30]本發(fā)明的熒光免疫層析試劑盒的工作原理為:采用熒光免疫層析技術(shù)及雙抗體夾心法原理定量檢測樣品(全血、血清或血漿)中的人附睪分泌蛋白-4的含量。檢測時，將樣品滴加到上樣孔中，樣品流經(jīng)標(biāo)記墊時與熒光染料標(biāo)記物相結(jié)合，并沿著層析膜向吸水墊方向毛細運動，分別流經(jīng)層析膜上的定量帶及質(zhì)控帶。若樣品中含有人附睪分泌蛋白-4，則與被熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4抗體相結(jié)合，當(dāng)層析至檢測線時，會被預(yù)先包被于該條帶的捕獲抗體所捕獲，從而構(gòu)成雙抗體夾心復(fù)合物。光源激發(fā)下，采用熒光定量儀可獲取檢測線和質(zhì)控線的熒光信號強度，依據(jù)熒光定量儀獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而可分析出樣品中含有HE4的濃度。
[0031]本發(fā)明的主要優(yōu)點如下:
[0032]I)本發(fā)明采有機用熒光染料或稀土元素?zé)晒馊玖献鳛樘禺愋钥贵w的熒光標(biāo)記物，與其他熒光染料相比，具有發(fā)光強度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長、表面修飾多功能化及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。
[0033]2)本發(fā)明試劑盒組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大于550nm時均具有低的熒光特性，可以減少對熒光染料熒光信號獲取的影響，從而保證獲得高的熒光信背比，進而達到提高靈敏度的目的。
[0034]3)本發(fā)明所述的定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析方法為Wash層析技術(shù)，可減少非特異性吸附，降低熒光本底，增強特異性結(jié)合，進而提高檢測靈敏度，有利于樣品中人附睪分泌蛋白-4含量極低時的準(zhǔn)確定量。
[0035]4)本發(fā)明方法與常規(guī)膠體金免疫層析相比，具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0036]圖1為熒光免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中I為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為血液分離膜，4為檢測線，5為質(zhì)控線，6為層析膜，7為吸水墊，8為底板。
[0037]圖2為實施例1中熒光免疫層析試紙條樣品測試示意圖，以及利用該試劑盒測試樣品得到的檢測峰和質(zhì)控峰。
[0038]圖3為熒光免疫層析試劑盒示意圖，其中11為扣卡，9為加樣孔，10為觀察窗，4為檢測線，5為質(zhì)控線。
[0039]圖4為實施例1中熒光免疫層析試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以人附睪分泌蛋白-4濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強度(檢測峰面積比質(zhì)控峰面積比值)為縱坐標(biāo)。
【具體實施方式】
[0040]實施例1:以共價交聯(lián)方式用熒光染料修飾抗體，并采Wash免疫層析技術(shù)對人附睪分泌蛋白-4的定量檢測
[0041]I)熒光染料與抗體的偶聯(lián)
[0042]將發(fā)射波長為665nm的焚光染料羅丹明與I mg/ml的人附睪分泌蛋白_4單克隆抗體混合，室溫反應(yīng)3h，加入lmol/L鹽酸羥胺終止反應(yīng)，并用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4單克隆抗體。同理得到熒光染料羅丹明修飾的兔IgG(質(zhì)控分子)。其中修飾人附睪分泌蛋白-4抗體的熒光染料的熒光發(fā)射波長與修飾兔IgG的熒光染料的熒光發(fā)射波長均為665nm。
[0043]2)試劑盒的構(gòu)建
[0044]以1:1的比例混合兩種熒光染料標(biāo)記物，并加入牛血清白蛋白(含量為1% )、蔗糖(含量為10% )以及表面活性劑曲拉通X-100 (含量為0.8% )，隨后均勻噴涂在標(biāo)記墊上，40 °C干燥后密封，室溫下保存。
[0045]如圖1所示，組裝定量檢測HE4的熒光免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、標(biāo)記墊
(2)、血液分離膜(3)、層析膜￠)、吸水墊(7)組成，順次粘貼于白色底板(8)上。其中，樣品墊為孔狀隔膜，選擇玻璃纖維，為待測樣品收集區(qū)；結(jié)合墊中含有熒光染料修飾的HE4特異性抗體及熒光染料修飾的兔IgG ;層析膜上固定有定量檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，檢測線和質(zhì)控線的間隔為5mm，且檢測線(4)固定有區(qū)別于標(biāo)記墊中HE4特異性抗體的另一抗原表位的特異性抗體，質(zhì)控線(5)固定有羊抗兔抗體。組裝好后，按照要求切割為所需寬度，并置于扣卡(11)內(nèi)，如圖2所示，加入干燥劑封裝，與Wash緩沖液共同構(gòu)建為熒光免疫層析試劑盒。
[0046]3)樣品的檢測
[0047]a)將HE4抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清作為稀釋液分別配制為Ong/mL和1000ng/mL濃度；
[0048]b)將步驟a)中兩種濃度的HE4標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次按照10000:0、9999:1、9990:10、9900:100,7500:2500,5000:5000 和 0:10000 的比例進行混合；
[0049]c)分別將步驟b)中配制的血清溶液(10yL)滴加于加樣孔(9)中，正向?qū)游龇磻?yīng) 15min ；
[0050]d)配制Wash緩沖液，pH值為7.5，緩沖系統(tǒng)為20mM的磷酸鹽，加入牛血清白蛋白(濃度為1% )、蔗糖(濃度為10% )以及表面活性劑曲拉通x-100 (濃度為0.8% )，在樣品孔加入50 μ L，靜置5min。
[0051]e)置于熒光定量儀中獲取熒光信號強度，并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，請參見圖4 ;
[0052]f)同步驟c)和步驟d)操作，對待測樣品進行檢測，熒光儀檢測峰見圖3，層析結(jié)束后，置于熒光定量儀內(nèi)獲取熒光信號強度，并依據(jù)步驟e)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析該樣品中HE4的含量；
[0053]g)輸出檢測報告。
[0054]4)結(jié)果分析
[0055]結(jié)果表明，其最低檢測限為0.05ng/mL，最低定量限為0.1ng/mL，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，對卵巢癌的早期診斷具有參考價值。
【主權(quán)項】
