一種檢測(cè)環(huán)孢霉素a濃度的免疫分析方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，是一種檢測(cè)環(huán)孢霉素A濃度的免疫分析方法 和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)孢霉素A(CyclosporineA，CsA)是一種由11個(gè)氨基酸組成的親脂性環(huán)狀化合 物，其作為一種高效的免疫抑制劑，被廣泛應(yīng)用于抑制器官移植病人的免疫排斥反應(yīng)，也常 用于治療牛皮癬、遺傳性皮炎、壞疽性膿皮病、蕁麻瘆、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。
[0003] 自80年代初期CsA應(yīng)用于臨床以來(lái)，CsA在移植排異治療中發(fā)揮了重大作用，在 全球范圍內(nèi)推動(dòng)了器官移植術(shù)的發(fā)展。盡管CsA的使用往往伴有多種不良反應(yīng)，至今全球 仍有數(shù)十萬(wàn)例患者使用CsA抑制移植后的排異反應(yīng)。
[0004] 由于不同患者對(duì)CsA的吸收和代謝往往表現(xiàn)出很大的個(gè)體差異（Hamwi A,SalomonA,SteinbruggerR,etal,CyclosporineMetabolisminPatientsAfter Kidney,BoneMarrow,Heart-Lung,andLiverTransplantationintheEarlyandLate PosttransplantPeriods,AmJClinPathol. ,2000;114:536-543)，即使使用相同的藥物 劑量，不同患者的CsA血藥濃度也常差異顯著；由于CsA的肝、腎毒性及其狹窄的治療劑量 范圍，CsA的藥效與藥毒均與血藥濃度密切相關(guān)，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)CsA的血藥濃度對(duì)于控制 CsA的藥毒性和發(fā)揮CsA的抗排斥作用均具有重要參考價(jià)值。
[0005] 目前，檢測(cè)CsA血藥濃度的方法主要有高壓液相色譜法（HPLC)和多種免疫檢測(cè) 方法（王燕，卜雯婷，李鵬飛，等；常用免疫抑制劑人血中定量監(jiān)測(cè)方法研宄進(jìn)展，中國(guó)臨 床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16:830-836)，如：放射免疫分析法、微粒子化學(xué)發(fā)光法、熒光偏振 法、酶聯(lián)免疫分析法和酶放大免疫分析法。HPLC法能準(zhǔn)確檢測(cè)CsA原藥和多種CsA代謝產(chǎn) 物的濃度，但由于CsA紫外吸收微弱，通常需要萃取以濃縮血藥，操作繁瑣，不宜用于常規(guī) 的臨床檢測(cè)，因此免疫檢測(cè)是目前臨床常用的檢測(cè)方法。
[0006] CsA的免疫檢測(cè)可使用抗CsA多克隆抗體和單克隆抗體?？笴sA多克隆抗體不可 避免地存在與多種CsA代謝物較大程度的交叉反應(yīng)，使用多克隆抗體的免疫分析方法檢測(cè) 的是CsA原藥及其多種CsA代謝物的濃度。血液中不同CsA代謝物的免疫抑制活性差別很 大，往往顯著低于CsA原藥，因此基于多克隆抗體的免疫分析方法檢測(cè)的血藥濃度與CsA藥 效的相關(guān)性不夠明確，而只有使用更特異的抗CsA單克隆抗體才可望將CsA代謝物的交叉 反應(yīng)降至低水平；因此，抗CsA單克隆抗體是建立CsA檢測(cè)方法的首選。
[0007] 為獲得臨床檢測(cè)所需要的抗CsA單克隆抗體，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研宄機(jī)構(gòu)和高校 在CsA免疫原合成、抗體制備上做了大量工作（戴曉雁，黃文才，劉一超；環(huán)孢菌素 A免疫抗原合成進(jìn)展，精細(xì)化工，2000, 17, 441-444;PapricaP.A,MargaritisA.and PetersenN. 0preparationofNovelCyclosporinADerivatives,Bioconjugate Chem. 1992, 3, 32-36)，但這些工作多停留上免疫原或CsA衍生物合成的層面上，沒(méi)有獲得 能滿足CsA臨床檢測(cè)要求的單克隆抗體，其中親合性不足是抗CsA抗體研制的主要障礙，其 原因主要是含有CsA的免疫原對(duì)免疫動(dòng)物T淋巴細(xì)胞功能強(qiáng)烈的抑制作用，該作用減弱了T淋巴細(xì)胞對(duì)B淋巴細(xì)胞的抗原呈遞作用，降低了T淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子的能力，從而抑 制了免疫動(dòng)物的體液免疫功能，降低了其B細(xì)胞產(chǎn)生高親合性抗體的能力；因此，盡管CsA 的血藥濃度通常在200ng/ml-400ng/ml的較高水平，對(duì)于缺少高親合性抗CsA抗體的試劑 研發(fā)工作者來(lái)說(shuō)，建立足夠靈敏的CsA檢測(cè)方法仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請(qǐng)的發(fā)明人在對(duì)建立CsA檢測(cè)方法的長(zhǎng)期研宄中意外發(fā)現(xiàn)，以結(jié)構(gòu)與CsA有 微小區(qū)別的環(huán)孢霉素C(CsC)作為競(jìng)爭(zhēng)分子建立CsA的免疫檢測(cè)方法，可以顯著地改善CsA 的分析靈敏度，從而可以使用親合性較低的抗CsA單克隆抗體實(shí)現(xiàn)靈敏的CsA檢測(cè)。
