基于多功能化氮化碳材料的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，尤其是涉及一種基于多功能化氮化碳材 料的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)與預(yù)測：2008年全世界有760萬人死于腫瘤疾病，2030年預(yù)計(jì)將有 1100萬人死于腫瘤疾病，腫瘤疾病已經(jīng)成為公共衛(wèi)生的頭號公敵。腫瘤專家認(rèn)為，實(shí)現(xiàn)對腫 瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，可以有效降低腫瘤發(fā)病率、減少病死人數(shù)、控制醫(yī)治費(fèi) 用，其中早期診斷是關(guān)鍵。然而，腫瘤疾病早期癥狀不明顯，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠的早期診 斷并不容易，腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)使癌癥的早期診斷成為可能。腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤的發(fā) 生和增殖過程中產(chǎn)生的、反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶、基因等。 一般而言，腫瘤細(xì)胞越多，惡性程度越高，越晚期，腫瘤標(biāo)志物的濃度越高。因此，患者血液 或組織中腫瘤標(biāo)志物的檢測，對腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、病情監(jiān)測以及預(yù)后 的評價(jià)具有很尚價(jià)值。
[0003] 目前檢測腫瘤標(biāo)志物的方法主要有：放射免疫分析法（RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分 析法（ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA)、電化學(xué)免疫分析法（ECIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫 (ECLIA)和免疫電鏡法等，這些方法都有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，但也各有一定的不足之 處：有的儀器昂貴、操作復(fù)雜、技術(shù)要求高，有的步驟繁多、易出現(xiàn)假陽性和假陰性，有的使 用放射性試劑，有的特異性不強(qiáng)、靈敏度不高，有的響應(yīng)時(shí)間長、無法重復(fù)測量。因此，開發(fā) 靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便的腫瘤標(biāo)志物檢測方法是迫切需求。
[0004] 免疫傳感器是利用抗體與抗原之間的特異性識別與結(jié)合而研制成的一類生物傳 感器，電化學(xué)發(fā)光（ECL)免疫傳感器是電化學(xué)發(fā)光和免疫傳感器相結(jié)合的產(chǎn)物，其中無標(biāo)記 型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器以具備快速、穩(wěn)定、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作、步驟簡單等優(yōu) 點(diǎn)被廣泛運(yùn)用，具有良好的應(yīng)用前景。
[0005] 氮化碳材料（g_C3N4)是一種類似石墨的納米薄膜，具有比表面積大、穩(wěn)定性強(qiáng)、硬 度大、導(dǎo)電性好、生物相容性良好等特點(diǎn)，并且氮化碳材料本身具有極強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光的能 力，非常適合用于開發(fā)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。目前未見基于多功能化氮化碳材料的腫瘤 標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的相關(guān)研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本 低、快速，且制備過程極其簡單的基于多功能化氮化碳材料的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫 傳感器的制備方法及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種基于多功能化氮化碳材料的 腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，具體步驟如下： (1) 多功能化氮化碳材料的制備 a. 將三聚氰胺在500~600°C下加熱3~5 h，真空干燥后得到氮化碳（g-C3N4)粉末； b. 取0· 8~I. 5 g氮化碳粉末加入到80~120 mL 4~6 mol/L HNO3中，于120~ 150°C下回流24~48小時(shí)后，自然冷卻至室溫，水洗滌至pH=7,離心，將沉淀在35~40°C 下真空干燥12~20小時(shí)，得到羧基化的氮化碳（g-C3N4); c. 取 0· 2 ~0· 5 g FeCl2 · 4H20 和 0· 6 ~I. 0 g FeCl3 · 6H20 溶于 50 ~100 mL 除氧 的二次水中，然后在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下逐滴加入到三口燒瓶中，磁力攪拌使其充分混合均勻，然 后將25wt%~28wt%的氨水逐滴緩慢加入到三口燒瓶中直至溶液的pH為8. 0~10. 0,將三 口燒瓶內(nèi)的溶液加熱到70~100°C后，于70~100°C攪拌回流1~3 h，然后停止加熱在氮 氣氛保護(hù)下攪拌、回流冷卻至室溫，得到黑色沉淀物納米四氧化三鐵；將納米四氧化三鐵用 水清洗至中性，定容至50 mL，超聲30 min~I h后，加入0. 1~0. 