一種利用金納米顆粒和硫黃素t檢測富g核酸序列的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感及分析領域，具體涉及一種利用金納米顆粒和硫黃素T檢測 富G核酸序列的方法。
【背景技術】
[0002] G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基G的核酸序列形成的一種特殊的DNA二級結構。人 類染色體末端也存在單鏈富G的端粒序列，能夠形成G-四鏈體結構，一旦形成G -四鏈體， 就不能再被端粒酶所延伸，從而抑制了細胞的正常生長。研究已表明，G-四鏈體的形成與 腫瘤的發(fā)生有著密切的關系，因為在很多惡性腫瘤當中，由于這段單鏈的端粒序列可被端 粒酶所延伸，而避免其在細胞分裂過程中程序性縮短，使細胞得以永生。近年來，G -四鏈體 的研究引起了研究人員的極大興趣，相應地，如何快速高效的檢測富G核酸序列就顯得十 分重要和迫切。
[0003] 硫黃素T (ThT)是一種有機小分子水溶性熒光染料，可以專一的誘導富G核酸序列 形成G-四鏈體。許多其它的四鏈體復合染料，如孔雀綠和噻唑橙，能夠與單鏈或雙鏈核酸 序列分子發(fā)生作用，這使得它們喪失了對于G -四鏈體的特異性。硫黃素T的熒光強度較其 它的四鏈體復合染料具有很大的增強，因而可以提高傳感的靈敏度。硫黃素T對G -四鏈體 的高度選擇性也可以提高傳感的特異性。同時，由硫黃素T直接誘導的具有結構專一性的 G -四鏈體能夠產生更加穩(wěn)定的熒光。
[0004] 近年來，納米材料技術迅速發(fā)展并被廣泛應用于重金屬離子檢測、藥物輸送、疾病 診斷等領域。納米材料本身具有表面效應、小尺寸效應、量子效應和宏觀量子隧道效應等 優(yōu)良特性，使其在發(fā)展新型高靈敏度、高穩(wěn)定性、低成本生物傳感器領域成為國內外研究熱 點。尤其是金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs)材料作為金屬納米材料中最穩(wěn)定的 納米材料之一，因其具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且 不影響其生物活性，并在可見光范圍內具有優(yōu)異的光學性能，而成為研究的熱點材料，在光 電子學、傳感器、催化和生物醫(yī)學等領域有著廣泛的應用價值。
[0005] 比色傳感器是一類以吸光度改變或波峰位移加以測量并伴隨產生顏色差異的傳 感器。比色傳感器是以特定物質在一定波長范圍內對電磁波的吸收特性為依據而建立的定 性及定量檢測工具，它因具有操作簡便、成本低廉、靈敏度高、特異性強和快速檢測等優(yōu)點 而得到廣泛應用。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用金納米顆粒和硫黃素T檢 測富G核酸序列的方法，該方法靈敏、快速、簡便。
[0007] 本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0008] -種利用金納米顆粒和硫磺素T檢測富G核酸序列的方法，包括以下步驟：
[0009] a)用DNA保存液將待測樣品配制成濃度為10 μ M的溶液；
[0010] b)取3 μ L配制好的核酸溶液加入到1-10 μ L濃度為100 μ M的硫黃素T溶液中進 行反應；
[0011] C)向上述反應液中加入79-95 yL濃度為0.437ηΜ的金納米顆粒溶液，反應 5-10min ；
[0012] d)再加入1-8 μ L濃度為IM的氯化鈉溶液，使總體積為100 μ L，觀察溶液的顏色 變化并拍照記錄，然后測定反應溶液的吸收光譜；
[0013] e)測定完成后，在溶液中加入100 μ L緩沖溶液，以425nm為激發(fā)波長進行熒光檢 測，記錄溶液熒光發(fā)射譜帶及其在490nm處的熒光強度。
[0014] 若金納米顆粒溶液變?yōu)樗{色，吸收光譜較純金納米顆粒溶液出現(xiàn)紅移，且熒光強 度增強，490nm處的熒光強度相比于空白組增加大于150%，則說明所測核酸為富G核酸序 列；若金納米顆粒溶液仍為紅色，吸收光譜沒有發(fā)生紅移，且熒光強度較弱，490nm處的熒 光強度相比于空白組增加小于150%，則說明所測核酸為非富G核酸序列。
[0015] 進一步的，步驟a)中所述DNA保存液為：50mM Tris-HCl，pH 8. 0。
[0016] 進一步的，步驟b)中所述反應溫度為室溫，反應時間為3min。
[0017] 進一步的，步驟c)中所述金納米顆粒的粒徑為10_20nm。
[0018] 進一步的，步驟b)和c)中所述的硫黃素T溶液和氯化鈉溶液的溶劑均為超純水。
[0019] 進一步的，步驟d)中所述加入的氯化鈉溶液體積為7 μ L。
[0020] 進一步的，步驟e)中所述緩沖溶液為：50mM Tris-HCl，pH 7. 2。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所述的熒光檢測方法和比色檢測方法，可實現(xiàn)對富G 核酸序列的特異性檢測，將未修飾的金納米顆粒應用于富G核酸序列的檢測中，通過觀察 金納米顆粒光學特性的變化和測試硫黃素T嵌入G-四鏈體前后熒光強度的變化可以快速、 簡便地實現(xiàn)對目標物質的檢測；此方法還可以推廣應用到其它眾多富G核酸序列的檢測當 中。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明利用金納米顆粒和硫黃素T檢測富G核酸序列的方法的工作原理 圖。
[0023] 圖2是實施例1中記錄的吸收光譜圖。
[0024] 圖3是實施例1中檢測PS2. M序列，加入氯化鈉后的透射電鏡圖。
[0025] 圖4是實施例1中檢測R-18序列，加入氯化鈉后的透射電鏡圖。
[0026] 圖5是實施例1中記錄的熒光光譜圖。
[0027] 圖6是實施例2中記錄的吸收光譜圖。
[0028] 圖7是實施例2中檢測22AG-1序列，加入氯化鈉后的透射電鏡圖。
[0029] 圖8是實施例2中檢測R-Il序列，加入氯化鈉后的透射電鏡圖。
[0030] 圖9是實施例2中記錄的熒光光譜圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明，但不應理解為對本發(fā)明的 限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替 換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0032] 本發(fā)明中吸收光譜測量條件：檢測儀器為紫外-可見分光光度計（Lambda35,美 國）；掃描范圍400-900nm ;用600 μ L石英比色皿盛放100 μ L樣品；室溫。
[0033] 熒光光譜測量條件：檢測儀器為熒光分光光度計（LS55,美國）；氙燈激發(fā)，激發(fā) 和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和5nm，電壓950V，激發(fā)波長為4