專利名稱：一種適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光學顯微內(nèi)窺成像技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種適用于胰管成像的高分辨 光學內(nèi)窺系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率在國內(nèi)外均呈上升趨勢，2000年上海市 胰腺癌的標化發(fā)病率和死亡率已達到6. 0/10萬和5. 5/10萬。極早期(直徑< 1. Ocm)的 胰腺癌患者接受根治性手術(shù)治療后，5年生存率可接近80%。然而，臨床確診的胰腺癌患 者90%以上已屬中晚期，根治性手術(shù)切除率僅為10-20%，即使進行了根治性切除的病人， 5年生存率也低于20%。因此，發(fā)展有效的早期診斷和檢測技術(shù)是提高胰腺癌治療水平的 關(guān)鍵。臨床上常用的胰腺癌早期診斷技術(shù)，如計算機斷層成像(CT)、逆行胰膽管造影 (ERCP)、超聲成像(US)、正電子發(fā)射計算機斷層顯像(PET)等，由于受到分辨率的限制， 不能檢測到直徑小于Icm的腫瘤。近年來，光學技術(shù)由于其極高的分辨率、靈敏度、精確 度以及無損、安全、快速等優(yōu)點而逐漸被應(yīng)用于胰腺癌成像，如光學相干層析成像(OCT) 和熒光光譜等。2005年P(guān)ier Alberto Testoni等人首次將OCT用于區(qū)分正常和病變 白勺畠 # 入月夷 1/1只(Testoni, P. Α. ， B. Mangiavillano, L. Albarello, et al. ， Optical coherence tomography to detectepitheIial lesions of themain pancreatic duct :An ex vivo study. American Journal ofGastroenterology,2005.100(12) :p. 2777-2783.), 之后將其與ERCP相結(jié)合用于在體的管道內(nèi)OCT成像(Testoni，P. Α.，A. Mariani, B. Mangiavillano, et al. , Preliminary data on the use of intraductaloptical coherence tomography during ERCP for investigating mainpancreatic duct strictures. Gut, 2006. 55(11) :p. 1680-1681.)，并對其診斷能力進行 了評估(Testoni， P. Α. , Α.Mariani, B.Mangiavillano, et al. , Intraductal optical coherence tomography for investigatingmain pancreatic duct strictures. American Journal ofGastroenterology, 2007. 102(2) :p. 269-274.)。目前 OCT 的分辨率可達到 ERCP 等傳 統(tǒng)診斷技術(shù)的10倍以上，但是該方法只能反應(yīng)組織結(jié)構(gòu)形態(tài)上發(fā)生的變化，缺乏特異性 的光學標志物，無法獲得分子和細胞水平的功能信息。美國Michigan大學的Mary-Arm Mycek小組使用了發(fā)射和熒光光譜的方法對新鮮分離的人胰腺組織進行了分析(Chandra， Μ. , D.Simeone, B. Mckenna, et al. , Probing pancreatic disease using tissueoptical spectroscopy. Journal of Biomedical Optics，2007. 12 (0605016) ·)。通過檢測熒光光譜 變化的方法同樣缺乏特異性的光學標志物，無法獲得分子和細胞水平的變異，因而仍然不 能有效地檢測早期的病變?；陔p光子吸收和二次諧波產(chǎn)生的光學顯微術(shù)是三維空間分辨率最高的一種成 像技術(shù)(可達亞微米)，且具有固有的光學層析能力、厚組織成像等優(yōu)點，近年來在生物 醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用?；趦?nèi)源性光學標志物(包括主要的自發(fā)熒光物質(zhì)NADH和FAD、彈性蛋白以及主要的二次諧波信號來源膠原蛋白等)的雙光子激發(fā)熒光和二次 諧波成像，在避免繁瑣的標記步驟及其對生物樣本功能和活性可能產(chǎn)生的影響的同時， 可以實現(xiàn)新鮮的離體厚組織和活體組織的高分辨率成像，同時獲得其胞外基質(zhì)中膠原纖 維結(jié)構(gòu)和代謝功能的互補信息。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌組織(Provenzano， P. P. , D. R. Inman, K. W. Eliceiri, et al. , Collagendensity promotes mammary tumor initiation and progression. BmcMedicine,2008. 