行從低聚物中間體中分離純蛋白質(zhì)單體的一個排阻色譜步驟，從而顯著提高所獲得的動力學數(shù)據(jù)的質(zhì)量[9]。因此，將一個單一等分試樣溶解于6Μ鹽酸胍中并且使其穿過一個休珀代克斯(Superdex) 75 10/300凝膠過濾柱。收集在約13與15mL之間的僅在蛋白質(zhì)單體峰被摒棄之前洗脫的低聚物“肩部(shoulder) ”和洗脫的純單體。洗脫在20mM磷酸鈉緩沖液、pH 8.0,200 μΜ EDTA以及0.02%疊氮化鈉中的大約1.3 μM蛋白質(zhì)單體并且將其保持在冰中。
[0325]th1avin T (ThT)動力學測定用于監(jiān)控過濾過程，使用以上緩沖液中的1.2 μ MΑβ (1-42),20 μ M ThT重復(fù)4次。實時地并且在與聚集反應(yīng)開始、滯后時間結(jié)束、生長期初期以及平衡相形成相對應(yīng)的時間點監(jiān)控原纖維形成，等分試樣從4個額外孔中去除并且與在以上動力學緩沖液中的1yL OPA-BME標記的儲備液組合。將含有大約1.0yMΑβ (1-42) ,600 μM OPA和900 μM BME的等分試樣保持在冰中并且然后在擴散裝置中快速分析。
[0326]α -B晶狀體蛋白的分析
[0327]通過擴散光譜法研宄α B-晶狀體蛋白低聚反應(yīng)。
[0328]雖然仍在討論中[22]，已出現(xiàn)一個廣泛的共識，天然狀態(tài)下的α B-晶狀體蛋白組裝為大小范圍是從10個亞基到40個亞基的低聚物[23]，并且低聚反應(yīng)平衡的動力學對于蛋白質(zhì)功能可能是至關(guān)重要的。它是使蛋白質(zhì)的研宄更復(fù)雜的此異質(zhì)性。存在關(guān)于來自一個截短變體的結(jié)晶域的一些結(jié)構(gòu)信息，從而要求承認低聚物由二聚體、7-鏈β折疊結(jié)構(gòu)嵌段組成[24]，并且對于描述α B-晶狀體蛋白的多分散性的嘗試是通過質(zhì)譜分析法[23]、
[25]、[26]來成功實現(xiàn)的。然而，迄今為止，不可能在多分散混合物中追蹤大量的單體物質(zhì)。
[0329]αΒ-晶狀體蛋白如以下所述地表示并純化。在最后的純化步驟之后，通過SDS-PAGE證實α B-晶狀體蛋白的特性(參見圖8(a))。在20kDa的一個單一條帶證實存在在變性條件下的單體、純α B-晶狀體蛋白。通過質(zhì)譜分析法獲得α B-晶狀體蛋白純度的另外的證明(圖8(b)，上圖)。發(fā)現(xiàn)實驗質(zhì)量20，160Da非常緊密地配合所希望的理論質(zhì)量 20, 159Da。
[0330]對于擴散光譜法實驗，用鄰苯二甲醛(OPA)標記α B-晶狀體蛋白，如以上所述的。用質(zhì)譜分析法證明完全標記(參見圖8 (b)，下圖)。大約2，200Da的m/z偏移與OPA-標記的12.5個胺相對應(yīng)，幾乎匹配在α B-晶狀體蛋白序列中的完全標記的10個伯胺和N-末端胺。使用未標記α B-晶狀體蛋白進行DLS和玻璃納米孔分析(以下進一步描述)。
[0331]使用擴散光譜法測定α B-晶狀體蛋白的大小，以便鑒別單體以及不同低聚物蛋白質(zhì)群。在下文中進一步詳細描述所使用的擴散裝置。將不同測量點的擴散數(shù)據(jù)與沿著微型通道的熒光強度繪圖，從而產(chǎn)生一個擴散曲線(圖9(a))，并且將實驗數(shù)據(jù)與在此所述的理論模型擬合，從而獲得αΒ-晶狀體蛋白的大小分布(圖9(b))。實際上，通過擴散光譜法分辨兩個群體:具有大約2nm的平均流體動力學半徑的一種物質(zhì)的小群體和具有約7nm的流體動力學半徑的一種物質(zhì)的較大群體。
[0332]構(gòu)成小于20%的混合物的小群體表示單體α B-晶狀體蛋白，并且非常豐富的群體占包含低聚物形式的蛋白質(zhì)的樣品中的多于80%。沒有關(guān)于低聚物分布的結(jié)論是可能的。然而，持續(xù)第一時間低大小的物質(zhì)被鑒別為大量的分離物質(zhì)，并且兩種物質(zhì)的相對群體的定量允許研宄α B-晶狀體蛋白低聚反應(yīng)平衡。