[0009] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于建立一種靈敏的全血CsA檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是以 CsC為競(jìng)爭(zhēng)分子，可以使用親合性較低的抗CsA單克隆抗體實(shí)現(xiàn)靈敏的CsA檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)CsA濃度的免疫分析試劑盒。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種檢測(cè)環(huán)孢霉素A濃度的免疫分析方法，采用環(huán)孢 霉素C為競(jìng)爭(zhēng)分子定量檢測(cè)樣品中的環(huán)孢霉素A濃度。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括以下步驟：
[0014] A)制備環(huán)孢霉素A-蛋白免疫原；
[0015] B)合成環(huán)孢霉素C-蛋白復(fù)合物，將其包被微孔，使微孔表面帶有環(huán)孢霉素C分 子；
[0016] C)標(biāo)記抗環(huán)孢霉素A單克隆抗體；
[0017] D)以微孔表面的環(huán)孢霉素C-蛋白復(fù)合物為競(jìng)爭(zhēng)分子，以標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A單克 隆抗體為檢測(cè)試劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫分析定量檢測(cè)樣品中環(huán)孢霉素A濃度。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟A)中所述的環(huán)孢霉素A-蛋白免疫原的制備包括以下步 驟：
[0019] A)通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)使環(huán)孢霉素A與4-苯甲酰苯甲酸連接，從而在環(huán)孢霉素A分子 上引入幾基；
[0020] B)以EDCI或EDCI-NHS活化環(huán)孢霉素A分子上引入的羧基；
[0021] C)將活化后的環(huán)孢霉素A與蛋白載體偶聯(lián)，獲得環(huán)孢霉素A-蛋白免疫原。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述的蛋白載體選自：各種動(dòng)物來(lái)源的血清白蛋白、血清Y-球蛋 白、甲狀腺球蛋白，卵清蛋白、或鑰孔血藍(lán)蛋白。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟C)中所述的環(huán)孢霉素C-蛋白復(fù)合物的合成包括以下步 驟：
[0024] A)將丁二酸酐與環(huán)孢霉素C反應(yīng)，使環(huán)孢霉素C羧基化；
[0025] B)通過(guò)EDCI或EDCI-NHS將羧基化的環(huán)孢霉素C與載體蛋白交聯(lián)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，所述步驟D)中所述標(biāo)記抗環(huán)孢霉素A單克隆抗體的標(biāo)記物選自：酶、 放射性同位素、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或稀土離子。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述標(biāo)記物為Eu3+離子。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，所述通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫分析定量檢測(cè)樣品中環(huán)孢霉素A濃度包括以下步 驟：
[0029]A)使用樣品前處理試劑處理樣品；
[0030]B)在包被有環(huán)孢霉素C-蛋白的微孔內(nèi)加入上述處理后的環(huán)孢霉素A校準(zhǔn)品或樣 品，以及標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A單克隆抗體，形成免疫復(fù)合物；
[0031] C)洗滌除去未結(jié)合的標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A單克隆抗體，檢測(cè)微孔表面免疫復(fù)合物 中標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A單克隆抗體產(chǎn)生的信號(hào)；
[0032] D)根據(jù)上述步驟獲得的校準(zhǔn)曲線和各樣品信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)樣品中環(huán)孢霉素A進(jìn)行定 量。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，所述的樣品前處理試劑包括全血溶解劑和全血沉降劑。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，一種檢測(cè)環(huán)孢霉素A濃度的免疫分析試劑盒，所述試 劑盒包括：包被有環(huán)孢霉素C-蛋白復(fù)合物的固相微孔板，銪離子標(biāo)記的抗環(huán)孢霉素A單克 隆抗體，環(huán)孢霉素A校準(zhǔn)品，洗滌液，分析緩沖液，熒光增強(qiáng)液，樣品前處理試劑。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，所述的樣品前處理試劑包括全血溶解劑和全血沉降劑。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明，所述全血溶解劑選自：皂素、吐溫、Triton、SDS等表面活性劑中一種 或幾種的組合，或尿素、鹽酸胍、蛋白水解酶等蛋白變性劑中一種或幾種的組合，所述全血 沉降劑選自：二價(jià)金屬離子的甲