6)> 卵巢癌組織(Kirkpatrick, N. D. , Μ. Α. Brewer andU. Utzinger, Endogenous optical biomarkers of ovarian cancerevaluated with multiphoton microscopy. Cancer EpidermiologyBiomarkers&P revention,2007. 16(10) :ρ· 2048-2057·)、膀胱癌組織(Cicchi, R.，A. Crisci, A.Cosci， et al. ， Time-andSpectral-resolved two-photon imaging of healthy bladder mucosa andcarcinoma in situ. Optics Express, 2010. 18 (4) :p. 3840-3849.)、皮膚瘢痕組織 (Chen, G. ,J. Chen,S.Zhuo,et al. , Nonlinear spectral imaging of human hypertrophic scar based on two-photon excitedfluorescence and second-harmonic generation. British Journal ofDermatology, 2009. 161(1) :p. 48-55.)、細胞核細胞外間質(zhì)成分(專利 號200710085330. 5)以及視網(wǎng)膜(專利號=200920136665. X)等各種生物組織和器官，但 尚未有將其應(yīng)用于胰腺癌成像的報道。內(nèi)窺鏡是一種光學儀器，可經(jīng)由人體自然腔道送入體內(nèi)，直接觀察生物表皮組織 和臟器內(nèi)腔的病變。胰管鏡是近年來興起的一種內(nèi)窺檢查手段，通過對胰管形態(tài)及粘膜的 觀察達到診斷胰腺疾病的目的。然而，現(xiàn)有的胰管鏡通過單純的光反射原理成像，缺乏特異 的成像對比機制，分辨率僅為亞毫米，只能檢測胰管粘膜組織形態(tài)發(fā)生顯著改變的病變而 無法檢測更為早期的病變。大量研究表明85%以上的腫瘤來源于上皮細胞的病變，且在癌 癥發(fā)生發(fā)展過程中會發(fā)生分子和細胞水平的變異。因此，利用新型光纖和微納器件，開發(fā)出 基于雙光子熒光和二次諧波等高分辨率光學技術(shù)的內(nèi)窺成像系統(tǒng)，可以與傳統(tǒng)的十二指腸 鏡兼容，實現(xiàn)無損、實時、在體地監(jiān)測分子和細胞水平的代謝失常和功能障礙，從而能有效 地檢測微小腫瘤性病變，大大地提高腫瘤的早期診斷率。此外，在該光學內(nèi)窺系統(tǒng)的基礎(chǔ) 上，還可以利用熒光光譜儀作為探測器，通過檢測熒光光譜的變化可以反映組織熒光團的 分布與差異，為胰腺癌的早期診斷提供更為豐富的信息。目前未見有將基于雙光子熒光和 二次諧波的光學內(nèi)窺方法用于胰腺癌的成像，因此，發(fā)展高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)是當前臨床 的迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，綜合集成和應(yīng)用了光纖光學、微納制造、醫(yī)學 影像學等多個學科領(lǐng)域的最新成果，發(fā)展了基于雙光子激發(fā)熒光、二次諧波、偏振敏感二次 諧波的光學顯微內(nèi)窺成像技術(shù)的一種適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)，以實現(xiàn)胰腺 組織的在體高分辨光學成像。同時，基于上述系統(tǒng)可面向胰腺疾病獲取高分辨率圖像數(shù)據(jù) 庫，提取并分析腫瘤早期轉(zhuǎn)化模型和臨床研究成果的光學多參量，并結(jié)合現(xiàn)有診斷方法進 行融合研究，揭示癌變過程中的光學表征規(guī)律，為胰腺癌的早期診斷提供新的依據(jù)和方法， 對于降低胰腺癌發(fā)病率和死亡率以及提高人類健康和醫(yī)療水平具有重要的意義。本發(fā)明的技術(shù)方案為
適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)，主要由高重復頻率的超短脈沖激光器 1 (重復頻率可達80MHz、超短脈沖為15fs-lps)、半波片2、功率衰減器3、光子晶體光纖4、 胰管鏡探頭5、二相色鏡7、圖像傳感器(XD8、分束鏡10、帶通或高通濾光片11、窄帶濾光片 14、偏振分光棱鏡15、光電倍增管(12、16、18)、計算機控制處理單元20組成，胰管鏡探頭5 由單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡組成，其特征在于高重復頻率的超短 脈沖激光器1發(fā)出的近紅外超短脈沖光經(jīng)半波片2改變其偏振方向后再經(jīng)功率衰減器3進 行衰減，然后經(jīng)光子晶體光纖4壓縮激發(fā)脈沖的寬度，入射胰管鏡探頭5，經(jīng)胰管鏡探頭的 單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡到達胰管上皮6，激發(fā)產(chǎn)生二次諧波信號 