一種基于Mo Hsp70蛋白的間接ELISA試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是一種基于Mo Hsp70蛋白的間接ELISA試劑盒及使用方法。
【背景技術】
[0002]綿羊肺炎支原體ovipneumoniae, Mo)是引起山羊和綿羊間質(zhì)性肺炎(非典型肺炎)的病原體，可致山羊及綿羊發(fā)生咳嗽、流鼻涕、漸進性消瘦和增生性間質(zhì)性肺炎癥狀(張雙翔等，2013 ;冉雙存，2010 ;韓笑，2013)。Mo于1963年首次由Mackay等從蘇格蘭發(fā)病綿羊病肺組織中分離到病原后(Mackay等，1963)，西班牙、澳大利亞、新西蘭、匈牙利、冰島、英國、非洲許多國家相繼報道Mo引起綿羊和山羊疾病的發(fā)生(許健等，2012)。我國自1978年從新西蘭引進種羊中首次發(fā)現(xiàn)該病原后(胡景邵等，1982)，又相繼在甘肅、寧夏、云南、貴州等多個省份有相關報道(張雙翔等，2013 ;陸承平，2008 ；Falah M等，1997 ；Yang F等，2011)，對養(yǎng)羊業(yè)的危害日趨嚴重。
[0003]對綿羊肺炎支原體的防控，目前主要依靠藥物預防，尚缺乏可靠的疫苗，究其原因與Mo分離培養(yǎng)費時費力及基因組研究緩慢有關(候相山等，2006 ;趙萍等，2008)。且目前缺乏疫病檢測與防控所需的快速血清學檢測手段，尤其可高通量檢測、敏感性高的ELISA方法。Hsp70是支原體中具有高度保守性的生物大分子，由于它的免疫原性以及免疫佐劑效應而受到廣泛關注(Falah M等，1997 ;張建華等，2011 ;李嬡等，2008 ；Li M等，2011)。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70 一般結構包含兩個區(qū)域，分別是主要作用在于分子伴侶作用的N端，以及主要表現(xiàn)為免疫原和免疫佐劑作用的C端，可選擇作為核酸疫苗研究及檢測技術建立的目標蛋白(喬祖建等，2008 ;劉茂軍等，2011)。而Hsp70蛋白較大(65~70Ku)，全基因表達易形成包涵體，影響表達效率，選用其相對穩(wěn)定C末端基因可有效檢測該蛋白的抗原性等特征(劉茂軍等，2011 ;孫悅等，2013)?；谏鲜鰡栴}，本研究構建包含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表達載體，并建立基于表達產(chǎn)物Mo Hsp70蛋白的間接ELISA方法。為本病的早期檢測、疫苗免疫效果評價及相關研究工作提供關鍵技術，對本病原所致疫病的早發(fā)現(xiàn)早防控具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是:提供一種基于綿羊肺炎支原體Hsp70蛋白的間接ELISA試劑盒及其使用方法，它為Mo引起的山羊和綿羊間質(zhì)性肺炎疫病的早期監(jiān)測、免疫效果評價提供關鍵技術，對本病原所致疫病的早發(fā)現(xiàn)早防控具有重要意義。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:基于綿羊肺炎支原體Hsp70蛋白的間接ELISA試劑盒,包被酶標板2個，Mo標準陽性血清ImL、Mo標準陰性血清lmL、酶標二抗300-500 μ L、50 X PBST緩沖液20-25mL、底物液A10mL_15mL、底物液B10mL_15mL和終止液10mL_15mL ;所述的包被酶標板為重組蛋白包被，重組蛋白為Mo Hsp70基因通過大腸桿菌Rosseta (DE3)表達系統(tǒng)獲得Hsp70重組蛋白，并通過鎳柱法進行重組蛋白純化，使用包被緩沖液稀釋為1.0μ g/100μ L ~2.5 μ g /100 μ L。
[0006]所述酶標二抗為兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀釋使用。
[0007]所述50XPBST 緩沖液的制備是:NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH2PO4 10.0 g、Na2HPO4.12H20 145 g, Tween-20 25 mL 溶于 400 mL 蒸餾水，調(diào)整 pH 為 7.2 ?7.6，定容至1000 mL。
[0008]Mo標準陽性血清為自制高免血清，使用時按1:5稀釋；所述的Mo標準陰性血清自制，使用時按1:5稀釋。