[0333]對于比較，使用DLS分析無標簽30 μ M α B-晶狀體蛋白。發(fā)現(xiàn)與通過擴散光譜法測量的大小分布重疊的一個廣泛大小分布表示低聚物α B-晶狀體蛋白(圖10)。兩種技術(shù)的良好一致性表明共價標簽對低聚反應(yīng)不存在直接影響。然而，使用DLS，在2nm處沒有檢測到低大小物質(zhì)的信號。在較大顆粒顯著更亮地散射時，通過DLS測量的強度偏向低聚物蛋白質(zhì)，并且因此大低聚物可能具有掩蔽的小的、弱散射單體αΒ-晶狀體蛋白。因此，DLS不是研宄α B-晶狀體蛋白的低聚反應(yīng)平衡的一種適合的技術(shù)。
[0334]使用單個分子檢測通過一個玻璃納米孔進行對定量無標簽α B-晶狀體蛋白的單體低聚物平衡的另一個嘗試(與劍橋大學卡文迪什實驗室(the CavendishLaboratory, University of Cambridge)的尼古拉斯貝爾(Nicholas Bell)和烏爾里希凱澤階博士(Ulrich Keyser)合作)在[27]和[28]中描述了該技術(shù)及其對單個蛋白質(zhì)分子檢測的應(yīng)用。由于樣品中的單體和低聚物α B-晶狀體蛋白的共存，事件的雙峰分布被預(yù)期為多分散樣品通過玻璃納米孔的轉(zhuǎn)位特征。在測量之前，將樣品的PH調(diào)節(jié)到10.5，以便防止粘附和附著到玻璃納米孔的各側(cè)并且確保蛋白質(zhì)快速行進(ballistic travel)通過納米孔。在施加500mV電壓穿過該孔時出現(xiàn)電滲流動，并且記錄這些運輸事件。
[0335]離子電流追蹤中的峰值(圖11(a))示出了離子電流變化事件并且因此反映了單一分析物分子穿過納米孔。平均事件電流對比事件持續(xù)時間的散射熱圖(圖11(b))(其中這些顏色表示轉(zhuǎn)位的次數(shù))示出了在濾波器截止時間(對于50kHz濾波器是約1ys)的事件群集，事件持續(xù)時間限制由濾波器頻率強加。大部分轉(zhuǎn)位接近于可檢測閾值，但是雖然如此主要群集可能與快速行進的蛋白質(zhì)相對應(yīng)，如對于單一、單分散蛋白質(zhì)樣品所報道的
[28]。無疑地檢測蛋白質(zhì)的存在，但是在現(xiàn)有分辨率的情況下，轉(zhuǎn)位事件到單體和低聚物群體的分配由于重疊的轉(zhuǎn)位統(tǒng)計而保持難以實行的。
[0336]通過擴散光譜法研宄單體蛋白質(zhì)濃度對α B-晶狀體蛋白的低聚反應(yīng)平衡的影響。在單體濃度范圍是從15 μ m到125 μ M的情況下使用MFD評估單體和低聚物α B-晶狀體蛋白的相對群體。獨立于蛋白質(zhì)單體濃度，在所有測定中鑒別兩種物質(zhì)。具有約2nm的平均流體動力學半徑的較小物質(zhì)構(gòu)成該混合物的10% -20%，并且具有7nm半徑的物質(zhì)展現(xiàn)出80% -90%的相對豐度。
[0337]單體與低聚物的相對群體并不被視為取決于初始單體濃度?？紤]到該方法的誤差，小的相對豐度變化表示按照所評估的單體濃度次序，單體濃度對低聚反應(yīng)平衡不存在較大的影響。
[0338]α B-晶狀體蛋白的大小測定(Sizing)揭不了具有不同流體動力學半徑的兩種不同物質(zhì)，這表示樣品的異質(zhì)性。對于單體和低聚物蛋白分別是約2nm和7nm的平均流體動力學半徑與先前公布的數(shù)據(jù)非常一致。非常合理的平均低聚物半徑值7nm與來自質(zhì)譜分析法[26]、電子顯微鏡法[22]、小角X射線散射和固態(tài)NMR[29]的數(shù)據(jù)非常一致。
[0339]微流體擴散光譜法可以用于在一個單一測量中鑒別作為一種分離的物質(zhì)的α B-晶狀體蛋白，其中小流體動力學半徑與蛋白質(zhì)的低聚物形式共存。發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的此分辨率對于擴散光譜法是獨特的，因為DLS或納米孔實驗二者都沒有揭示單體物質(zhì)的存在。在DLS中朝向較大、較高散射顆粒的偏向掩蓋了較小大小的顆粒的存在，并且本發(fā)明納米孔技術(shù)并不足夠敏感以檢測事件的雙峰分布，如對于單體和低聚物群體的混合物所預(yù)期的。此夕卜，先前對于使用質(zhì)譜分析法描述伴侶蛋白大小分布的嘗試引起個別低聚物群體的詳細描述，而不會追蹤該單體([25]和[26]) ο
