拌培養(yǎng)基，最后將剩余的1640培養(yǎng)基慢慢 加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細(xì)胞，再加入飼養(yǎng) 脾細(xì)胞。根據(jù)需要補(bǔ)加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，再將含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞融合液滴加 到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，滴加量約為150yL/孔。將培養(yǎng)板置于37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng) 箱中，進(jìn)行培養(yǎng)。用建立的間接ELISA篩選陽性細(xì)胞克隆。選擇強(qiáng)陽性集落生長的孔，用有 限稀釋法進(jìn)行克隆。并對其他陽性孔，進(jìn)行24孔擴(kuò)大培養(yǎng)，用間接ELISA和間接競爭ELISA 對擴(kuò)大培養(yǎng)孔的上清液進(jìn)行檢測，對間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行 液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進(jìn)行3次亞克隆后獲得雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng) 過多次傳代、凍存、復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體的計數(shù)，將每株 雜交瘤細(xì)胞隨機(jī)選擇20個細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色體條數(shù)的計數(shù)，再計算細(xì)胞染色體條數(shù)的平 均值。取細(xì)胞株細(xì)胞分泌的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞 型。通過上述方法分別制備了抗CLE和EDP單克隆抗體細(xì)胞株（4. 1.6/5A2)。采用辛酸一 硫酸銨法對小鼠腹水進(jìn)行純化。該單克隆抗體可用于制備膠體金。
[0019] 步驟三、用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金； (1)膠體金的制備 量取去離子水100mL，移入500mL的平底燒瓶中，將燒瓶置于磁力攪拌器的加熱套內(nèi)， 打開攪拌旋鈕和加熱旋鈕，加熱至沸騰。加入1%HAuC14溶液1.0mL，繼續(xù)加熱2min，然 后一次性迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱。待溶液變?yōu)榱良t色或橙紅色后，再繼續(xù) 加熱攪拌15min。關(guān)掉加熱旋扭，冷卻至室溫，過濾備用。
[0020] 步驟四、提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體； 用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西蘭大白兔，制備高效價的兔抗鼠IgG高免血清，采用 飽和硫酸銨沉淀法對血清進(jìn)行粗提，經(jīng)G-200過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG。利用兔抗鼠 IgG作為質(zhì)控線。
[0021] 步驟五、將步驟二制成的所述抗CLE和EDP藥物單克隆抗體加入步驟三制備的 膠體金中，得到抗CLE和EDP單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； 于50mL的小燒杯中加入30mL的膠體金，用0.lmol/LK2C03適量調(diào)pH達(dá)到最佳標(biāo)記pH值，在攪拌的狀態(tài)下，緩慢加入一定量稀釋好的抗CLE和EDP單克隆抗體，繼續(xù)攪拌30min; 加10%BSA使其終濃度為1%，攪拌30min;4°C放置2h后，將以上膠體金標(biāo)記物分裝，以2 000r/min離心15min，取上清，棄去沉淀；以10 000r/min離心30min，棄上清，加入標(biāo)記 洗絳液到原體積；再次以10 〇〇〇r/min離心30min，棄上清，加入標(biāo)記洗絳液到原體積；以 10 000r/min離心30min，棄上清，沉淀用1.0mL標(biāo)記洗絳液進(jìn)行重懸，然后置4°C冰箱。
[0022] 步驟六、將步驟五制備的所述抗CLE和EDP單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在所 述結(jié)合墊上； 分別剪取規(guī)格為20X4mm的玻璃纖維棉，然后將步驟五中制備的4種金標(biāo)抗體復(fù)合物 溶液用ZX1000噴點(diǎn)平臺系統(tǒng)均勻噴灑于玻璃纖維棉上，置于37 °C干燥lh，加入干燥劑密 封保存，后置于4°C冰箱。
