有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):主要由激光器系統(tǒng)、光束傳輸和控制相關(guān)光電元器件、光學(xué)顯微鏡和微弱信號(hào)光電探測(cè)器件等組成，兩路的光束可以實(shí)現(xiàn)受激耗損超越衍射極限的工作模式，如果只選擇下方一束光路，則為雙光子成像工作模式，不僅可以在活細(xì)胞上開(kāi)展相關(guān)研宄，也可以拓展應(yīng)用到活體小動(dòng)物或離體組織的高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像。
[0013]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的闡述。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的原理示意圖。
[0015]圖中標(biāo)記:1_激光器系統(tǒng)，2-光開(kāi)關(guān)，3-第一 1/2玻片，4-偏振分光片，5_脈沖展寬部件，6-第一反射鏡，7-時(shí)間延遲單元，8-第二反射鏡，9-第二 1/2玻片，10-偏振片，
11-第三反射鏡，12-會(huì)聚透鏡，13-光學(xué)參量振蕩器，14-第四反射鏡，15-單模保偏光纖，
16-陷波濾光片，17-低倍率物鏡，18-第五反射鏡，19-渦旋相位板，20-第一二色鏡，21-第六反射鏡，22-第三1/2玻片，23-1/4玻片，24-樣品臺(tái)，25-成像物鏡，26-激光掃描單元，27-第二二色鏡，28-路由器，29-第一帶通濾光片，30-第二帶通濾光片，31-第一光電探測(cè)器，32-第二光電探測(cè)器，33-時(shí)間相關(guān)光子計(jì)數(shù)器，34-數(shù)據(jù)采集與分析設(shè)備，35-第三二色鏡，36-第三帶通濾光片，37-光電倍增管。
【具體實(shí)施方式】
[0016]如圖1所示，一種高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像裝置，包括:
一激光器系統(tǒng)1，用來(lái)產(chǎn)生和發(fā)射一束或兩束的激光光束；
一光束傳輸和控制相關(guān)光電元器件，其包含第一光路光電元器件、第二光路光電元器件以及兩光路耦合傳輸光電元器件組成，所述第一光路光電元器件用來(lái)傳輸和控制第一光路的激光光束，所述第二光路光電元器件用來(lái)傳輸和控制第二光路的激光光束，所述兩光路親合傳輸光電元器件用來(lái)親合和傳輸兩路的激光光束；
一光學(xué)顯微鏡，利用一路或耦合后的兩路激光光束照射樣品、檢測(cè)與成像；以及一微弱信號(hào)光電探測(cè)器件，用來(lái)對(duì)圖像中預(yù)定區(qū)域?qū)崿F(xiàn)單通道或雙通道的時(shí)間相關(guān)光譜計(jì)數(shù)與檢測(cè)。
[0017]在本實(shí)施例中，所述第一光路光電元器件包括沿第一光路傳輸方向依次設(shè)置的光開(kāi)關(guān)2、第一 1/2玻片3、偏振分光片4、脈沖展寬部件5、第一反射鏡6、時(shí)間延遲單元7、第二反射鏡8、第二 1/2玻片9、偏振片10、第三反射鏡11、會(huì)聚透鏡12、單模保偏光纖15、低倍率物鏡17、第五反射鏡18以及渦旋相位板19。
[0018]在本實(shí)施例中，所述第二光路光電元器件包括沿第二光路傳輸方向依次設(shè)置的光學(xué)參量振蕩器13、第四反射鏡14以及陷波濾光片16。
[0019]在本實(shí)施例中，所述兩光路親合傳輸光電元器件包括沿兩光路親合傳輸方向依次設(shè)置的第一二色鏡20、第六反射鏡21、第三1/2玻片22、1/4玻片23以及第二二色鏡27，所述第一光路的激光光束經(jīng)第一二色鏡20透射至第六反射鏡21，所述第二光路的激光光束經(jīng)第一二色鏡20反射至第六反射鏡21。
[0020]在本實(shí)施例中，所述光學(xué)顯微鏡由樣品臺(tái)24、成像物鏡25、激光掃描單元26、第三二色鏡35、第三帶通濾光片36以及光電倍增管37 (PMT)組成，所述第二二色鏡27反射出的激光光束進(jìn)入激光掃描單元26，并經(jīng)第三二色鏡35反射后，通過(guò)成像物鏡25照射在樣品臺(tái)24上面的樣品上；所述樣品上出射的后向雙光子熒光信號(hào)返回通過(guò)成像物鏡25，并經(jīng)第三二色鏡35透射后，通過(guò)第三帶通濾光片36被光電倍增管37所檢測(cè)成像。
