一條與牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白相結(jié)合的多肽序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，主要涉及牛病毒性腹瀉病毒E2結(jié)合多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea, BVD)是引發(fā)牛病毒性腹瀉的主要 病原。它主要會引起牛腹瀉、持續(xù)性感染以及流產(chǎn)等癥狀，該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛流行， 給養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。BVD屬于黃病毒科瘟病毒屬，為單股正鏈RNA病毒。E2位于BVDV ORF 2077-3198位；該蛋白有374個氨基酸組成，有5個非常保守的糖基化位點。E2是病毒 的結(jié)構(gòu)蛋白，會形成表面突起。在BVDV的結(jié)構(gòu)蛋白中，E2蛋白的免疫原性最強，是BVDV的 最主要抗原性部位，同時也是與抗BVDV抗體的結(jié)合區(qū)域，還能介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)，參與宿 主細胞識別和吸附。
[0003] 噬菌體展示技術(shù)是當前研宄多肽與蛋白質(zhì)作用的一種有效手段。這一技術(shù)將多肽 的編碼序列克隆到噬菌體殼蛋白的合適位置，并且要保證其正確的翻譯序列，也不影響噬 菌體殼蛋白的正常功能，這樣噬菌體表達的殼蛋白結(jié)構(gòu)中將會存在外源多肽的序列；伴隨 著噬菌體子代的重新組裝，外源多肽序列將展示在噬菌體的表面。在一般情況下，外源展示 的多肽具備一定的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，可以與相應(yīng)的靶分子進行結(jié)合。展示肽庫與靶蛋 白分子結(jié)合后，洗去未結(jié)合的噬菌體，然后將與靶分子結(jié)合的噬菌體洗脫下來感染細胞擴 增，經(jīng)過3到6輪的"吸附-洗脫-擴增"，噬菌體與靶分子的結(jié)合特異性將逐步提高；經(jīng)過 多次篩選之后，最終可以篩選到與靶分子相結(jié)合的高親和噬菌體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明借助噬菌體肽庫展示技術(shù)，利用表達純化的牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白進 行多輪篩選，最終得到可特異結(jié)合牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的多肽克隆株，挑選其克隆株 進行序列測定，其多肽序列為KRLREL ;人工合成此多肽進行ELISA結(jié)合實驗，結(jié)果證明，人 工合成的多肽可與牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白有良好的結(jié)合能力。借助本發(fā)明的多肽，可用 于對牛病毒性腹瀉病毒抗原進行定量和定性檢測。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 一條可與牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白結(jié)合的多肽序列為KRLREL。
[0006] 所述多肽序列為線性結(jié)合多肽。
[0007] 所述的多肽序列，包括以所述的多肽序列為核心，任何對此多肽序列的延長和修 飾，修飾材料包括但不局限于納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定蛋白質(zhì)。
[0008] 將所述多肽序列用于牛病毒性腹瀉病毒或者豬瘟病毒的E2蛋白，其中包括但不 局限于酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測。
[0009] 所述的多肽序列在用于對牛病毒性腹瀉病毒抗原進行定量和定性檢測中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的積極有益效果： (1)本發(fā)明借助噬菌體肽庫篩選技術(shù)，利用表達純化的牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白進行 多輪篩選，最終得到可特異結(jié)合牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的多肽克隆株。挑選其克隆株進 行序列測定，其多肽的核心序列為KRLREL ;人工合此多肽進行ELISA結(jié)合實驗，結(jié)果證明， 此人工合成的多肽可與牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白很好結(jié)合。本發(fā)明多肽與E2蛋白的親和 力常數(shù)可達3· 26X 109L/mol，親和力較好。
[0011] (2)由于病毒難以純化，因此針對病毒的抗體獲得非常不易，本發(fā)明設(shè)計合成的多 肽很好地規(guī)避了這一難題，可用人工合成方法快速取得，檢測成本也非常低廉。
[0012] (3)本發(fā)明的人工合成多肽與人工接種BVD、人工表達BVD E2蛋白均可以結(jié)合，而 且與其它病毒蛋白均不反應(yīng)，特異性較高。
[0013] (4)本方法較人工表達蛋白再進行免疫獲得蛋白抗體的過程簡便，更易操作；通過 對多肽進行標記，可快速地對牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白進行定性和定量檢測。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :利用多肽測定培養(yǎng)牛病毒性腹瀉病毒、表達蛋白的結(jié)果。