[0023] 步驟七、將步驟一合成的所述偶聯(lián)物DCL-BSA分別包被在所述硝酸纖維素膜中， 得到檢測線； 步驟八、將步驟四中制備的所述兔抗鼠IgG抗體包被在所述硝酸纖維素膜中，得到質(zhì) 控線； 將NC膜置于ZX1000噴點(diǎn)平臺系統(tǒng)上，將濃度為0. 2mg/mL的完全抗原DCL-BSA放于 一個貯存池，濃度為0.4mg/mL的GaMIgG放于另一個貯存池。將NC膜展平，放上壓條，質(zhì) 控線與檢測線位于膜的中間相距0.5cm，其距膜的邊距為0.75cm。開機(jī)后，噴點(diǎn)平臺系統(tǒng) 將完全抗原DCL-BSA和兔抗鼠IgG分別點(diǎn)射于NC膜上，形成2條檢測線和1條質(zhì)控線，置 室溫自然干燥后，加入干燥劑密封，置于4 °C保存，備用。
[0024] 步驟九、將所述手控區(qū)封膜、所述吸水墊、所述硝酸纖維素膜、所述結(jié)合墊、所述樣 品墊和所述樣品端封膜依次粘貼在所述背板上，制得同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺 EDP殘留的試紙條；將組裝的半成品試紙條放入試紙條切割機(jī)槽內(nèi)進(jìn)行切割，然后將制備 成品的試紙條注明生產(chǎn)時間和批次，置4 °C保存（密封）。
[0025] 本發(fā)明所述試紙條的使用方法： (1)組織樣品預(yù)處理 將大_&、油采、白采、甘藍(lán)等待檢樣品勾楽，取2g樣品加入4mL乙酸乙醋振湯2min，室溫 3000r/min離心5min，取300yL上層液體于1. 5mL離心管中，80°C水浴蒸干（大約30min) 或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50yL稀釋液溶解殘留物。
[0026] (2)檢測結(jié)果判定 將樣品液滴加到試紙條樣品墊上，樣品在毛細(xì)管作用下沿試紙條泳動，當(dāng)泳動至金標(biāo) 墊時，固態(tài)化的金標(biāo)抗單抗迅速溶解釋放，隨樣品一起沿試紙條泳動至檢測線，若樣品中含 有EDP或CLE首先與金標(biāo)抗CLE和EDP單抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，抑制金標(biāo)抗 CLE和EDP單抗與檢測線包被的DCL-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線截獲的金標(biāo)抗體的量減 少，檢測線顏色變淺，當(dāng)樣品中EDP或CLE量足夠大時，檢測線將無顏色出現(xiàn)，金標(biāo)單抗穿過 檢測線與被包被于質(zhì)控線的兔抗鼠IgG截獲質(zhì)控線線出現(xiàn)紅色條帶；反之，若樣品中不含 EDP或CLE，金標(biāo)抗CLE和EDP單抗與包被于NC膜上的DCL-BSA偶聯(lián)物發(fā)生特異性免疫反 應(yīng)而被截獲，在檢測線形成紅色條帶，即陰性結(jié)果，部分金標(biāo)單抗穿過檢測線與被包被于質(zhì) 控線的兔抗鼠IgG截獲，形成紅色條帶。
[0027] 本發(fā)明藥物檢測試紙條的應(yīng)用 (1)同時檢測CLE和EDP多殘留試紙條的靈敏度測定 將DCL、EDP和CLE分別配成濃度為 0、1、5、10、20、40、60、80、100 ??g/L的標(biāo)準(zhǔn) 品溶液，分別加到試紙條的樣品墊上，測試重復(fù)8次，靜置試紙條反應(yīng)lOmin，然后用 BioDot-TSR3000讀條儀掃描檢測線的相對光密度值（G/Peak-ROD值）以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 與空白標(biāo)準(zhǔn)品相對光密度值的百分率（B/B0%)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的常用對數(shù)值 作為橫坐標(biāo)，繪制檢測試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，進(jìn)行相關(guān)回歸分析。通過對檢測線 的G/Peak-ROD值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，確定試紙條的檢測限。通過計算得到機(jī)讀最低檢測線 為：CLE標(biāo)準(zhǔn)曲線最低檢測線10ng/mL，EDP標(biāo)準(zhǔn)曲線最低檢測線20ng/mL。
[0028] 目測檢測方法：在有紅色質(zhì)控線出現(xiàn)的情況下，當(dāng)試紙條與陰性對照試紙條檢測 線顏色相似紅色條帶時判為陰性；當(dāng)試紙條檢測線顏色明顯淺于陰性對照試紙條檢測線顏 色時判為弱陽性；當(dāng)試紙條檢測線位置無紅色條帶出現(xiàn)時判為陽性。在試紙條沒有出現(xiàn) 紅色質(zhì)控線的情況下，說明試紙條已失效，此時不管檢測線顏色的深淺和有無，檢測結(jié)果都 判為無效，應(yīng)更換另一批次的試紙條重新檢測，CLE藥物目測檢測臨界值（cut-off值）為 40ng/mL;EDP藥物目測檢測臨界值為60ng/mL。