[0340]實驗
[0341]通過安德魯鮑德溫公司(Andrew Baldwin ;英國牛津大學(University ofOxford, United Kingdom))友好地供應(yīng)編碼人α B-晶狀體蛋白的基因的質(zhì)粒。
[0342]蛋白質(zhì)表達和純化將編碼人α B-晶狀體蛋白的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細胞中(英杰公司(Invit1gen))。用12mL轉(zhuǎn)化細胞的整夜培養(yǎng)物接種供應(yīng)有1% (v/v)甘油和100 μ g/mL卡那霉素的整夜表達即時TB自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基(500ml，Novagen)中。整夜誘導(dǎo)蛋白質(zhì)過度表達，在30°C下劇烈振搖。通過離心作用收獲細胞(6000g，15min，4°C )并且將其重懸于每500ml培養(yǎng)基含有l(wèi)mg/ml溶菌酶(西格瑪-奧爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)、完全無EDTA蛋白酶抑制劑混合片劑(羅氏公司(Roche))和一藥勺尖的DNA酶I (羅氏公司)的20mM Tris?HCI, pH 8.3 (20mL/500mL培養(yǎng)物)中。通過在超聲波破碎儀XL超聲儀(Misonix公司)上使用輸出6超聲處理20 X 15s來溶解細胞。將溶胞產(chǎn)物離心作用(18，000g，30min，4°C )以去除所有細胞碎片并且過濾通過一個0.45 ym注射器。過濾器(密理博公司(Millipore))將過濾的溶胞產(chǎn)物裝載到一個Q瓊脂糖柱(通用電氣醫(yī)療集團(GE Healthcare))中，該瓊脂糖柱用20mM Trls-HCl (pH 8.3)預(yù)先平衡并且以4個柱體積通過從O至200mM NaCL的線性梯度洗脫進行洗脫。將含蛋白質(zhì)級分施加到一個HiLoad 26/600休珀代克斯(Superdex) 75pg凝膠過濾柱(通用電氣醫(yī)療集團)中以在20mM NaPi (pH 8.5)中進行最后的純化，并且以lml/min流速進行洗脫。用SDS-PAGE和MALD1-MS檢查含蛋白質(zhì)級分的特性。
[0343]微流體裝置制造。將SU-8 3025光刻膠(微化學公司(Microchem))在硅片上以500rpm旋轉(zhuǎn)涂布7s并且以3000rpm旋轉(zhuǎn)涂布另外30s。將旋轉(zhuǎn)涂布的硅片在95°C電爐中軟烘焙12min，然后用掩膜做內(nèi)襯，并且持續(xù)15s暴露于UV光。在暴露之后，將這些硅片烘焙另外5min，之后使用PGME發(fā)展模具。通過將用碳納米粉(西格瑪奧德里奇公司)加黑的液體預(yù)聚物(10:l(v/v)硅酮彈性體:交聯(lián)劑)倒入模具上并且在60°C下使其固化2h來產(chǎn)生PDMS印模。將這些PDMS印模用一個解剖刀切斷并且在用一個活檢針穿刺入口孔和出口孔之后，這些印模暴露于一個空氣等離子體中108(02分壓4.0，功率4.0)并且結(jié)合于玻璃蓋玻片(磨砂邊緣90°，賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific))。該裝置被形成為具有25 μ m高度和范圍是從1，000 (例如，在大橫截面通道處)到1ym的寬度通道。