[0015] 圖中橫坐標上，1為牛病毒性腹瀉病毒接種MDBK細胞，2為表達牛病毒性腹瀉病毒 E2蛋白，3為MDBK細胞對照；縱坐標為OD值。
[0016] 圖2 :利用本發(fā)明的多肽與其它病毒交叉反應(yīng)的結(jié)果。
[0017] 圖中橫坐標為不同包被ELISA板細胞培養(yǎng)物的不同待檢病毒；縱坐標為OD值。
【具體實施方式】
[0018] 實例1噬菌體隨機肽庫的篩選 用純化表達的BVD E2蛋白包被聚氯乙烯板，每孔100 μ 1(100 μ I /ml)包被，置于4°C 條件下過夜，用PBST洗滌后再用5%的BSA液封閉。
[0019] 將稀釋后的噬菌體肽庫100 μ 1加入到相應(yīng)的孔中，室溫條件下孵肓2h，用TBST液 沖洗8-10次，每孔加入洗脫液200 μ 1，室溫條件下振蕩5-8min，吸出洗脫液并中和至中性。
[0020] 中和后的洗脫液可以用于滴度測定和下一輪培養(yǎng)；將LB培養(yǎng)后的噬菌體進行離 心收集，用于下一輪的篩選。
[0021] 不同篩選輪次的噬菌體富集鑒定見表1，洗脫液的滴度測定結(jié)果見表2。
[0022] 實例2篩選多肽的鑒定 (1)將接種的牛病毒性腹瀉病毒的MDBK細胞培養(yǎng)液進行超聲破碎，然后以2 μ g/ml (蛋 白量計）進行ELISA板包被；以同樣方式將人工表達的牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白和未接種 病毒的MDBK做對照進行包被。在進行特異性試驗時，將不同病毒蛋白進行包被。
[0023] (2)將人工合成的多肽KRLREL偶聯(lián)辣根過氧化物酶，以100ng/ml的量，每孔加入 到上述ELISA板中50μ1，震蕩器上混勻，37°C條件下避光孵育30min ; (3) 用酶標板洗板機洗6次，或手工甩掉酶標板孔中的液體，用稀釋后的緩沖液加滿各 孔，再甩干，如此重復(fù)洗滌6次； (4) 根據(jù)所需用量將TMB液加入到相應(yīng)的微孔中，每孔加100 μ 1，在酶標板震蕩器上震 蕩30秒，室溫（23±3°C) 10分鐘充分顯色； (5) 每孔加入50 μ I 2M的硫酸液終止反應(yīng)，在酶標板震蕩器上震蕩30秒，然后用酶標 儀讀取各孔在450納米處的吸光值，判定結(jié)果。
[0024] 結(jié)果表明，人工合成多肽與人工接種BVD、人工表達BVD E2蛋白均可以結(jié)合(見圖 1)，除與豬瘟病毒的交叉反應(yīng)比較高外，與其它病毒蛋白均不反應(yīng)，其特異性較高(見圖2)。
[0025] 表1每輪親和篩選中噬菌體的量
【主權(quán)項】
1. 一條可與牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白結(jié)合的多肽序列，其特征是，所述多肽序列為 KRLREL〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽序列，其特征是，所述多肽序列為線性結(jié)合多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽序列，其特征是，其中包括以所述的多肽序列為核心， 任何對此多肽序列的延長和修飾，修飾材料包括但不局限于納米材料、熒光材料、酶類、生 物素及特定蛋白質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽序列，其特征是，將所述多肽序列用于牛病毒性腹瀉病 毒或者豬瘟病毒的E2蛋白，其中包括但不局限于酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的多肽序列在用于對牛病毒性腹瀉病毒抗原進行定 量和定性檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及牛病毒性腹瀉病毒E2結(jié)合多肽及其應(yīng)用，該多肽序列為KRLREL，是一種線性結(jié)合多肽，以多肽序列為核心，可以對此多肽序列的延長和修飾，修飾材料包括但不局限于納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定蛋白質(zhì)。本發(fā)明借助噬菌體肽庫篩選技術(shù)，利用表達純化的牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白進行多輪篩選，最終得到可特異結(jié)合牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的多肽克隆株；挑選其克隆株進行序列測定，其多肽的核心序列為KRLREL；人工合此多肽進行ELISA結(jié)合實驗，結(jié)果證明，此合成多肽能與牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白很好的結(jié)合；本發(fā)明較人工表達蛋白再進行免疫獲得蛋白抗體的過程簡便，更易操作；通過對多肽進行標記，可快速地生產(chǎn)試劑盒或試紙條（卡）對牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白進行定量和定性檢測。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104597256
【申請?zhí)枴緾N201510078014
【發(fā)明人】王方雨, 鄧瑞廣, 邢廣旭, 羅俊, 胡驍飛, 趙東, 余秋穎
【申請人】河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月14日