腎癌血液生物標志物(Biomarker)的檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種腎癌血液生物標志物的檢測方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎臟在身體中扮演著過濾裝置的角色，能夠從血液中去除廢物、多余水分及鹽分。 腎癌通常表示發(fā)生在腎臟的實質(zhì)部（腎臟中制造尿的細胞集聚而成的部分，其由髓質(zhì)與皮 質(zhì)構(gòu)成）的腎細胞癌（renalcellcarcinoma)。典型地，腎細胞癌通常W發(fā)生在一側(cè)腎臟 的單一腫瘤為典型例，但有時候也會侵犯到兩側(cè)腎臟。
[0003] 腎細胞癌可W分類為透明細胞型腎細胞癌（clearcellRCC)、乳頭狀腎細胞 癌（papillaryRCC)、嫌色性腎細胞癌（C虹omo地obeRCC)、髓質(zhì)性腎細胞癌（medullary RCC)、未分類腎細胞癌（unclassifiedRCC)、腎孟移行細胞癌化i化eytransitionalcell carcinoma,TCC)、腎嗜酸細胞癌（ranaloncocytoma)等，其中，透明細胞型腎細胞癌占 66~75%，乳頭狀腎細胞癌占15 %左右，嫌色性腎細胞癌占5 %左右。
[0004] 腎細胞癌可W根據(jù)Roboson分期體系如下分類，局限于實質(zhì)部內(nèi)的腫瘤稱為第一 期，浸潤到腎皮膜外或者局限于腎筋膜內(nèi)的腫瘤稱為第二期，轉(zhuǎn)移到腎臟周圍血管或淋己 結(jié)時稱為第=期，侵犯到腎臟周圍的其它臟器或者發(fā)生遠距轉(zhuǎn)移時稱為第四期。第一期還 根據(jù)腫瘤大小而如下區(qū)分，腫瘤大小低于4cm時稱為la，4cmW上時稱為Ib，第S期則對侵 犯到腎靜脈或下腔靜脈等腎臟周圍血管者稱為III/a期，如果轉(zhuǎn)移到腎臟周圍淋己結(jié)則稱 為III/a期。
[0005] 腎癌主要發(fā)生在60~70歲的老年層并且呈現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢，在韓國的男性 癌癥病人中W2.0%占據(jù)第10位，在韓國女性癌癥病人中W1.2%占據(jù)第15位。腎癌在腫 瘤大小較小時幾乎沒有任何癥狀，腫瘤生長到一定大小而成為推擠臟器的程度時才會出現(xiàn) 癥狀。最常見的癥狀是血尿，但也僅呈現(xiàn)在60%左右的患者。因此，常常出現(xiàn)診斷過遲的情 形而在第一次診斷出來時大約有30%的患者已經(jīng)處于轉(zhuǎn)移狀態(tài)，并且根據(jù)轉(zhuǎn)移的部分而出 現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、頭痛之類的癥狀。
[0006] 大多數(shù)情況下，診斷腎癌時利用x-ray、CT攝影、超聲波及組織分析之類的方法。 該些方法難W區(qū)分各種形式的腎癌，需時較長，勞動力的投入較多。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案則把能夠適用于腎癌早期診斷及非侵入性診斷的3種腎 癌血液生物標志物NNMT(NicotinamideN-meth}dtransferase)、LCP1 (L-Plastin)及 NM23A(Non-metastaticcellsIprotein)加W組合?利用而得W提高腎癌診斷能力。
[000引解決的技術(shù)課題
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種腎癌血液生物標志物的檢測方法。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種腎癌血液生物標志物的檢測試劑盒化it)。
[0011] 本發(fā)明的其它目的或具體目的將在后述說明中得到闡述。
[0012] 解決課題的技術(shù)方案
[0013] 本發(fā)明提供一種腎癌血液生物標志物的檢測方法。