1.一種定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒，包括扣卡(11)、熒光免疫層析試紙條和Wash緩沖液，其特征在于: 扣卡(11)為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括加樣孔(9)和觀察窗(10); 熒光免疫層析試紙條包括樣品墊(I)、標(biāo)記墊(2)、層析膜(6)、吸水墊(7)和底板(8)，樣品墊(1)、標(biāo)記墊(2)、層析膜(6)和吸水墊(7)搭載于底板(8)之上，樣品墊(I)位于加樣孔(9)的下方，且連接于標(biāo)記墊(2)，標(biāo)記墊(2)連接于層析膜(6)，層析膜(6)連接于吸水墊(7)，層析膜(6)上固定有一條定量檢測線(4)和一條質(zhì)控線(5)，檢測線(4)和質(zhì)控線(5)位于觀察窗(10)的下方； 標(biāo)記墊(2)上同時固定有熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體，和熒光染料修飾的質(zhì)控分子，修飾人附睪分泌蛋白-4特異性抗體的熒光染料的發(fā)射波長與修飾質(zhì)控分子的熒光染料的發(fā)射波長相同，波長范圍為300-1300nm ； 定量檢測線(4)上固定有人附睪分泌蛋白-4特異性抗體，該特異性抗體所識別的抗原決定簇與固定在標(biāo)記墊(2)上的熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體所識別的抗原決定簇不同；以及 質(zhì)控線(5)上固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光免疫層析試紙條還包括血液分離膜(3)，其設(shè)置在標(biāo)記墊(2)和層析膜(6)之間，此時標(biāo)記墊(2)連接于血液分離膜(3)，血液分離膜(3)連接于層析膜(6);或者設(shè)置在樣品墊(I)和標(biāo)記墊(2)之間，此時樣品墊(I)連接于血液分離膜(3)，血液分離膜(3)連接于標(biāo)記墊(2);或者直接與樣品墊(I)合并為同一結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光染料為有機熒光染料或稀土元素?zé)晒馊玖?，發(fā)射波長為550-800nm，優(yōu)選665nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述層析膜、底板和扣卡在大于550nm時熒光很弱或不含有熒光劑，優(yōu)選底板為白色，表面附有不干膠，且兩者均不含熒光劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述Wash緩沖液包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性劑，pH值為7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的濃度為0.05?2%，蔗糖的濃度為I?15%，表面活性劑的濃度為0.05?2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟(I):用化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用分別將熒光染料偶聯(lián)到人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和質(zhì)控分子的表面，分別得到熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和熒光染料修飾的質(zhì)控分子，修飾所述質(zhì)控分子的熒光染料的發(fā)射波長與修飾人附睪分泌蛋白-4特異性抗體的熒光染料的發(fā)射波長相同，波長范圍為300?1300nm ； 步驟(2):將步驟(I)得到的熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體和熒光染料修飾的質(zhì)控分子均固定到標(biāo)記墊(2)上； 步驟(3):在層析膜(6)上分別設(shè)置一條定量檢測線(4)和一條質(zhì)控線(5)，其中，質(zhì)控線(5)上固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量檢測線(4)上固定有人附睪分泌蛋白-4特異性抗體，且該特異性抗體所識別的抗原決定簇與固定在標(biāo)記墊(2)上的熒光染料修飾的人附睪分泌蛋白-4特異性抗體所識別的抗原決定簇不同； 步驟(4):將樣品墊(1)、標(biāo)記墊(2)、層析膜￠)、吸水墊(7)和底板(8)構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條； 步驟(5):將熒光免疫層析試紙條裝卡。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括設(shè)置血液分離膜(3)的步驟，血液分離膜(3)設(shè)置在標(biāo)記墊(2)和層析膜(6)之間，此時標(biāo)記墊(2)連接于血液分離膜(3)，血液分離膜(3)連接于層析膜(6);或者設(shè)置在樣品墊(I)和標(biāo)記墊(2)之間，此時樣品墊(I)連接于血液分離膜(3)，血液分離膜(3)連接于標(biāo)記墊(2);或者直接與樣品墊(I)合并為同一結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述熒光染料為有機熒光染料或稀土元素焚光染料，發(fā)射波長為550-800nm，優(yōu)選665nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述層析膜、底板和扣卡在大于550nm時熒光很弱或不含有熒光劑，優(yōu)選底板為白色，表面附有不干膠，且兩者均不含熒光劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括配制Wash緩沖液的步驟，Wash緩沖液包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性劑，PH值為7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的濃度為0.05?2%，蔗糖的濃度為I?15%，表面活性劑的濃度為0.05?2%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以熒光染料為標(biāo)記物的定量檢測人附睪分泌蛋白-4的熒光免疫層析試劑盒。本發(fā)明的熒光免疫層析試劑盒實現(xiàn)了對人附睪分泌蛋白-4的熒光定量檢測，具有穩(wěn)定性好、線性范圍寬、特異性好、定量準(zhǔn)確以及簡單快速的優(yōu)勢，可同時檢測全血、血清及血漿樣品，并適用于各級醫(yī)院。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104655858
【申請?zhí)枴緾N201510107441
【發(fā)明人】李道鋒, 潘文東, 王新華
【申請人】德邁基生物技術(shù)（北京）有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年3月12日