一種基于gc-ms技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法
【專利說(shuō)明】-種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)領(lǐng)域，具體為一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的 方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis Sacc.)寄生在蝙蝠 蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，具有補(bǔ)肺益腎、秘精益氣等功效，是我國(guó)的一 種珍貴中藥材。現(xiàn)代藥理學(xué)研宄也表明冬蟲夏草對(duì)人體的免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、心血管系 統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等都是有益的。但是野生冬蟲夏草主要存在于我國(guó)青海、四川、西藏、貴州、云 南等省3500-5000m海拔的高寒高原草甸，這種生長(zhǎng)環(huán)境的限制加上人們的瘋狂采挖，使天 然冬蟲夏草的資源短缺且價(jià)格昂貴，普通百姓消費(fèi)不起。
[0003] 應(yīng)運(yùn)而生的是從新鮮冬蟲夏草中分離得到多種菌株為菌種，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法 來(lái)生產(chǎn)蟲草菌絲。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法生產(chǎn)的冬蟲夏草蟲草菌絲與天然冬 蟲夏草的化學(xué)成分和藥理作用相似，發(fā)酵蟲草菌絲已經(jīng)成為稀缺名貴藥材冬蟲夏草的替代 品，有效的緩解了市場(chǎng)需求，在中成藥和保健食品中廣泛使用。中國(guó)市場(chǎng)上有以下五種品 牌的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品被中國(guó)食品與藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)為藥品或保健品：金水寶、百令、至 靈、寧心寶、心肝寶。金水寶蟲草菌絲為麥角菌科真菌蝙蝠蛾擬青霉菌株（Paecilomyces hepiali Chen et Dai)CS_4菌株經(jīng)液體深層發(fā)酵所得；百令采用中華束絲孢（Synnematium sinense yin. et Shen)Cs-C-Q80菌株發(fā)酵得到；至靈由麥角菌科孢霉屬真菌蝙蝠蛾被孢 霉（Mortierella hepiali)菌株經(jīng)人工培育發(fā)酵得到；心肝寶為粉紅膠霉菌（Gliocadium roseum)的液體發(fā)酵產(chǎn)品；寧心寶采用蟲草頭孢菌（Cephalosporium sinensis)菌株液體 深層發(fā)酵制備。這些蟲草制劑已被廣泛地應(yīng)用于多種疾病的治療，在臨床上有治療心律不 齊、房室傳導(dǎo)受阻，慢性腎功能不全等功能。但由于這些發(fā)酵蟲草產(chǎn)品是由不同的菌株人工 發(fā)酵培育的，它們可能含有不同的有效成分，有不同的藥理作用，因此要區(qū)別運(yùn)用。另外，在 市場(chǎng)上還流通有許多廠家自行生產(chǎn)的蟲草發(fā)酵產(chǎn)品，這些產(chǎn)品大多菌種來(lái)源不明確，且未 獲得相關(guān)部門的正式批文，在市場(chǎng)上造成諸多魚目混雜的現(xiàn)象。因此，發(fā)酵蟲草菌絲品種的 鑒別對(duì)這類藥品或保健品的質(zhì)量評(píng)價(jià)及安全、合理地使用有著重要的意義。
[0004] 本發(fā)明采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS)技術(shù)，對(duì)發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品的品種進(jìn)行 鑒別。采用SDE同時(shí)蒸餾萃取的方法提取發(fā)酵蟲草菌絲中的揮發(fā)性成分，通過(guò)質(zhì)譜譜庫(kù)匹 配鑒定揮發(fā)油中的化學(xué)成分，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別發(fā)酵蟲草產(chǎn)品品種，該方法操作簡(jiǎn) 便、實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀可靠，為發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供一種方法。
[0005] 發(fā)酵蟲草菌絲的成分主要有蟲草素、腺苷、蟲草多糖、蟲草酸、麥角留醇、脂肪酸、 氨基酸等，以往的研宄工作也主要關(guān)注于核苷、多糖類非揮發(fā)性成分，對(duì)蟲草菌絲中揮發(fā)性 成分的研宄較少，本發(fā)明所涉及的采用GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的研宄尚未有報(bào) 道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基于GC-MS技術(shù)鑒別發(fā)酵蟲草菌絲品種的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0008] (a)供試品溶液的制備：精密稱取發(fā)酵蟲草菌絲5~20g，置于500ml的圓底燒瓶 中，加入100~250ml的去離子水，另取50ml的無(wú)水乙醚作為萃取溶劑，置于250ml的圓底 燒瓶中，兩個(gè)燒瓶裝在SDE同時(shí)蒸餾萃取裝置上，置加熱套加熱使去離子水沸騰，以45°C油 浴加熱萃取溶劑，連續(xù)提取4~24h，冷卻至室溫，將U型管和250ml圓底燒瓶里的乙醚層 合并，加入NaCl粉末至過(guò)量，取出乙醚層，加入過(guò)量的無(wú)水硫酸鈉粉末過(guò)夜干燥，濾出干燥 劑，取出乙醚層，室溫下氮吹至干，得到黃色透明油狀物，稱重。復(fù)溶在100~5000 μ 1的無(wú) 水乙醚中，4°C下保存，作為供試品溶液；