[0009]所述封閉緩沖液為:脫脂奶粉0.3?0.7 g溶于100 mL PBST緩沖液。
[0010]所述底物液A的制備是:將磷酸氫鈉14.60 g、檸檬酸9.33 g及過氧化氫脲0.52g，溶于三蒸水中，并定容至1000 mL,調(diào)至P H 5.0?5.4。
[0011]所述底物液B的制備是:將TMB 20mg中加入無水乙醇10 mL，再加雙蒸水至1000mL,過濾除菌,無菌分裝。
[0012]所述終止液為0.2 %?0.3% HF溶液。
[0013]所述的間接ELISA試劑盒的使用方法，它包括以下使用步驟:
1)以l.0yg/100 yL?2.5yg /100 μ L重組Mo Hsp70蛋白包被酶標板，室溫過夜后，應用PBST洗滌ELISA反應板5次；
2)以0.3g/100mL?0.7g/100mL的脫脂奶粉溶液封閉ELISA反應板，37°C，封閉lh_3h后，應用PBST洗滌ELISA反應板5次；4°C保存?zhèn)溆茫?br> 3)將陰、陽性對照血清及待檢血清做1: 5倍稀釋，按100 μ L加入酶標板反應孔中，37°C孵育Ih后，應用PBS洗滌ELISA酶標板各反應孔5次；
4)將兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀釋，按100μ L加入酶標板反應孔，37°C作用Ih后，應用PBST洗滌酶標板反應孔5次；
5)將底物液A和B各50μ L加入ELISA反應板，避光室溫顯色10~15min，加入50 μ L終止液，立即在酶標儀630nm波長下讀取OD值。
[0014]6)試驗成立條件為陽性血清0D630平均值彡1.25，陰性血清0D630平均值< 0.35 ;試驗結果判定標準為待檢樣本OD63tl值> 0.588為陽性，待檢樣本OD 63(|值< 0.588為陰性。
[0015]本發(fā)明選取核苷酸同源性較高的Mo貴州分離株株，通過Mo Hsp70基因原核表達載體的構建與表達，建立基于表達產(chǎn)物Mo Hsp70蛋白的間接ELISA方法，并進行條件優(yōu)化，以便制備成商品化間接ELISA試劑盒。本發(fā)明適用于檢測羊血清Mo Hsp70蛋白抗體,能夠體現(xiàn)機體內(nèi)Mo感染水平或疫苗免疫水平，將為Mo引起的山羊和綿羊間質(zhì)性肺炎疫病的早期監(jiān)測、免疫效果評價及后續(xù)研究工作提供關鍵技術，對本病原所致疫病的早發(fā)現(xiàn)早防控具有重要意義，改變本病防控監(jiān)測缺乏商品化ELISA試劑盒的局面。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相t匕，具有以下的技術優(yōu)勢和積極效果:
(I)效果好:Hsp70抗體水平能夠較好的體現(xiàn)機體Mo感染水平或疫苗免疫水平；本試劑盒相對于全菌蛋白包被其敏感性、特異性更高，為Mo引起的山羊和綿羊間質(zhì)性肺炎的早期監(jiān)測、疫苗免疫效果評價具有重要意義。
[0016](2)制備簡單:本試劑盒相對于全菌蛋白包被，解決了 Mo培養(yǎng)困難、培養(yǎng)周期長等問題，僅需對構建原核表達重組蛋白進行大批量生產(chǎn)、純化，具有產(chǎn)量高、制備簡單的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的Mo Hsp70蛋白的間接ELISA試劑盒制備生產(chǎn)流程圖。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明的實施例:
基于Mo Hsp70蛋白的間接ELISA試劑盒原料及配方為:
Mo標準陽性和標準陰性血清；重組蛋白為Mo Hsp70基因通過大腸桿菌Rosseta(DE3)表達系統(tǒng)獲得Hsp70蛋白，并通過鎳柱法進行重組蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE分析后得到純化目的蛋白，使用包被緩沖液稀釋為1.0μ g /100 μ L ;包被緩沖液=Na2CO3 1.59g、NaHCO3
2.93g溶于去離子水中，定容至100mL,調(diào)至p H 9.5?9.8 ;酶標二抗:兔抗羊IgG-HRP ；IXPBST緩沖液:NaCl 8.0g,KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g,Tween-20 0.5mL溶于800mL