法進(jìn)行藥物代謝研究，可有效縮短新藥研發(fā)周期，直接觀察酶對(duì)底物的選擇性代謝和底 物對(duì)酶的誘導(dǎo)和抑制，確定藥物代謝途徑，預(yù)測(cè)體內(nèi)潛在的藥物相互作用。目前，常用的體 外方法為探針?biāo)幬锓?，該方法通過(guò)建立肝微粒體溫孵體系，從而建立了藥物代謝研究模型。
[0003] 4'-羥基美芬妥因（S-4-Hydroxymephenytoin)是CYP2C19探針底物S-美芬妥因 的代謝產(chǎn)物。目前，已有專利CN 102080122 A報(bào)道了一種肝微粒體中4'-羥基美芬妥因濃 度的HPLC/MS/MS檢測(cè)方法。但是，該方法的梯度洗脫程序持續(xù)8分鐘，耗時(shí)較長(zhǎng)，進(jìn)樣量較 大，不適于單獨(dú)檢測(cè)4' -羥基美芬妥因的濃度。
[0004] 因此，目前亟需一種專屬性更強(qiáng)，更為快速的肝微粒體中4' -羥基美芬妥因濃度 的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種肝微粒體中4' -羥基美芬妥因濃度的UPLC/ MS/MS檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0006] (1)建立肝微粒體溫孵體系，加入內(nèi)標(biāo)物和系列濃度的4'-羥基美芬妥因?qū)φ掌罚?制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；
[0007] (2)將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；
[0008] 色譜條件如下：
[0009] 色譜柱：C18色譜柱；
[0010] 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0. 1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0. 1 %甲酸乙腈溶液；
[0011] 梯度洗脫條件為：
[0012]
[0013] 運(yùn)行時(shí)間為3分鐘；
[0014] 質(zhì)譜條件如下：
[0015] 離子源：電噴霧離子源；
[0016] 檢測(cè)方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)的離子對(duì)為：4' -羥基美芬妥因的母離子-子 離子對(duì)和內(nèi)標(biāo)物的母離子-子離子對(duì)；
[0017] 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到4' -羥基美芬妥因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018] (3)按照步驟（1)相同的方法，將底物S-美芬妥因與肝微粒體溫孵體系共溫孵，制 備得到含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品，將待測(cè)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，按照步驟（2)相 同的條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品中的4' -羥基美芬妥因濃度。
[0019] 其中，溫孵的時(shí)間為40min。
[0020] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)物為鄰甲苯海拉明。
[0021] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，流動(dòng)相的流速為0. 3mL/min。
[0022] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，柱溫為40°C。
[0023] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，色譜柱為ACQUITY UPLC-BHl C18色譜柱，規(guī)格為 1. 7 μ m, 2. I X 50mm〇
[0024] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，進(jìn)樣量為2 μ L。
[0025] 優(yōu)選地，所述正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)中，4' -羥基美芬妥因的母離子-子離子對(duì)為m/z 235. 05 - m/z 150. 01，錐孔電壓為35V，碰撞電壓為16V ;鄰甲苯海拉明的母離子-子離子 對(duì)為m/z 270. 10 -m/z 181. 08,錐孔電壓為15V，碰撞電壓為12V。
[0026] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件中，毛細(xì)管電壓為3000V，離子源溫度為150°C，去溶劑化溫 度為350°C，去溶劑化氣體流速為650L/h。
[0027] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件中，錐孔氣體流速為150L/h，霧化氣壓力為6. Obar。
[0028] 優(yōu)選地，所述步驟（1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備方法為：將4' -羥基美芬妥因加入肝 微粒體溫孵體系，所述肝微粒體溫孵體系包含肝微粒體、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶、MgCl 2、PBS和NADP，再加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，混勻，離心，取上清液，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品。
[0029] 其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備可以按照下述方法進(jìn)行：分別將系列濃度的對(duì)照標(biāo) 準(zhǔn)品4' -羥基美芬妥因加入肝微粒體溫孵體系（包含肝微粒體、葡萄糖-6-磷酸、葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶、MgCl2、PBS和NADP)，再加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，充分混勻3min，于4°C， 13000rpm離心10min，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的 肝微粒。
