一種貼壁細胞定量代謝組學分析樣品預處理的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種貼壁細胞定量代謝組學分析樣品預處理的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學后出現(xiàn)的又一以高通量為顯著特征的研究技術(shù)，它主要是通過對細胞、組織或特定體液內(nèi)小分子代謝物的定性定量分析反應(yīng)生物體系的表型特征。代謝物分子是基因和蛋白活動的最終體現(xiàn)者，最能反映研究對象的表型特征，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病、營養(yǎng)、代謝、轉(zhuǎn)基因作物、微生物等生命科學的各個領(lǐng)域。相對其他組學技術(shù)而言，代謝組學的優(yōu)勢至少體現(xiàn)在如下幾個方面:(I)代謝物的種類遠小于基因和蛋白，工作量相對較?。?2)基因和蛋白水平的細微改變可在代謝組水平得到放大，能夠更靈敏地反映表型特征的變化；(3)代謝組學研究往往不需要特定基因和蛋白信息的支持，能對未知功能的生物高分子進行功能預測和驗證。該技術(shù)在疾病分型研究(Brindle JT, Antti H, Holmes E, Tranter G, Nicholson JK, Bethell HW, ClarkeSj Schofield PM， McKilligin E， Mosedale DEj Grainger DJ: Rapid and noninvasivediagnosis of the presence and severity of coronary heart disease usingΙΗ-NMR-based metabonomics.Nat Med 2002;8:1439-1444.)、標志物發(fā)現(xiàn)(Sreekumar A，Poisson LMj Rajendiran TM，Khan APj Cao Q，Yu J，Laxman B，Mehra R，Lonigro RJjLi Yj Nyati MKj Ahsan A，Kalyana-Sundaram S，Han B，Cao X，Byun J，Omenn GSjGhosh Dj Pennathur S， Alexander DC, Berger A， Shuster JRj Wei JTj VaramballySj Beecher C， Chinnaiyan AM: Metabolomic profiles delineate potential rolefor sarcosine in prostate cancer progress1n.Nature 2009;457:910-914.)、藥物毒性評價(O’Connell TM，Watkins PB: The applicat1n of metabonomics topredict drug-1nduced liver injury.Clin Pharmacol Ther 2010;88:394-399.；Winnike JHj Li Z，Wright FAj Macdonald JMj O’Connell TM，Watkins PB: Useof pharmaco-metabonomics for early predict1n of acetaminophen-1nducedhepatotoxicity in humans.Clin Pharmacol Ther 2010;88:45-51.)等方面已經(jīng)展不了很好的應(yīng)用前景。代謝組學研究雖剛剛起步，但利用細胞培養(yǎng)系進行代謝組學研究顯示了極好的應(yīng)用前景，因此系統(tǒng)地對多種不同來源的細胞特別是腫瘤細胞進行代謝組學分析，并結(jié)合已有的其他組學信息，無疑將為疾病的(早期)輔助診斷、分型、殘瘤的生物學行為監(jiān)測和發(fā)病機制研究提供必要幫助(Wibom C，Surowiec I，Moren Lj Bergstrom P，Johansson M， Antti H， Bergenheim AT: Metabolomic patterns in gl1blastoma andchanges during rad1therapy: a clinical microdialysis study.J Proteome Res2010;9:2909-2919.)。
