一種鎳-IgE螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種鎳-IgE螯合物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] IgE主要由粘膜相關(guān)淋巴樣組織產(chǎn)生，其中大部分是由胃腸淋巴樣組織所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜組織合成。哺乳期產(chǎn)婦腺組織含有大量IgE產(chǎn)生細(xì)胞， 這些細(xì)胞主要來自胃腸。在人類，還有少量的IgE來自骨髓。人出生后4~6月開始合成 IgE，4~12歲血清中含量達成人水平，血清型IgE總Ig的10 %左右，半衰期約5~6天。 IgE有IgEl和IgE2兩個亞類。IgEl主要存在于血清中，約占血清中IgE的85%，a1鏈分 子量為56kD;IgE2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgE存在，約占血清中IgE的 15%，a2鏈缺乏鉸鏈區(qū)，分子量為52kD。血清中的IgE除單體形式外還有由J鏈共價相連 的二聚體或三聚體等形式。分泌型IgE是由J連接的雙體和分泌成分所組成，主要存在于 初乳、唾液、淚液、胃腸液、支氣管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgE通過與相應(yīng)的病原微生物（如脊髓灰質(zhì)炎病毒）結(jié)合，阻抑其吸附到易感細(xì)胞上，分 泌型IgE還可中和毒素如霍亂弧菌毒素和大腸桿毒素等。新生兒易患呼吸道、胃腸道感染 可能與IgE合成不足有關(guān)。慢性支氣管炎發(fā)作與分泌型IgE的減少也有一定關(guān)系。產(chǎn)婦可 通過初乳將分泌型IgE傳遞給嬰兒，這也是一種重要的自然被動免疫。嗜酸性粒細(xì)胞、中性 粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達FcaR，血清型單體IgE可介導(dǎo)調(diào)理吞噬和ADCC作用。此外，分泌 型IgE具有免疫排除功能，即分泌型IgE結(jié)合飲食中大量的可溶性抗原以及腸道正常菌群 或病原微生物所釋放的熱原物質(zhì)，防止它們進入血液。
[0003] 眾所周知，鎳（Nickel，Ni)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必 需的微量元素，其存在于多種氫化酶中，催化氫的氧化還原反應(yīng)，參與多種酶蛋白的合成和 細(xì)胞激素及色素的代謝，具有促進鐵的吸收和紅細(xì)胞的增長、激活酶形成輔酶、增強胰島 素、降血糖、保護心血管等作用，因此如果人體缺乏鎳，會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但是，事實在生 活中，由于環(huán)境污染，人體內(nèi)很少缺乏鎳，相反鎳的含量常常過量，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚 至危及生命。
[0004] 鎳作為一種常見的有毒金屬，廣泛應(yīng)用于生活、生產(chǎn)之中，包括生產(chǎn)硬幣、珠寶、鎳 合金不銹鋼、制造Ni-Cd電池等，與人們的生活息息相關(guān)。隨著科技的進步，人們將鎳作為 催化劑用于生產(chǎn)碳納米顆粒的生產(chǎn)之中，又進一步加深了鎳對于人類的影響。對于普通人 群，鎳主要是通過食入、飲入、接觸等方式攝入鎳，當(dāng)然吸煙也是一重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，過 量的鎳會導(dǎo)致機體多處組織及器官損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括呼吸系統(tǒng)疾?。ǚ窝?、 支氣管炎、肺纖維化、哮喘、肺水腫等）、心血管疾病、腎臟疾病、皮膚疾病等，甚至還會導(dǎo)致 腫瘤的發(fā)生。
[0005] 流行病學(xué)資料顯示，長期接觸鎳的工人，其患呼吸系統(tǒng)腫瘤的幾率大大增加，并且 其因呼吸系統(tǒng)腫瘤致死的幾率也大大增加。動物模型、體外模型試驗也發(fā)現(xiàn)，鎳可以誘導(dǎo)腫 瘤的發(fā)生。1990年，國際癌癥研究機構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)已將鎳化合物作為第一類致癌物質(zhì)（Group1)，將金屬鎳作為2B類致癌物質(zhì)（Group 2B)。可見，鎳嚴(yán)重威脅人體的健康。
[0006] 鎳與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鎳毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到鎳與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解鎳的毒性機理的關(guān)鍵所在，因此，對鎳和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鎳與蛋白質(zhì)作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鎳之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強對于鎳與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對鎳污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鎳-IgE螯合物及其制備方 法，并建立鎳-IgE螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鎳-IgE螯合物在評價一個 地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鎳-IgE螯合物可以間接反映 這個地區(qū)人群受鎳污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鎳污染程度。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鎳-IgE螯合物，鎳離子與 IgE通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的鎳-IgE螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0010] A)鎳與IgE的螯合反應(yīng)：在提純源于人體的IgE或按照生物學(xué)方法重組的IgE中 加入鎳離子進行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0011] B)純化鎳-IgE螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng)的 IgE以及多余的鎳離子，即得鎳-IgE螯合物。
[0012] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0013] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鎳-IgE螯合物 復(fù)溶；
[0014] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgE特 異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟⑴中樣品，然后上柱，IgE與 填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I;
[0017] (5)收集：收集洗脫液I;
[0018] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鎳特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. 0m〇l/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II;
[0022] (10)收集：收集洗脫液II;
[0023] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鎳-IgE螯合物。
[0024] 其中，上述鎳-IgE螯合物的制備方法，還包括步驟C):對鎳-IgE螯合物的鑒定；
[0025] 其中，步驟C)中具體如下：
[0026] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎳-IgE螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0028] (3)電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0029] (4)檢測：在膠床上找出含鎳的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鎳以及檢測鎳的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的鎳-IgE螯合物在制備檢測人體內(nèi)鎳-IgE螯合物的試 劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鎳-IgE螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲IgE的物質(zhì)或捕獲鎳的物 質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鎳-IgE螯合物的方法，以已知含量的上述的鎳-IgE 螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鎳-IgE螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié) 合法、提純鎳-IgE螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純鎳-IgE螯合物與電感耦合等離子體 質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 實施本發(fā)明的鎳-IgE螯合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0035] 1.本發(fā)明首次體外合成鎳-IgE螯合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出鎳-IgE螯合物可用于制備檢測血樣中鎳-IgE螯合物的試劑或 試劑盒中的應(yīng)用。
[0037] 3.本發(fā)明建立了鎳-IgE螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測鎳-IgE螯合 物在評價一個地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鎳-IgE螯合物 可以間接反映這個地區(qū)人群受鎳污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鎳污染程度。本發(fā)明 建立的鎳-IgE螯合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提 尚。
【附圖說明】
[0038]圖1為本發(fā)明所述的鎳-IgE螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0039]圖2為本發(fā)明所述的鎳-IgE螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分析圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實驗操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可以通過市購方式 獲得：
[0042] 磷酸鹽溶液為 0? 05-0.lmol/LNa2HP04溶液或 0? 5-lmol/LNa2HP04溶液；
[0043] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0045] 捕獲IgE的物質(zhì)購買自艾美捷科技有限公司的型號為Abeamabl71396的兔 Anti-IgE抗體；其中，本發(fā)明所述與IgE特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗IgE抗體、抗IgE抗體均為 捕獲IgE的物質(zhì)；
[0046] 捕獲鎳的物質(zhì)為廣州然科公司生產(chǎn)的型號為RK14419的抗鎳抗體；其中，本發(fā)明 所述與鎳特異性結(jié)合的物質(zhì)、Ni抗、抗Ni抗體、抗鎳抗體均為捕獲鎳的物質(zhì)；
[0047] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0048] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0049] 洗