蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微型動(dòng)物(原生動(dòng)物和小型的后生動(dòng)物)在污水生物處理中的有益作用一直備受關(guān)注，其作用包括攝食水中懸浮固體、促進(jìn)細(xì)菌絮凝及減少剩余污泥量等，對(duì)污水生物處理有重要的指示作用。
[0003]蛭形輪蟲(Bdelloid Rotifer)是一種常見(jiàn)的對(duì)污水生物處理有益的微型動(dòng)物，其是一類在基質(zhì)上(活性污泥、生物膜等表面)附著生活的小型無(wú)脊椎動(dòng)物。蛭形輪蟲頭部有由纖毛組成的可轉(zhuǎn)動(dòng)的形如車輪的輪盤，輪盤是輪蟲運(yùn)動(dòng)和攝食的器官。蛭形輪蟲體形微小，長(zhǎng)度約100?1000 μ??，需在顯微鏡下才能較好地觀察到。
[0004]蛭形輪蟲有助于改善污水生物處理性能，如去除水中懸浮顆粒物、提高出水透明度、減少剩余污泥發(fā)生量等。根據(jù)目前研宄，蛭形輪蟲在污水生物處理中具有較廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]不過(guò)，迄今為止，對(duì)蛭形輪蟲在污水生物處理中的作用，基本上是從其攝食或捕食角度來(lái)進(jìn)行研宄，而蛭形輪蟲的生活習(xí)性是靠足底趾內(nèi)腺體分泌的粘液粘附在活性污泥絮體或生物膜等載體上，頭部伸入到水中進(jìn)行攝食或捕食，并不直接影響其粘附的載體上的微生物。因此，僅用蛭形輪蟲的攝食或捕食特性，是難以充分解釋其對(duì)活性污泥中微生物的活性和群落結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制；另一種可能的作用機(jī)制也許與其分泌物有關(guān)，這一點(diǎn)目前尚無(wú)文獻(xiàn)專利報(bào)道。
[0006]目前，對(duì)于未知物的成分分析研宄常用的儀器分析手段有:氣相、高效液相、氣質(zhì)聯(lián)用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振、X射線晶體掃描、原子力顯微技術(shù)等。儀器分析手段使未知物結(jié)構(gòu)與功能研宄取得飛速發(fā)展，但由于蛭形輪蟲分泌物結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特點(diǎn)，單一儀器分析手段又具有一定局限性。因此對(duì)于蛭形輪蟲分泌物的成分分析目前尚無(wú)文獻(xiàn)專利報(bào)道。本方法結(jié)合傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜及高效液相色譜分別對(duì)蛭形輪蟲的分泌物進(jìn)行分析鑒定，以得到更為精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)組成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析方法，其包括傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜及高效液相色譜法對(duì)未知物質(zhì)進(jìn)行分析的方法。其包括預(yù)先對(duì)蛭形輪蟲分泌物進(jìn)行提取、純化，真空冷凍干燥，再通過(guò)傅里葉變換紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)做初步鑒定，然后通過(guò)氣相和高效液相色譜分別分析其單糖組分。
[0008]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種蛭形輪蟲分泌物單糖組分的分析方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.將經(jīng)清潔處理過(guò)的蛭形輪蟲移至無(wú)菌去離子水中，使蛭形輪蟲密度達(dá)到500?2500 ind/mL，恒溫靜置30分鐘后過(guò)濾，并用濾膜過(guò)濾去除細(xì)菌，收集含有輪蟲分泌物的濾液，將該濾液置于真空度等于1.0，溫度低于-5rc的條件下進(jìn)行冷凍干燥處理，得到分泌物的固體樣品；
b.取步驟a所得的固體樣品以1: 100 (質(zhì)量比)的比例與KBr混合，充分研磨均勻進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描，掃描范圍:4000?400 cnT1;掃描次數(shù):32次；分辨率為4CnT1;說(shuō)明旋輪蟲分泌物的紅外光譜表現(xiàn)出一般多糖類物質(zhì)的特征吸收峰；
c.將蛭形輪蟲分泌物進(jìn)行水解和衍生化；
d.將步驟C所得衍生化和水解后的蛭形輪蟲分泌物樣品進(jìn)行氣相色譜分析，程序升溫為:N2流速為I?2mL/min，H2流速為30?50mL/min，空氣的流速為350?450mL/min，進(jìn)樣溫度為200?250°C，柱溫為80?100°C，持續(xù)I?5min，然后以15°C /min升到300°C，持續(xù)6min載氣流量10?30mL/min檢測(cè)器溫度為340°C，分流比大于等于100:1 ;
e.將步驟c所得衍生化和水解后的蛭形輪蟲分泌物樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，流動(dòng)相為0.l~lmol/L, pH5~7的乙腈-磷酸鹽緩沖液，流速為1.0~3ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為200~300nm，柱溫 20~50°C，進(jìn)樣量為 20ul。
[0009]上述的蛭形輪蟲的清潔處理方法為:將含有蛭形輪蟲的樣品經(jīng)目數(shù)大于等于400目的濾網(wǎng)和孔徑小于或等于0.45 μ m的濾膜過(guò)濾，再用無(wú)菌去離子水洗滌截余物。
[0010]上述的步驟c的具體方法為:稱取蛭形輪蟲分泌物溶于2mol/L三氟乙酸溶液，混合均勻后充入氮?dú)饷芊?，?0?120°C水浴中水解2?12h。
[0011]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述的一種分析蛭形輪蟲分泌物單糖組成的方法，通過(guò)對(duì)蛭形輪蟲培養(yǎng)液進(jìn)行初次過(guò)濾，提取蛭形輪蟲并過(guò)濾雜質(zhì)，恒溫靜置一段時(shí)間后再次過(guò)濾達(dá)到去除蛭形輪蟲的效果，然后對(duì)濾液進(jìn)行濾膜過(guò)濾達(dá)到提純蛭形輪蟲分泌物的效果。經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理，達(dá)到濃縮固化分泌物的效果，便于分析檢測(cè)。運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜掃描，達(dá)到檢測(cè)其多糖成分的效果。通過(guò)對(duì)蛭形輪蟲分泌物進(jìn)行衍生化和水解處理，再進(jìn)行氣相色譜和高效液相色譜分析，達(dá)到測(cè)定其單糖成分的效果。根據(jù)得到的色譜圖中各物質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積，可知蛭形輪蟲分泌物中的單糖成分及其濃度，從而完成對(duì)蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明的分析方法流程圖。
[0013]圖2為本實(shí)施示例選用的蛭形輪蟲圖。
[0014]圖3為實(shí)施示例傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)蛭形輪蟲分泌物的譜圖。
[0015]圖4為實(shí)施示例標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化氣相色譜圖。
[0016]圖5為實(shí)施示例蛭形輪蟲分泌物衍生化氣相色譜圖。
[0017]圖6為實(shí)施示例標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化高效液色譜圖。
[0018]圖7為實(shí)施示例蛭形輪蟲分泌物衍生產(chǎn)物化高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖并通過(guò)【具體實(shí)施方式】來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明專利的技術(shù)方案。
[0020]本實(shí)施示例中采用的分析方法流程如圖1所示，使用的蛭形輪蟲為經(jīng)過(guò)續(xù)代培養(yǎng)的旋輪蟲(見(jiàn)圖2)。該種類的旋輪蟲分離自上述的污水處理廠的活性