[0003]目前常用的細胞代謝組學樣品預處理技術(shù)是首先用緩沖鹽溶液清洗細胞，然后去掉殘留緩沖鹽，加入提取溶劑。目前常用的去掉緩沖鹽的方法有人工甩棄或者用移液槍吸等方法，但是上述方法均不能保證殘留的緩沖鹽量一樣，而且盡可能保證低的殘留或者是無殘留，對定量代謝組學分析十分重要，一方面過度殘留的緩沖鹽在某些質(zhì)譜分析中容易引起離子抑制(Desjardin C，Riviere J, Vaiman A, Morgenthaler C, Diribarne Μ,Zivy M, Robert C， Le ML, Wimel L, Lepage 0, Jacques C, Cribiu E, Schibler L:Omics technologies provide new insights into the molecular phys1pathology ofequine osteochondrosis.BMC Genomics 2014; 15:947.),另一方面殘留量無法保證每盤細胞內(nèi)均--致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對上述問題而提供一種貼壁細胞定量代謝組學分析樣品預處理的方法。該方法主要針對每個培養(yǎng)皿內(nèi)殘留緩沖液不均一問題，采用緩沖液洗滌細胞后，再用96孔板離心機離心去除殘留液體的方法，該方法能使每個培養(yǎng)皿內(nèi)幾乎無液體殘留，便于后續(xù)定量或半定量分析。
[0005]本發(fā)明的一種貼壁細胞定量代謝組學分析樣品預處理的方法技術(shù)方案為，依次包括以下步驟:
①貼壁細胞棄掉培養(yǎng)基后，用緩沖液沖洗培養(yǎng)皿至少三次，直至無明顯培養(yǎng)基顏色；
②將棄掉緩沖液的培養(yǎng)皿置96孔板離心機中離心，去凈殘余水分，
③加入含有內(nèi)標的固定量細胞內(nèi)代謝物提取液作為水相；
④再用細胞刮伊刮下細胞，收集細胞懸液；
⑤加入有機溶劑作為有機相分相后超聲，破碎；
⑥直接或凍干后復溶后進行分析，能夠避免因殘留清洗緩沖液不均一造成的定量誤差。
[0006]步驟①洗滌液是低溫等滲溶液，所述低溫為0-4°C。
[0007]步驟②中利用96孔板離心機離心。
[0008]步驟②中離心條件為2000_3500rpm離心I分鐘。
[0009]步驟③所用細胞提取液是I毫升體積比為1:1的甲醇水溶液。
[0010]步驟⑤所述分相液為氯仿2毫升。
[0011]步驟⑤超聲具體操作為:將細胞懸液全部收集到含有2毫升冷氯仿的15毫升離心管內(nèi)，冰浴條件下超聲3次，每次15秒，功率20-40瓦。
[0012]所述的一種貼壁細胞定量代謝組學分析樣品預處理的方法，具體操作為:貼壁培養(yǎng)細胞首先棄掉培養(yǎng)基，然后以4°C的等滲緩沖鹽洗滌細胞3次，第4次在培養(yǎng)皿內(nèi)加入適量緩沖鹽后，手工傾倒出液體，將培養(yǎng)皿倒扣放置在96孔板離心機轉(zhuǎn)子上，2000-3500rpm離心I分鐘；此時培養(yǎng)皿內(nèi)所有液體幾乎全部清除干凈；再取含有定量內(nèi)標的I毫升體積比為1:1的甲醇水溶液作為水相于培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)標成分可依據(jù)分析目的而定；用細胞刮鏟刮下細胞，收集細胞懸液，將細胞懸液全部收集到含有2毫升冷氯仿作為有機相的15毫升離心管內(nèi)，冰浴條件下超聲3次，每次15秒，功率30瓦；冰上靜置15-30分后，4度10000-HOOOrpm離心10-20分鐘；離心后，取750微升上清液，置于干凈的1.5毫升離心管內(nèi)；下層氯仿層用I毫升注射器小心吸取1.5毫升左右到一干凈離心管內(nèi)，再依據(jù)需要，準確吸取一定量有機相到新的1.5毫升離心管內(nèi)；殘留的中間蛋白層，倒入鋁箔稱量盤，干燥至恒重，用于校正細胞數(shù)目；水相和有機相樣品可以直接進行分析，或者經(jīng)過凍干濃縮復溶后再分別進行水溶性和脂溶性樣品分析。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:該方法主要針對每個培養(yǎng)皿內(nèi)殘留緩沖液不均一問題，采用緩沖液洗滌細胞后，再用9