[0344]微流體擴散色譜法。在OPA相對于伯胺超過10倍或20倍下使用鄰苯二甲醛(OPA)染料溶液(200mM NaHCO3(pH 10.5)、60mM鄰苯二甲醛、90mM( β -巰基乙醇)標記人α B-晶狀體蛋白。使用凝膠裝載的吸管尖將緩沖溶液和熒光標記的蛋白質(zhì)添加在相應(yīng)入口中，并且使連接到250 μ L玻璃注射器(哈密爾頓公司(Hamilton))的管配合流動出口。將neMESYS注射器泵(Cetoni公司)用于設(shè)定總抽取速率為80 μ L/h。用UV光激活OPA-標記的α B-晶狀體蛋白并且在使用一個Evolve 512EMCXD照相機(光測量公司(Photometries))的一個Ax1 Observer.Dl顯微鏡(蔡司公司(Zeiss))上以10倍放大率使用一個49000-ET-DAPI濾光立方體(彩度科技有限公司(Chroma Technology Corp))進行成像。圖像數(shù)據(jù)擬合至線性疊加的一組基底函數(shù)，從而描述了直徑范圍是Onm至SOOnm的均質(zhì)顆粒在與三個熒光測量點(在1、3和9cm處)相對應(yīng)的距離處的溶液分布。
[0345]動態(tài)光散射(DLS)。使用具有反向散射檢測的一個Zetasizer Nano ZSP(馬爾文儀器公司(Malvern Instruments))以173°散射角進行動態(tài)光散射實驗。將水的速度和折射率用作緩沖溶液的參數(shù)，將分析物的材料特性設(shè)定為蛋白質(zhì)。在分析之前，使所有樣品過濾通過一個0.22 μπι Millex注射器過濾器(密理博公司)。使用“多個窄”模式的馬爾文儀器軟件分析數(shù)據(jù)，以使相關(guān)函數(shù)去卷積成一個大小分布。
[0346]納米孔檢測測量.與劍橋大學卡文迪什實驗室的尼古拉斯貝爾和烏爾里希凱澤階合作進行這些實驗，如先前在[28]中所述的。使用在pH 10.5下濃度為IMM的α B-晶狀體蛋白進行測量。
[0347]MALDI質(zhì)譜分析法。通過MALDI質(zhì)譜分析法測量未標記和OPA標記的α B-晶狀體蛋白的質(zhì)量(劍橋大小生物化學系PNAC部門(the PNAC Facility, Department ofB1chemistry, University of Cambridge)的倫恩帕克曼博士 (Dr Len Packman))。將理論分子質(zhì)量20，159Da用于與未標記α B-晶狀體蛋白的實驗質(zhì)量進行比較。
[0348]蛋白質(zhì)濃度。通過使用摩爾消光系數(shù)13，θδΟΜΑπΓ1測量單體材料在280nm處的豐度來計算單體蛋白質(zhì)濃度。
[0349]脂質(zhì)體的分析
[0350]通過擴散光譜法研宄不同大小的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。
[0351]脂質(zhì)體大小已顯示對于人工生物膜系統(tǒng)并且對于藥物遞送的適當藥代動力學是重要的[30]。在最近幾年，在文獻中已討論了測定囊泡大小的不同方法:電子顯微鏡法
[31]、分析超速離心[32]、分析排阻色譜[33]、流場流分離[34]、酶脂質(zhì)定量測定[35]以及動態(tài)光散射(DLS) [36]，其中DLS是對于容易使用的強度的選擇的技術(shù)。然而，特別在復(fù)合的均質(zhì)脂質(zhì)體混合物中準確可靠且可再現(xiàn)性測定脂質(zhì)囊泡大小由于需要復(fù)雜的儀器或技術(shù)限制而依然具有挑戰(zhàn)性。將微流體擴散光譜法用于測定熒光標記的脂質(zhì)體的大小并且在具有不同大小的脂質(zhì)體混合物中分辨囊泡的大小。
[0352]制備用于測定大小的擠出孔直徑是30nm和10nm的焚光脂質(zhì)體均質(zhì)溶液以及二者的1:1混合物。將微流體擴散光譜法用于分析脂質(zhì)體并且計算其大小。對于所有的樣品，測量沿著微型通道在各自與一個不同擴散時間相對應(yīng)的三個測量點處的熒光強度，以獲得擴散曲線(圖13(a)、圖13(c)和圖13(e))。使用如上所述的一種微流體射流裝置。
[0353]擠出通過具有15nm孔半徑的小囊泡比擠出至50nm半徑的較大囊泡更快地擴散(如由斯托克斯愛因斯坦關(guān)系所預(yù)期的)。在每個測量點處，較小囊泡更廣泛地傳播通過該通道，并且在較小脂質(zhì)體的情況下，在通道中間的初始入口位置處的熒光強度更快速地減小。通過具有基底函數(shù)的線性疊加的擴散曲線的最小平方擬合來獲得最佳擬合大小分布(圖13(b)、圖13(d)和圖13(f))，從而描述了限定大小的顆粒的擴散行為。
