述離心管中加入IOmL 50mM PBS緩沖液（ρΗ7· 4)，超聲混勻，加入0· 2mg CIZl-V多克隆抗體，37°C 16rpm旋轉(zhuǎn)2h，使抗體和膠乳進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；
[0044] (6)在上述離心管中加入0· ImL終止液（1M甘氨酸+10% BSA)，37°C 16rpm旋轉(zhuǎn) lh,進(jìn)行終止反應(yīng)；
[0045] (7) HOOOrpm 離心 25min，去上清；
[0046] (8)在上述離心管中加入試劑30mM ρΗ7· 4的H印es或DIPSO緩沖液，防腐劑0· 1% NaN3，電解質(zhì) 0. 01% NaCl，穩(wěn)定劑 0. 01% EDTANaJP 0. 09% BSA ;超聲混勻；HOOOrpm 離心 20min,去上清；
[0047] (9)在上述離心管中加入IOmL DIPSO緩沖液，防腐劑0· 1% NaN3，電解質(zhì)0· 01% NaCl，穩(wěn)定劑0. 01% EDTANajP 0. 09% BSA，超聲混勻后得到的即為試劑R2,4°C保存。
[0048] 復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液：在50mM PBS緩沖液（pH7. 4)中加入偶聯(lián)至卵白 蛋白（OVA)載體蛋白的合成CIZl-V第14、15號(hào)外顯子基因表達(dá)的突變片段多肽序列 ⑶EDEEEIEVRSRDISR，作為復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度分別為0 μ g/mL、0. 50 μ g/mL、 I. 00 μ g/mL、2. 00 μ g/mL、4. 00 μ g/mL、8. 00 μ g/mL。并且以此為定標(biāo)，進(jìn)行樣品相對(duì)定量檢 測(cè)。
[0049] 實(shí)施例2復(fù)制蛋白變體膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒的檢測(cè)步驟以及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
[0050] 檢測(cè)波長：600nm ;
[0051] 樣品量：8μ L ;R1 :250μ L ;R2 :75μ L ;R1 和 R2 組成同實(shí)施例 1。
[0052] 以日立7080生化分析儀為例，首先加入R1，37°C孵育30s，之后加入標(biāo)準(zhǔn)品（待測(cè) 樣本），孵育5min，再加入R2,測(cè)定反應(yīng)第IOs和5min的吸光度值（分別為Ap A2)，計(jì)算吸 光度差值OD6qq= A2-A1;
[0053] 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差值00_為縱坐標(biāo)繪制檢測(cè)濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程得校準(zhǔn)曲線，見圖1 ;
[0054] 計(jì)算方法：將測(cè)得的待測(cè)樣本吸光度差值OD6c?代入回歸方程即可計(jì)算出待測(cè)樣 品中的復(fù)制蛋白變體濃度。
[0055] 實(shí)施例3檢測(cè)樣本準(zhǔn)備：
[0056] I. CIZl-V表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及融合蛋白表達(dá)純化：
[0057] 根據(jù)CIZl-V第14、15號(hào)外顯子基因序列信息設(shè)計(jì)PCR引物：
[0058] CIZl-V-pet-F :5, ~CCGGAATTCCATCATCATCACCATCATCTG~3, (SEQ ID NO. 3)，
[0059] CIZl-V-pet-R :5，-CCCAAGCTT CTCGAGTTAATATGCGGTATTCGGGC-3' (SEQ ID NO. 4)，
[0060] 其中，酶切位點(diǎn)標(biāo)下劃線。以合成CIZl-V第14、15號(hào)外顯子基因表達(dá)的突變片段 多肽序列 CDEDEEEIEVRSRDISR 的核苷酸 TGTGATGAGGATGAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGATA TATCCAGA(SEQ ID NO. 2)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min ;按如下參數(shù) 循環(huán)30次：94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s ;最后72°C再延伸lOmin。PCR反應(yīng) 產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增目的基因后，凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物， 膠回收目的基因，表達(dá)載體PGEX-2T分別用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切后與目的基因進(jìn) 行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5 α，對(duì)目的基因進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與CIZl-V 第14、15號(hào)外顯子序列在NCBI上進(jìn)行N-BLAST序列比對(duì)分析。