[0030] 不同于現(xiàn)有的HPLC方法，本發(fā)明是UPLC方法，專一地檢測(cè)對(duì)肝微粒體中的4'-羥 基美芬妥因濃度，色譜分析時(shí)間僅需3分鐘，進(jìn)樣量?jī)H需2 μ L，分析時(shí)間短、靈敏度高、進(jìn)樣 量小。同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)、基質(zhì)效應(yīng)小、線性和范圍廣、批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度與精 密度高、進(jìn)樣盤(pán)穩(wěn)定性高，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，適用于肝微粒體溫孵樣本中4' -羥基美芬 妥因濃度的測(cè)定，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0031] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0032] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0033] S-4-〇H-mephenytoin 表不 4' -羥基美芬妥因。
[0034] 所用肝微粒體為人肝微粒體。
[0035] 圖1為母離子和錐孔電壓的優(yōu)選結(jié)果。
[0036] 圖2的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 235. 05 - m/z 150. 01，錐孔電壓35V，碰撞電壓 16V，也即本發(fā)明的質(zhì)譜條件。
[0037] 圖3的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 235. 05 - m/z 133. 09,錐孔電壓35V，碰撞電壓 18V〇
[0038] 圖4的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 235. 05 -m/z 105. 11，錐孔電壓35V，碰撞電壓 34V〇
[0039] 圖5為空白樣本的色譜圖。
[0040] 圖6為L(zhǎng)LOQ (定量下限）樣本色譜圖。
[0041] 圖7為待測(cè)樣本色譜圖。
[0042] 圖8為4' -羥基美芬妥因典型標(biāo)準(zhǔn)曲線
【具體實(shí)施方式】
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 所述試劑和儀器均來(lái)自市售的商品。
[0045] 1、對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)
[0046] (S)-4' -羥基美芬妥因（OH-MTP):分子量234. 25，純度98 %，批號(hào) 6-DHL-127-1(TCR)；
[0047] 梓檬酸鄰甲苯海拉明（正離子內(nèi)標(biāo)）：純度99%，批號(hào)048F0510V(sigma-aldrich)。
[0048] 2、主要儀器
[0049]
[0050] 3、試驗(yàn)所用主要軟件
[0051] UNIFI 1. 6. I :UPLC/MS/MS 數(shù)據(jù)采集及濃度計(jì)算·
[0052] 4、檢測(cè)方法
[0053] (1)建立肝微粒體溫孵體系，加入內(nèi)標(biāo)物和系列濃度的4'-羥基美芬妥因?qū)φ掌罚?制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；
[0054] (2)將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件如下：
[0055] 色譜柱：ACQUITY UPLC-BEH C18, 1. 7 μ m, 2. I X 50mm(Waters 公司）
[0056] 流動(dòng)相：A :0.1 %甲酸水溶液
[0057] B :0· 1 %甲酸乙腈溶液
[0058] 流速： 0· 3mL/min
[0059] 柱溫： 40 Γ
[0060] 進(jìn)樣盤(pán)溫度：4°C
[0061] 離子源： 電噴霧離子化源（ESI);
[0062] 內(nèi)標(biāo)（IS) :5ng/mL鄰甲苯海拉明乙腈溶液
[0063] 梯度洗脫：
[0064]
[0065] 進(jìn)樣暈： 2μΙ· 運(yùn)行時(shí)間3 min 保留時(shí)間.： t R (οκ-MPT) ~J- .48：min； ^ r ^ i$) ~ 1.66min 毛細(xì)管電壓（Capillary voltage): 3.OOkV '!? (Source Temperature )： 150 C 去溶劑化溫度（DesolvationTemperature): 350 °G 去溶劑化氣體流速（Desolvation gas flow:):; 65 0 L/h 錐孔氣體流速（Cone gas flow): 150 L/h 務(wù)化? 力(Nebulizer gas pressure >： 6.0 bar 檢測(cè)方式： 正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM) SH-fM s /Η/ζ 235.05->·/?/ζ 150.01 (OH-MPT), /;//r 270.10^ 181,08 (IS) 錐孔電壓（Conevoltage): 35V (OH-MPT)和 15 V (IS) 碰撞電壓（Collision energy): 16V (OH-MPT)和 12V (TS)
[0066] 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到4' -羥基美芬妥因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0067] (3)按照步驟⑴相同的方法，將底物S-美芬妥因與肝微粒體溫孵體系共溫孵 40min，制備得到含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品，將待測(cè)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，按照步 驟（2)相同的條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品中的4' -羥基美芬妥因濃度。 [0068] 在確定本發(fā)明的檢測(cè)方法各項(xiàng)工藝參數(shù)中，發(fā)明人對(duì)本發(fā)明方法的色譜條件和質(zhì) 譜條件進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖1-4所示。
[0069] 圖1為母離子和錐孔電壓的優(yōu)選結(jié)果。
[0070] 三種離子對(duì)的檢測(cè)結(jié)果如下：
[0071] ⑴圖2的質(zhì)譜條件為：
[0072] 離子對(duì)：m/z 235. 05 -m/z 15