用于掃描電鏡的植物幼嫩樣品臨界點干燥方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于掃描電鏡的植物幼嫩樣品臨界點干燥方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，掃描電子顯微鏡(Scanning ElectronMicroscope, SEM)的發(fā)展日臻完善，在各個專業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣。目前，SEM已成為一種研究微觀世界的有力工具，很多重大發(fā)現(xiàn)和研究成果都是通過SEM觀察獲得。雖然近年來出現(xiàn)了環(huán)境掃描電鏡(Environment ScanningElectron Microscope, ESEM)和冷凍掃描電鏡(Cryo-Scanning Electron Microscope, Cryo-SEM),可以觀察新鮮的含水樣品，但不足之處是分辨率較低，因此目前使用最多的還是觀察不含水樣品的SEM。
[0003]就植物樣品而言，只有極少數(shù)如干種子等含水量極低的樣品可以直接噴金用于掃描電鏡觀察。如果含水量高的樣品直接放入樣品室，水分蒸發(fā)后樣品會收縮變形，破壞表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，水蒸氣引起電子束流大幅度波動，使圖像模糊，出現(xiàn)霧狀，造成物鏡、鏡頭、光闌等的污染，此外，燈絲碰到水蒸氣會氧化變質(zhì)乃至熔斷(郭素枝，掃描電鏡技術(shù)及其應(yīng)用，廈門大學(xué)出版社，2006:74-84)。所以絕大多數(shù)植物樣品需干燥處理，干燥是生物樣品制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準(zhǔn)確度。大多數(shù)植物，特別是柔軟的細(xì)胞和組織，如花器官、嫩芽、幼胚、幼根等，在干燥時由于體積應(yīng)力和表面張力的作用，容易發(fā)生明顯的皺縮、塌陷和變形，所以對干燥環(huán)節(jié)技術(shù)要求更高。
[0004]常用的方法有自然干燥法，冷凍干燥法，烘干干燥法，叔丁醇干燥法和臨界點干燥法。
[0005]臨界點干燥被認(rèn)為是目前生物學(xué)掃描電鏡樣品制備中最可靠、最理想的干燥方法(肖媛，實驗室研究與探索，2013，32，45-53)。然而，關(guān)于植物樣品臨界點干燥方法的諸多細(xì)節(jié)報道較少，特別是幼嫩柔軟、極易縮水變形的植物組織。
[0006]每種物質(zhì)在一個特定的溫度都可以進(jìn)行相態(tài)轉(zhuǎn)化，這個溫度就是該物質(zhì)的臨界點。CO2的臨界溫度為31.1°C，在臨界點的壓力為臨界壓力。在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，界面完全消失，液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點干燥雖然是一種非常好的干燥方法，但是操作時有諸多的細(xì)節(jié)，細(xì)小環(huán)節(jié)的操作不當(dāng)會導(dǎo)致樣品縮水，干燥失敗。
[0007]乙酸異戊酯是一種常用的臨界點干燥中間液，因其可以與CO2充分混合，但是樣品上殘留的乙酸異戊酯如果略多一些，干燥后會殘留下來或在排氣管中凝結(jié)，干燥結(jié)束后又會返流進(jìn)入樣品室，浸濕樣品?；蛘邔?dǎo)致臨界點升高，干燥失敗。而樣品上殘留的乙酸異戊酯過少時，乙酸異戊酯揮發(fā)會使樣品在空氣中干燥，從而導(dǎo)致樣品收縮。乙醇也可以作為中間液，但從乙醇中取出來直接用于臨界點干燥，樣品收縮要大于用乙酸異戊酯做中間液。也可以用丙酮做中間液，但是丙酮易揮發(fā)，樣品有在樣品筐中發(fā)生空氣干燥的可能性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種用于掃描電鏡的植物樣品臨界點干燥方法。
[0009]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0010]I)用濾紙分別覆蓋在臨界點干燥器的樣品筐的頂部和底部，且在所述濾紙上設(shè)有若干便于乙酸異戊酯和CO2的交換的孔；將預(yù)處理植物樣品放置于所述樣品筐中，得到置有所述預(yù)處理植物樣品的樣品筐；
[0011]所述預(yù)處理植物樣品為將植物組織經(jīng)固定、脫水和乙酸異戊酯置換后得到的含有乙酸異戊酯的預(yù)處理植物樣品；