[0014] 本發(fā)明人利用取自腎癌患者100人與正常人90人的共190個血液試劑進行了預(yù) 備實驗并且得知患者群的NNMT、LCP1及醒23A的血中濃度高于正常人群，從而得W確認該 些蛋白質(zhì)具有作為腎癌血液生物標志物的可能性，把上述3種腎癌血液生物標志物組合后 通過ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲線分析法對腎癌診斷能力進行評估時， 發(fā)現(xiàn)該些標志物的診斷能力得到了提升。具體地說，3種血液生物標志物中診斷能力最強 的NNMT(在NNMT、LCP1及NM23A等3種標志物中NNMT的診斷能力最高，請參考下列實施 例）的準確度（AUC)為0. 927,特異度為95 %時靈敏度為69 %，但是把3種血液生物標志物 組合后適用逐步邏輯回歸分析法（stepwiselogisticregressionanalysis)時，準確度 為0.9333,特異度為95 %時靈敏度為77%，適用下列實施例中的計分法（scoringmethod) 時，AUC為0. 948,特異度為95 %時靈敏度為89%。
[0015] 更進一步，W使用該190個血液試劑的預(yù)備實驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，本發(fā)明人根據(jù)基 于上述計分法的上述3種腎癌血液生物標志物的組合對30個正常人血液試劑與29個患 者血液試劑實際進行盲試化lindtest)實驗并且在其結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠把正常人30人中的 29人識別成正常人而能夠把患者29人中的28人識別成患者（亦即，靈敏度96. 67% = 29/30X100(% )、特異度 96. 55%= 28/29X100(% ))。
[0016] 本發(fā)明的腎癌血液生物標志物的檢測方法是W該實驗結(jié)果為基礎(chǔ)提供的，具體地 說，其包括下列步驟；步驟（a)，讓取自受檢人的血液試劑或其加工試劑與特異于各個腎癌 血液生物標志物NNMT、LCP1及醒23A的結(jié)合分子反應(yīng)，讓存在于上述試劑的腎癌血液生物 標志物NNMT、LCP1及醒23A各自和特異于它的結(jié)合分子形成結(jié)合體；及步驟化），檢測上述 結(jié)合體。
[0017] 在上述內(nèi)容中，NNMT(nicotinamide-N-meth}dtransferase)是一種參與到煙酷胺 (nicotinamide)的甲基化轉(zhuǎn)移（N-methylation)的酶并且由總共264個氨基酸組成，其分 子量為29. 6邸a。其基因序列被揭不為GeneBankAccessionnumber:NM_006169,其氨基酸 序列被揭示為GeneBankAccessionnumber:NP_006160. 1。
[001引在上述內(nèi)容中，LCP-l(L-Plastin)是肌動蛋白結(jié)合蛋白系列的一種，其具有L型 與T型等兩種形態(tài)，其中的L型被認為只在hemopoieticcell表達，總共由627個氨基酸組 成，分子量為70. 8邸a。其基因序列被揭不為GeneBankAccessionnumber:NM_002298. 4， 其氨基酸序列被揭示為GeneBankAccessionnumber:NP_002289. 1。
[0019] 而且，在上述內(nèi)容中，醒23A是被認為在腫瘤轉(zhuǎn)移較為活潑時mRNA量減少的基因 的蛋白質(zhì)醒23的A型異構(gòu)體?？偣灿?52個氨基酸組成，分子量為16. 9KDa。其基因序 列被揭不為GeneBankAccessionnumber:NM_198175. 1，其氨基酸序列被揭不為GeneBank Accessionnumber:NP_000260.l〇
[0020] 能夠憑借本發(fā)明的檢測方法把血液中的腎癌血液生物標志物NNMT、LCP1及NM23A 全部予W定量，該些定量值則由醫(yī)師之類的醫(yī)療專家用來判斷腎癌罹患與否、腎癌發(fā)展程 度及/或腎癌治療經(jīng)過。
[002U 尤其是，本發(fā)明的檢測方法能夠把腎癌血液生物標志物NNMT、LCP1及醒23A全部 檢測，因此即使如下列實施例所述地應(yīng)用于腎癌初期階段的第一期患者也能呈現(xiàn)出96%的 特異度（把正常人120人中的115人識別成正常人，96%= 115/120X100)及95%的靈敏 度（把第一期的患者59人中的56人識別成患者），從而能夠非常有效地適用于腎癌的早期 診斷（作為參考，作為單一生物標志物而具有最強診斷能力的NNMT也只呈現(xiàn)出86%的特 異度與92%的靈敏度），而且對腎細胞癌類型中占大多數(shù)的透明細胞型腎細胞癌也呈現(xiàn)出 96%的靈敏度而能夠非常有效地適用于透明細胞型腎細胞癌的診斷（作為參考，作為單一 生物標志物而具有最強診斷能力的NNMT也只呈現(xiàn)出93%的靈敏度）。
[0022] 在本說明書中，"血液的加工試劑"指的是血漿或血清。
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