[0061] 提取序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ε. coli BL21(DE3)。將含有表達(dá)質(zhì)粒的單菌落接 種于含氨芐霉素（100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基（IL)中，IPTG(ImmoVL) 37°C誘導(dǎo)表達(dá)4h后， 8000rpm離心15min，去上清，加入50mL PB裂解液，4°C裂解0. 5h，冰浴條件下超聲（30s， 30s，10min)后-20°C保存。
[0062] 取超聲后樣品IlOOOrpm離心15min，采用GST親和純化方法純化上清（過柱法）， 用還原性谷氨酸溶液洗雜蛋白，PBS (pH7. 4)緩沖液洗目的蛋白，分別取10 μ L過柱前上清、 過柱后上清以及所得目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，見圖2。
[0063] 共得到目的蛋白溶液4mL，以Protein Assay為染料測(cè)定595nm處OD值繪制BSA 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)純化所得目的蛋白OD595值以及標(biāo)曲所得回歸方程計(jì)算蛋白濃度為 0· 636mg/mL。
[0064] 2.將表達(dá)純化所得的CIZl-V目的蛋白用PBS緩沖液稀釋，使其終濃度分別為 1 μ g/mL、2 μ g/mL、4l·! g/mL、8 μ g/mL，用作本發(fā)明試劑盒鑒定準(zhǔn)確度、精密度以及和Elisa 方法檢測(cè)結(jié)果比較的樣本。
[0065] 3.取適量超聲破碎后的CIZl-V表達(dá)菌的PB裂解液（共50mL)，稀釋200倍，相當(dāng) 于表達(dá)菌液的原體積，同樣方法處理未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液樣本作為陰性對(duì)照，均用作本發(fā)明 試劑盒初步應(yīng)用的檢測(cè)樣本。
[0066] 實(shí)施例4,復(fù)制蛋白變體膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒組分的篩選
[0067] 將制備好的Rl和R2以日立7080生化分析儀為例進(jìn)行試劑盒組分的篩選，首先加 入Rl，37°C孵育30s，之后加入標(biāo)準(zhǔn)品（待測(cè)樣本），孵育5min，再加入R2,測(cè)定反應(yīng)第IOs 和5min的吸光度值（分別為Ap A2)，計(jì)算吸光度差值OD6qq= A 2-Alt)
[0068] 不同粒徑的膠乳檢測(cè)的吸光度差值見圖3,從線性關(guān)系優(yōu)選0. 13 μ m的膠乳制備 的R2。
[0069] 在其它條件相同時(shí)，優(yōu)選0. 13 μ m的膠乳制備的R2,在不同膠乳濃度情況下進(jìn)行 同上檢測(cè)，結(jié)果見圖4,優(yōu)選0. 2%濃度的膠乳配制成R2在檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系最好。
[0070] 確定R2中膠乳的濃度后，進(jìn)行最適檢測(cè)波長，結(jié)果見圖5所示，在其它條件相同 時(shí)，在500-600nm之間選擇4個(gè)常用波長進(jìn)行檢測(cè)，波長越大區(qū)分度越大，線性關(guān)系沒有太 大區(qū)別，相對(duì)來說在檢測(cè)范圍內(nèi)600nm處的線性關(guān)系最好，故選擇該波長進(jìn)行試劑盒的檢 測(cè)。
[0071] 實(shí)施例5復(fù)制蛋白變體膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒性能檢測(cè)
[0072] 本實(shí)施例基于實(shí)施例4優(yōu)化的檢測(cè)條件考察試劑盒性能
[0073] 統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤（[土SE),用SPSS 19. 0軟件進(jìn)行單因素 獨(dú)立T檢測(cè)分析，P < 0. 05判定為差異顯著，P > 0. 05判定為差異不顯著。
[0074] 1.靈敏度檢測(cè)：
[0075] 用本發(fā)明試劑盒測(cè)定20個(gè)不同批次的空白標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算OD6tltl值的平均值? )和 標(biāo)準(zhǔn)差（s)，靈敏度（LOD) =[-2s,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的濃度即為試劑盒理論上 的檢測(cè)限。如下表1所示，將計(jì)算得靈敏度代入校準(zhǔn)曲線可計(jì)算出本發(fā)明試劑盒理論上的 檢測(cè)限為0. 11 μ g/mL，考慮到操作誤差，試劑盒檢測(cè)限確定為0. 20 μ g/mL。