[0029] (2)多殘留檢測試紙條的特異性試驗(yàn) 將膠體金免疫層析快速檢測試紙條與大環(huán)內(nèi)酯類化合物的交叉反應(yīng)率見表1。從表中 可以看出，抗體對烯草酮和氯酯磺草胺有高的交叉反應(yīng)率，對其他藥物的無交叉反應(yīng)，該抗 體可用于烯草酮和氯酯磺草胺多殘留膠體金試紙條方法的建立。
[0030] 表1試紙條與大環(huán)內(nèi)酯類化合物的交叉反應(yīng)率
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條，試紙條為膠體金免疫層 析試紙條，它包括背板（2)、吸水墊（3)、硝酸纖維膜（4)、結(jié)合墊（7)、樣品墊（8)，所述背板 (2)上依次連續(xù)粘附有吸水墊（3)、硝酸纖維膜（4)、結(jié)合墊（7)和樣品墊（8)，所述樣品墊 (8)靠結(jié)合墊（7)-端搭接在結(jié)合墊（7)上，所述吸水墊（3)上表面吸附有手控區(qū)封膜（1)， 所述樣品墊（8)上表面吸附有樣品端封膜（9)，其特征在于：所述硝酸纖維膜（4)上包被有 兔抗鼠的IgG質(zhì)控線（5)和DCL-BSA兩條檢測線（6)，結(jié)合墊（7)上包被有抗CLE和EDP藥 物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條的制 備方法，其特征在于：它包括以下步驟： 步驟一、將半抗原去環(huán)酯烯草酮DCL與牛血清白蛋白偶聯(lián)合成偶聯(lián)物DCL-BSA; 步驟二、將步驟一合成的所述偶聯(lián)物DCL-BSA免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合篩選得 到抗CLE和EDP藥物單克隆細(xì)胞株，分別將得到的抗CLE和EDP藥物單克隆細(xì)胞株注射到 小鼠腹腔，得到抗CLE和EDP藥物單克隆抗體，該抗體與烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP有 較高的交叉反應(yīng)； 步驟三、用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金； 步驟四、提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗體； 步驟五、將步驟二制成的所述抗CLE和EDP藥物單克隆抗體加入步驟三制備的膠體 金中，得到抗CLE和EDP單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物； 步驟六、將步驟五制備的所述抗CLE和EDP單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在所述結(jié) 合墊（7)上； 步驟七、將步驟一合成的所述偶聯(lián)物DCL-BSA分別包被在所述硝酸纖維素膜（4)中，得 到檢測線（6); 步驟八、將步驟四中制備的所述兔抗鼠IgG抗體包被在所述硝酸纖維素膜（4)中，得到 質(zhì)控線（5); 步驟九、將所述手控區(qū)封膜（1)、所述吸水墊（3)、所述硝酸纖維素膜（4)、所述結(jié)合墊 (7)、所述樣品墊（8)和所述樣品端封膜（9)依次粘貼在所述背板（2)上，制得同時檢測烯草 酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條。
【專利摘要】本發(fā)明涉及蔬菜農(nóng)藥殘留免疫學(xué)快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種同時檢測烯草酮CLE和氯酯磺草胺EDP殘留的試紙條，試紙條為膠體金免疫層析試紙條，硝酸纖維膜上包被有兔抗鼠的IgG質(zhì)控線和DCL-BSA兩條檢測線，結(jié)合墊上包被有抗CLE和EDP藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)篩選出抗CLE和EDP藥物的單克隆抗體，通過膠體金的制備及膠體金標(biāo)記條件的探索研究，在應(yīng)用抗CLE和EDP藥物單克隆抗體和膠體金技術(shù)研究建立同時檢測CLE和EDP藥物殘留的膠體金試紙條，并對其性能進(jìn)行測定。本發(fā)明所制備的試紙條檢測樣品范圍較寬，假陽性低，檢測靈敏、準(zhǔn)確、可靠，性能穩(wěn)定，適用于對大量樣品中EDP和CLE藥物殘留的多殘留快速檢測。
【IPC分類】G01N33-577
【公開號】CN104714016
【申請?zhí)枴緾N201510022918
【發(fā)明人】王弋博, 牛小東, 謝曉玲
【申請人】天水師范學(xué)院
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年1月16日