[0021]在本實(shí)施例中，所述微弱信號(hào)光電探測(cè)器件包括路由器28、第一帶通濾光片29、第二帶通濾光片30、第一光電探測(cè)器31 (APD)、第二光電探測(cè)器32、時(shí)間相關(guān)光子計(jì)數(shù)器33以及數(shù)據(jù)采集與分析設(shè)備34，所述第一帶通濾光片29和第一光電探測(cè)器31組成了第一通道，所述第二帶通濾光片30和第二光電探測(cè)器32組成了第二通道，所述第一通道和第二通道在單通道信號(hào)時(shí)擇一工作、在雙通道信號(hào)時(shí)同時(shí)工作。
[0022]請(qǐng)參照?qǐng)D1，一種高時(shí)空分辨光學(xué)檢測(cè)與顯微成像方法，包括以下兩種工作模式:
(1)單光束的雙光子成像工作模式:當(dāng)上方光束的光開(kāi)關(guān)2處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)，激光器系統(tǒng)I僅出射下方一束超短脈沖(fs)激光，激光光束經(jīng)過(guò)光學(xué)參量振蕩器13實(shí)現(xiàn)波長(zhǎng)的調(diào)節(jié)與控制后，接著依次經(jīng)過(guò)第四反射鏡14、陷波濾光片16、第一二色鏡20、第六反射鏡21、第三1/2玻片22、1/4玻片23和第二二色鏡27，然后反射進(jìn)入光學(xué)顯微鏡的激光掃描單元26，并經(jīng)第三二色鏡35反射通過(guò)成像物鏡25，最后照射在樣品臺(tái)24上面的樣品上；樣品上出射的后向雙光子熒光信號(hào)返回經(jīng)過(guò)成像物鏡25，并經(jīng)第三二色鏡35透射通過(guò)第三帶通濾光片36，最后被光電倍增管37所檢測(cè)，從而獲得樣品中相關(guān)物質(zhì)(取決于熒光染料或樣品的自體熒光色團(tuán))的高分辨雙光子熒光圖像(此時(shí)橫向的空間分辨率大約為200nm);選擇熒光圖像中的預(yù)定區(qū)域(200nm的空間微區(qū))，對(duì)此區(qū)域中的預(yù)定分子(蛋白質(zhì)分子或脂分子等)進(jìn)行標(biāo)記，并讓激光掃描單元26的工作方式為點(diǎn)掃描，此時(shí)區(qū)域中被標(biāo)記的預(yù)定分子的快速動(dòng)力學(xué)過(guò)程包括相互作用過(guò)程的相關(guān)信號(hào)依次經(jīng)過(guò)成像物鏡25、第三二色鏡35、激光掃描單元26、第二二色鏡27、路由器28、第一帶通濾光片29和/或第二帶通濾光片30、第一光電探測(cè)器31和/或第二光電探測(cè)器32以及時(shí)間相關(guān)光子計(jì)數(shù)器33，最后到達(dá)數(shù)據(jù)采集與分析設(shè)備34，從而實(shí)現(xiàn)高空間分辨預(yù)定區(qū)域相關(guān)生物信息的快速獲取與檢測(cè)；
(2)雙光束的超越衍射極限工作模式:當(dāng)光開(kāi)關(guān)2處于打開(kāi)狀態(tài)時(shí)，激光系統(tǒng)出射上下兩束超短脈沖(fs)激光，其中第一激光光束(上方光束)依次經(jīng)過(guò)第一 1/2玻片3和偏振分光片4實(shí)現(xiàn)功率調(diào)節(jié)，接著經(jīng)過(guò)脈沖展寬部件5展寬為ps激光，再依次經(jīng)過(guò)第一反射鏡6、時(shí)間延遲單元7 (調(diào)節(jié)與第二激光光束的時(shí)間同步)、第二反射鏡8、第二 1/2玻片9、偏振片10 (光束線偏振調(diào)節(jié))、第三反射鏡11、會(huì)聚透鏡12 (將光束會(huì)聚進(jìn)入光纖)、單模保偏光纖15、低倍率物鏡17 (光纖出射的光線為平行光)、第五反射鏡18和渦旋相位板19后，獲得預(yù)定光強(qiáng)分布的圓偏振光；而第二激光光束(下方光束)經(jīng)過(guò)光學(xué)參量振蕩器13實(shí)現(xiàn)波長(zhǎng)的調(diào)節(jié)與控制后，接著依次經(jīng)過(guò)第四反射鏡14和陷波濾光片16 ;兩激光光束在第一二色鏡20上進(jìn)行時(shí)間和空間上的同步耦合，并依次經(jīng)過(guò)第六反射鏡21、第三1/2玻片22、1/4玻片23和第二二色鏡27，然后反射進(jìn)入光學(xué)顯微鏡的激光掃描單元26，并經(jīng)第三二色鏡35反射通過(guò)成像物鏡25，最后照射在樣品臺(tái)24上面的樣品上；樣品上出射的后向超越衍射極限的熒光信號(hào)(此信號(hào)的空間分辨率可以達(dá)到30-100nm之間，且可以通過(guò)調(diào)節(jié)上方光束的激光功率，對(duì)空間分辨率進(jìn)行調(diào)節(jié))，返回經(jīng)過(guò)成像物鏡25，并經(jīng)第三二色鏡35透射通過(guò)第三帶通濾光片36，最后被光電倍增管37所檢測(cè)，從而獲得樣品中相關(guān)物質(zhì)(取決于熒光染料或樣品的自體熒光色團(tuán))的高分辨雙光子熒光圖像(此