[0076] 表1本發(fā)明試劑盒靈敏度檢測(cè)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)人復(fù)制蛋白變體含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒，其特征在于該試劑盒包 括試劑R1、試劑R2和復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中 ： 所述試劑R1包含電解質(zhì)、促凝劑、防腐劑及緩沖液； 所述試劑R2包含抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體包被的膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、 防腐劑及緩沖液； 所述復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品溶液為含有不同濃度復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品的緩沖液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體 選自兔、羊、雞的免疫球蛋白，優(yōu)選兔抗，經(jīng)人復(fù)制蛋白變體免疫、親和層析純化獲得的免疫 球蛋白；進(jìn)一步優(yōu)選合成如SEQ ID NO. 1所示的CIZ1-V第14、15號(hào)外顯子基因表達(dá)的突變 片段多肽，將合成的多肽偶聯(lián)至血藍(lán)蛋白載體蛋白上制備抗原并免疫兔、羊、雞、再經(jīng)親和 層析純化獲得的免疫球蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的膠乳顆粒為直徑范圍 0. 05-0. 20 iim的聚苯乙烯膠乳顆粒，試劑R2中膠乳顆粒濃度為0. 1% -0. 8%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的膠乳顆粒為直徑0. 13 y m的聚苯 乙烯膠乳顆粒，試劑R2中膠乳顆粒濃度為0. 2 %。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體包被 膠乳顆粒是通過化學(xué)交聯(lián)劑在交聯(lián)緩沖液中進(jìn)行的，所用化學(xué)交聯(lián)劑為碳化二亞胺（EDAC) 和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，交聯(lián)緩沖液選自PBS緩沖液、Ifepes緩沖液、MES緩沖液、 Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、醋酸緩沖液或DIPSO緩沖液，pH在6. 0-8. 0之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑R1中所述促凝劑選自濃度范圍為 2. 0% -3. 5%的 PEG6000、PEG8000、PEG12000,優(yōu)選 2. 5%的 PEG6000 或不同 PEG 的混合體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑R1中所述的電解質(zhì)選自氯化鈉、氯 化鉀、氯化鎂，濃度為0. 01%-1. 5%;試劑R2中所述的電解質(zhì)選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂， 濃度為〇? 01% -1%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑R1和R2中所述的防腐劑選自疊 氮鈉，濃度為〇. 05% -0. 1% ;所述的緩沖液選自PBS緩沖液、Ifepes緩沖液、MES緩沖液、 Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、醋酸緩沖液或DIPSO緩沖液中的一種，緩沖液濃度在 20-200mM 之間。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑R2中所述的穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋 白和 EDTANa2，濃度為 0? 1% -1. 0%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品通過以下 方法制備：合成如SEQ ID NO. 1所示的CIZ1-V第14、15號(hào)外顯子基因表達(dá)的突變片段多 肽，將合成的多肽偶聯(lián)至卵白蛋白（OVA)載體蛋白得到復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)人復(fù)制蛋白變體含量的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑盒。該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和復(fù)制蛋白變體標(biāo)準(zhǔn)品，其中試劑R1包含電解質(zhì)、促凝劑、防腐劑及緩沖液；試劑R2包含抗人復(fù)制蛋白變體的多克隆抗體包被的膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、防腐劑及緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度復(fù)制蛋白變體的適當(dāng)緩沖液。本試劑盒特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，操作快速簡便，可用于各種生化分析儀。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號(hào)】CN104597250
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510031194
【發(fā)明人】徐根興, 曹婭, 華子春, 李明
【申請(qǐng)人】南京吉瑞康生物科技有限公司, 南京大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月21日