[0009] (b)GC-MS測(cè)定條件：色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30mX0. 25cmX0. 25mm);程序升 溫條件：初始溫度40°C，停留2min，以5°C /min的速度升至70°C，停留2min，以15°C /min 的速度升至160°C，停留5min，以2°C /min上的速度升至180°C，停留2min，以5°C /min的 速度升至280°C，停留2min ;進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比100 : 1 ;載氣流速lml/min ;進(jìn)樣 量：I UL ;進(jìn)樣口溫度：250°C ;離子源溫度：230°C ;接口溫度280°C ;四級(jí)桿溫度150°C ;離 子源電壓：70ev ;質(zhì)譜掃描范圍：(m/z)35-480amu ;
[0010] (C)GC-MS色譜圖的測(cè)定：將上述步驟（a)得到的供試品溶液，注入GC-MS聯(lián)用儀， 測(cè)定，計(jì)算各峰的相對(duì)含量；
[0011] (d)發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分的鑒定：以NIST譜庫(kù)檢索，對(duì)發(fā)酵蟲草產(chǎn)品揮發(fā)性 成分進(jìn)行鑒定；
[0012] (e)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析：通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，直觀區(qū)分不同發(fā)酵蟲 草產(chǎn)品和偽品；
[0013] 所述的發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)油的提取方式采用SDE同時(shí)蒸餾萃取法；
[0014] 所述的發(fā)酵蟲草菌絲與去離子水的質(zhì)量體積比為I : 10~1 : 50,提取時(shí)間為 4 ~24h〇
[0015] 所述的GC-MS色譜分析的條件包括：色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱 (30mX0. 25cmX0. 25mm);程序升溫條件：初始溫度40°C，停留2min，以5°C /min的速度升 至70°C，停留2min，以15°C /min的速度升至160°C，停留5min，以2°C /min上的速度升至 180°C，停留2min，以5°C /min的速度升至280°C，停留2min ;進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比 100 : 1 ;載氣流速lml/min ;進(jìn)樣量：1 yL ;進(jìn)樣口溫度：250°C;離子源溫度：230°C;接口溫 度280°C ;四級(jí)桿溫度150°C ;離子源電壓：70ev ;質(zhì)譜掃描范圍：(m/z)35-480amu。
[0016] 所述的相對(duì)含量采用采用面積歸一化方法進(jìn)行計(jì)算。
[0017] 所述的發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分的鑒定采用NIST譜庫(kù)檢索的方法。
[0018] 所用的化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件為SIMCA P+12. 0軟件。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是：
[0020] (1)本發(fā)明首次采用GC-MS技術(shù)對(duì)發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定。確定了制 備供試品溶液及GC-MS色譜儀的色譜條件的最優(yōu)參數(shù)，分離效果好，靈敏度高，提高了結(jié)果 的準(zhǔn)確性，為發(fā)酵蟲草菌絲的鑒別提供新的方法。
[0021] (2)本發(fā)明將發(fā)酵蟲草菌絲揮發(fā)性成分的GC-MS色譜圖與化學(xué)計(jì)量學(xué)手段相結(jié) 合，可以直觀的區(qū)別不同的發(fā)酵蟲草菌絲，方法簡(jiǎn)便，可用于發(fā)酵蟲草菌絲的鑒別。 【【附圖說(shuō)明】】
[0022] 圖1為具有衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品1的GC-MS總離子流圖；
[0023] 圖2-1為具有衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品2的GC-MS總離子流圖；
[0024] 圖2-2為具有衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品3的GC-MS總離子流圖；
[0025] 圖2-3為具有衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品4的GC-MS總離子流圖；
[0026] 圖2-4為具有衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品5的GC-MS總離子流圖；
[0027] 圖2-5為無(wú)衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品6的GC-MS總離子流圖；
[0028] 圖2-6為無(wú)衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品7的GC-MS總離子流圖；
[0029] 圖2-7為無(wú)衛(wèi)健字號(hào)的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品8的GC-MS總離子流圖；
[0030] 圖3為具有衛(wèi)健字號(hào)的5種發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品1、2、3、4、5及其他3種無(wú)衛(wèi)健字號(hào) 的發(fā)酵蟲草菌絲產(chǎn)品6、7、8的多元化統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖； 【【具體實(shí)施方式】】
[0031] 以下提供本發(fā)明一種基于GC-MS技術(shù)鑒定發(fā)酵蟲草菌絲中揮發(fā)性成分的方法的
【具體實(shí)施方式】，結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 本實(shí)施例以一種發(fā)酵蟲草菌絲膠囊中揮發(fā)性成分的檢測(cè)為例說(shuō)明其GC