2 mL 3-氨丙基三乙氧 基硅烷（APTES)，室溫下攪拌6~8 h，得到氨基化的納米四氧化三鐵懸濁液； d. 取150~250 μL 0. 5~I. 5 mg/mL羧基化的氮化碳加入150~250 μL偶聯(lián)試劑 后，用0.8~1.2 mol/L鹽酸調(diào)pH為4.0~6.0,振搖1~2 h，離心取沉淀加水洗絳后， 再離心取沉淀加水洗滌，再次離心取沉淀加水洗滌后，定容至200~300 μL，用0. 1~0. 2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為8. 0~10. 0,然后加入50~100 μL 0· 1~I Pg/mL腫瘤標(biāo)志物 抗體溶液，搖床孵育1~2 h后再加入150~250 PL氨基化的納米四氧化三鐵懸濁液，繼 續(xù)孵育3~5 h，再加入50~100 PL 2%牛血清白蛋白溶液以封閉非特異性吸附位點(diǎn)，繼續(xù) 孵育1~2 h，用磁鐵吸引分離，水清洗至中性后，定容至100~200 μL，即得到多功能化氮 化碳材料溶液； (2) 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的組裝 a. 將直徑為3~5 mm的磁性玻碳電極依次用1. 0、0. 3和0. 05 μ m的Al2O3拋光粉在 麂皮上拋光至鏡面，超聲清洗2 min，然后依次用乙醇水溶液、硝酸水溶液和蒸餾水超聲清 洗； b. 取5~10 PL步驟（1)所得的多功能化氮化碳材料溶液，滴在磁性玻碳電極表面， 多功能化氮化碳材料即被均勻、牢固地吸附于電極表面，即得到用于檢測腫瘤標(biāo)志物的電 化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
[0008] 步驟（1)中所述的偶聯(lián)試劑為1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽與 N-羥基琥珀酰亞胺溶于水中得到，所述的偶聯(lián)試劑中1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二 亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度為10~100 mmol/L，所述的N-羥基琥珀酰亞胺摩爾濃度為1~10 mmol/L〇
[0009] 步驟（1)中所述的腫瘤標(biāo)志物為：甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、糖類抗原15-3 (CA15-3)、糖類抗原125 (CA125)、糖類抗原19-9 (CA19-9)或前列腺特異性抗原（PSA)。
[0010] 步驟（2)中所述的乙醇水溶液由乙醇和水按體積比1:1混合而成；所述的硝酸水 溶液由硝酸和水按體積比1:1混合而成。
[0011] 上述基于多功能化氮化碳材料的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于檢測腫 瘤標(biāo)志物的方法，具體步驟如下：將用于檢測腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器浸泡在 不同濃度的腫瘤標(biāo)志物溶液中，于37°C下溫育I h后取出，水清洗后，作為工作電極；采用 鉑電極作為對電極，Ag/AgCl電極或者飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)成三電極體系；將三 電極體系放入緩沖溶液，啟動電化學(xué)反應(yīng)，測量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；獲得一系列不同濃度的月中 瘤標(biāo)志物溶液對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，建立電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值與腫瘤標(biāo)志物溶液濃度之 間的定量關(guān)系；根據(jù)這個(gè)定量關(guān)系檢測待測樣品中腫瘤標(biāo)志物的濃度。
[0012] 所述的緩沖溶液為：pH = 7. 5~8. 5的磷酸鹽緩沖溶液，含有10~30 mmol/L K2S2OjP 80 ~100 mmol/L KCl。
[0013] 所述的電化學(xué)反應(yīng)的條件如下：電位階躍計(jì)時(shí)電流法，脈沖寬度：0. 25秒；脈沖間 隔：30秒；初始電壓：0V ;脈沖電壓：-1. IV。
[0014] 所述的腫瘤標(biāo)志物為：甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、糖類抗原15-3 (CA15-3)、 糖類抗原125 (CA125)、糖類抗原19-9 (CA19-9)或前列腺特異性抗原（PSA)。
[0015] 發(fā)明原理：多功能化氮化碳材料，在氮化碳上同時(shí)負(fù)載有納米四氧化三鐵、腫瘤 標(biāo)志物抗體，具有多種功能：（1)氮化碳材料表面積大、羧基官能團(tuán)多，可以負(fù)載大量的納 米四氧化三鐵、腫瘤標(biāo)志物抗體；（2)氮化碳材料自身具有極強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光，不需要另外 標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光體，大大簡化了制備步驟；（3)納米四氧化三鐵，可以使得平面結(jié)構(gòu)的多功 能化氮化碳材料均勻、牢固地吸附于電極表面，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的一步制備，進(jìn) 一步簡化了傳感器制備方法，且納米四氧化三鐵可以大大提高多功能化氮化碳材料的導(dǎo)電 性，提高電化學(xué)發(fā)光性能；（4)腫瘤標(biāo)志物抗體，可以特異性識別腫瘤標(biāo)志物；（5)多功能化 氮化碳材料，具有平面結(jié)構(gòu)和良好的導(dǎo)電性能，在磁力吸引下完全處于電極表面的外赫姆 霍茲面之內(nèi)，大大增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光信號。
[0016] 本