[0354]通過對于擠出至30nm、10nm和二者的混合物的囊泡分別是0.05,0.14和0.06的低卡方值來證實良好擬合。擠出通過具有15nm半徑的孔的過濾器的脂質(zhì)體的平均流體動力學半徑被確定為22nm，并且發(fā)現(xiàn)具有50nm擠出半徑的脂質(zhì)體具有45nm的流體動力學半徑。該混合物的分析揭示了兩種物質(zhì)的單獨群體，其中二者明確分離。
[0355]相同樣品的DLS測量值以相同順序揭示了脂質(zhì)體的平均流體動力學半徑的結(jié)果:對于擠出至15nm半徑的囊泡是27nm并且對于擠出至50nm半徑的囊泡是53nm。然而，通過DLS發(fā)現(xiàn)的大小分布廣泛地分布，這使得難以可靠地檢測一種混合物中的兩個不同的峰。在微流體擴散在混合物中的兩種脂質(zhì)體物質(zhì)之間明確區(qū)分而沒有任何先驗信息時，DLS僅在使分析偏向一個異質(zhì)樣品時鑒別兩個部分重疊的峰。在沒有關(guān)于樣品多分散性的任何先驗信息的情況下，發(fā)現(xiàn)具有一個平均大小的一個單一、明顯的寬峰，該平均大小從較大囊泡的平均半徑稍微向較小囊泡的平均半徑偏移(數(shù)據(jù)未示出)，在該情況下，區(qū)分的準確度是非常差的并且達到檢測限。與DLS不同，擴散光譜法沒有偏向較大的、較高的散射顆粒。
[0356]認為在進一步改變在此所述的擴散測量技術(shù)的情況下可以提高所記錄的這些脂質(zhì)體的流體動力學半徑的準確度。
[0357]正如與以上所述的關(guān)于α -B晶狀體蛋白的實驗一樣，微流體擴散測量技術(shù)允許測定復(fù)合多分散混合物的顆粒大小。擴散測量值的特征在于它們具有一個相對低的樣品消耗、增加的靈敏度和再現(xiàn)性，并且發(fā)生對異質(zhì)混合物中顆粒大小的測定而沒有顯著偏向具有大流體動力學半徑的物質(zhì)。
[0358]實驗
[0359]焚光脂質(zhì)體的制備.將氯仿(阿盤提極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids))中的1，2- 二油?；?sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-羧基熒光素(PE CF)熒光脂質(zhì)用作測定大小實驗中所使用的脂質(zhì)體的熒光標簽。使用干氮蒸發(fā)氯仿以獲得一個脂質(zhì)膜。然后將該膜重懸于重蒸餾水，在液氮中冷凍并且將其凍干過夜以干燥。將干燥的熒光脂質(zhì)重懸于最終含量10%的熒光脂質(zhì)中，在20mM NaPi,0.01% NaN2中的ImM 二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)脂質(zhì)(阿盤提極性脂質(zhì)公司)中，并且在室溫下將懸浮液徹底攪拌lh。通過五個凍融循環(huán)破壞所得大的多層囊泡，并且通過使用阿盤提微型擠出器(阿盤提極性脂質(zhì)公司)擠出穿過具有不同大小的孔的聚碳酸酯膜過濾器(阿盤提極性脂質(zhì)公司)來制備不同大小的多層囊泡。使用具有30nm和10nm直徑的孔直徑的擠出過濾器制備500 μ M脂質(zhì)體儲備溶液。實際測量濃度是250 μ M其中使用25 μ M熒光脂質(zhì)的。
[0360]微流體擴散光譜法.
[0361]用緩沖溶液(20mM NaPi, 0.01% NaN2)填充該擴散裝置，并且將熒光標記的囊泡添加在相應(yīng)入口中。如以前一樣使用neMESYS注射器泵(Cetoni公司)以設(shè)定總抽取流速為80 μ L/h ο在使用Evolve 512EMCCD照相機(光測量公司)的Ax1 Observer.Dl顯微鏡(蔡司公司)上使用ET-GFP濾光立方體(型號49002，彩度科技有限公司)觀察到結(jié)合在脂質(zhì)體中的熒光團。圖像數(shù)據(jù)被擬合到線性疊加的一組基底函數(shù)中，如上所述的。
[0362]動態(tài)光散射(DLS)。如上所述地進行動態(tài)光散射實驗。
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