[0012]2)將所述置有所述預(yù)處理植物樣品的樣品筐置于臨界點干燥器樣品室底部，關(guān)閉樣品室，充CO2至達(dá)到所述樣品室容積的60-70%，靜置使CO2置換所述預(yù)處理植物樣品中的乙酸異戊酯；放氣同時充CO2、繼續(xù)充CO2至達(dá)到所述樣品室容積的60-70%，再次靜置使CO2置換所述預(yù)處理植物樣品中的乙酸異戊酯；再次放氣同時充CO2、再次繼續(xù)充CO2至達(dá)到所述樣品室容積的70%，最后靜置使CO2置換預(yù)處理植物樣品中的乙酸異戊酯；
[0013]3)調(diào)節(jié)臨界點干燥器樣品室的溫度至35-40°C，放CO2，取出樣品，即為干燥后樣品O
[0014]上述方法中，在步驟I)中，在所述將預(yù)處理植物樣品放置于所述樣品筐中的步驟前還包括如下步驟:將所述樣品筐底部覆蓋的濾紙用乙酸異戊酯潤濕；
[0015]步驟I)和步驟2)之間還包括如下步驟:在所述臨界點干燥器樣品室底部放置另一濾紙用于放置所述樣品筐，再預(yù)冷所述樣品室使溫度為-10-0°c。
[0016]上述方法中，步驟2)中，所述靜置、所述再次靜置和所述最后靜置時間均為15-20分鐘；
[0017]所述最后靜置的溫度為20°C ;
[0018]步驟3 )中，所述放CO2采用緩慢放CO2，使放CO2的時間為4-5小時。
[0019]上述方法中，所述濾紙和所述另一濾紙均為定性濾紙，所述濾紙和所述另一濾紙使用時均為單層；
[0020]步驟I)中，所述預(yù)處理植物樣品平鋪一層放置在所述樣品筐的底部；
[0021 ] 步驟2 )中，所述放氣同時充CO2的時間為3min。
[0022]上述方法中，所述植物組織為柔軟且易縮水變形的植物組織。
[0023]上述方法中，所述植物組織為花器官、胚或幼根，也可以為其他幼嫩的部位。
[0024]上述方法中，所述固定為將所述植物樣品置于FAA固定液中負(fù)壓抽氣，4°C固定24小時，得到固定后樣品；
[0025]所述脫水為將所述固定后樣品依次浸泡在體積百分含量為70%乙醇水溶液、體積百分含量為80%乙醇水溶液、體積百分含量為90%乙醇水溶液、體積百分含量為95%乙醇水溶液、100%乙醇中進(jìn)行梯度乙醇脫水，各處理20分鐘，得到脫水處理后樣品；
[0026]所述置換將上述脫水處理后樣品依次浸泡在體積百分含量75%乙醇乙酸異戊酯溶液、50%乙醇乙酸異戊酯溶液、25%乙醇乙酸異戊酯溶液和100%乙酸異戊酯中進(jìn)行乙酸異戊酯置換，各處理20分鐘，得到預(yù)處理樣品；
[0027]所述75%乙醇乙酸異戊酯溶液由體積比為3:1的乙醇和乙酸異戊酯組成，
[0028]所述50%乙醇乙酸異戊酯溶液由體積比為1:1的乙醇和乙酸異戊酯組成，
[0029]所述25%乙醇乙酸異戊酯溶液由體積比為1:3的乙醇和乙酸異戊酯組成。
[0030]在步驟3)的取出樣品后，還包括將處理后樣品進(jìn)行噴金，得到干燥樣品的步驟。
[0031]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明方法中的臨界點干燥的步驟中，在臨界點干燥器的樣品筐上下各附一層濾紙(防止市售CO2不純，污染樣品)，用針扎出小孔(便于乙酸異戊酯和CO2的交換)，用乙酸異戊酯將樣品筐下層所附濾紙潤濕(防止樣品放入后濾紙吸附乙酸異戊酯導(dǎo)致干燥)；該過程要防止乙酸異戊酯揮發(fā)，樣品自然干燥，也要防止乙酸異戊酯過多導(dǎo)致臨界點升高，干燥失??；而在臨界點干燥器樣品室底部放一張同樣大小的圓形濾紙，防止干燥后回流的乙酸異戊酯重新浸濕樣品，同時采用長時間置換(各20分鐘)和兩次放氣可以保證乙酸異戊酯和CO2充分交換，且使最后CO2在樣品室中的體積準(zhǔn)確達(dá)到70%，此過程CO2的量是關(guān)鍵，過多或過少都會導(dǎo)致干燥失敗，最后干燥完成后長時間放氣，可以減少過大的CO2氣流對樣品的沖擊導(dǎo)致樣品變形。因此，采用本發(fā)明的方法，可以使樣品不收縮變形且達(dá)到干燥的目的，尤其針對幼嫩柔軟、極易縮水變形的植物組織，效果更明顯。
【附圖說明】
[0032]圖1為使用本發(fā)明方法及現(xiàn)有方法干燥的植物幼嫩樣品掃描電鏡觀察
【具體實施方式】
[0033]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035]實施例1、用于掃描電鏡的植物幼嫩樣品臨界點干燥方法
[0036]1、樣品固定
[0037]將植物幼嫩組織樣品采集后立即投入FAA固定液中，注射器負(fù)壓抽氣以去除樣品表面的氣體。方法是把樣品和固定液一起倒入一個大的注射器中，將樣品和液體推至上端直至沒有空氣，左手堵住針管口，右手拉注射器桿，松開左手，再往上推，再拉，反復(fù)幾次，直到樣品全部落到