和雙光子激發(fā)熒光信號，與由白光照射產(chǎn)生的反射光信號一起從胰管鏡探頭5輸出；小型 掃描器件的掃描控制單元19與計算機控制處理單元20相連，控制其對胰管進行逐點掃描 成像；反射光信號經(jīng)二相色鏡7從混合信號中分離出來，采用高靈敏度的CCD8進行探測，探 測到的信號輸入計算機控制處理單元20，實現(xiàn)白光照射反射成像9 ；剩余的混合信號經(jīng)分 束鏡10分為兩束，一束經(jīng)帶通或高通濾光片11分離出雙光子激發(fā)熒光信號由一光電倍增 管12進行探測，探測到的信號輸入計算機控制處理單元20，實現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光成像13 ； 另一束經(jīng)窄帶濾光片14分離出二次諧波信號，再經(jīng)偏振分光棱鏡15分成平行與垂直于激 發(fā)光偏振方向的兩路偏振正交信號由另兩個光電倍增管18和16分別進行探測，探測到的 信號輸入計算機控制處理單元20，實現(xiàn)二次諧波或偏振敏感二次諧波成像17 ；切換半波片 2可以使激發(fā)光的偏振方向與原激發(fā)光的偏振方向平行或垂直，再加上偏振分光棱鏡15的 作用，一共可以得到四幅二次諧波圖像，實現(xiàn)二次諧波或偏振敏感二次諧波成像17。本發(fā)明采用高重復頻率的超短脈沖激光器，如鎖模鈦寶石飛秒激光器或其他高重 復頻率的飛秒或皮秒激光器或超快鎖模激光器作為雙光子激發(fā)熒光和諧波成像的光源，波 長可調(diào)范圍為720-990nm。根據(jù)胰管上皮細胞的特點選擇合適的波長進行成像，一般選擇 750nmo本發(fā)明利用半波片改變?nèi)肷浼す獾钠穹较?，使其能在相互垂直的兩個方向進行 切換。本發(fā)明利用功率衰減器對從高重復頻率的超短脈沖激光器如鎖模鈦寶石飛秒激 光器輸出的激光功率進行衰減，使輸入胰管的光功率符合激光安全應(yīng)用的美國國家標準 ANSI。本發(fā)明利用光子晶體光纖提高成像信號水平，實現(xiàn)激發(fā)和信號收集效率的最大 化。本發(fā)明采用集成了單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡，具有良好 的物理特性和生物兼容性，直徑小于現(xiàn)有十二指腸鏡的工作通道(4mm)的新型胰管鏡探頭 實現(xiàn)胰管的掃描成像。探頭的設(shè)計與集成適用于胰管的解剖結(jié)構(gòu)和活體成像環(huán)境，兼顧內(nèi) 窺成像過程中的實用性和安全性。本發(fā)明利用二相色鏡實現(xiàn)胰管上皮反射光信號和二次諧波信號、雙光子激發(fā)熒光 信號的分離。到達二相色鏡的反射光信號完全反射，而二次諧波信號和雙光子激發(fā)熒光信 號完全透射。本發(fā)明采用高靈敏度的CCD探測胰管上皮反射光信號，并將探測到的信號輸入計 算機控制處理單元，實現(xiàn)傳統(tǒng)胰管鏡檢，獲得胰管粘膜組織形態(tài)的直觀信息。
本發(fā)明利用帶通或高通濾光片將雙光子激發(fā)熒光信號從經(jīng)過分束鏡以后的混合 信號中分離出來。本發(fā)明利用窄帶濾光片將二次諧波信號從經(jīng)過分束鏡以后的混合信號中分離出來。本發(fā)明利用偏振分光棱鏡將二次諧波信號分成平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的 兩個偏振正交信號。本發(fā)明采用高靈敏度的光電倍增管探測二次諧波、偏振敏感二次諧波和雙光子激 發(fā)熒光信號，并將探測到的信號輸入計算機控制處理單元，實現(xiàn)光學成像。本發(fā)明可對反射光、雙光子激發(fā)熒光、偏振敏感二次諧波(平行與垂直于激發(fā)光 偏振方向的兩路偏振正交信號)共四個通道的信號進行同時探測，實現(xiàn)傳統(tǒng)胰管鏡檢的同 時獲得胰管上皮的在體高分辨成像結(jié)果，從而在獲得胰管組織形態(tài)直觀信息的同時檢測胰 腺上皮細胞及亞細胞水平的形態(tài)及代謝改變。本發(fā)明發(fā)展了雙光子激發(fā)熒光、二次諧波、偏振敏感二次諧波成像裝置，主要針對 胰腺上皮細胞進行二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發(fā)熒光復合成像?？蓪Χ沃C波 和雙光子激發(fā)熒光圖像，偏振敏感二次諧波和雙光子激發(fā)熒光圖像，二次諧波和偏振敏感 二次諧波圖像，雙光子激發(fā)熒光、二次諧波和偏振敏感二次諧波圖像進行組合，獲得胰腺組 織結(jié)構(gòu)和功能的互補信息，并在此基礎(chǔ)上進一步利用計算機控制處理單元得到胰腺上皮細 胞代謝水平和形態(tài)學特征相關(guān)的參量。本發(fā)明發(fā)展了基于光學成像技術(shù)的內(nèi)窺成像裝置，即利用雙光子激發(fā)熒光和二次 諧波成像的光纖成像系統(tǒng)，集成基于光子晶體光纖和小型掃描器件的胰管鏡探頭，在確保 良好的信號水平、物理特性和生物兼容性的基礎(chǔ)上實現(xiàn)胰管在體高分辨光學成像，從而滿 足對主胰管及周圍腫瘤性病變早期診斷的需求。本發(fā)明結(jié)合熒光光譜儀，直接反映生物組織的熒光物質(zhì)來源，獲得各種熒光團的 分布與差異信息，通過檢測光譜學變化為光學顯微內(nèi)窺成像提供更為豐富的信息。


圖1為基于光學成像技術(shù)進行胰管光學顯微內(nèi)窺成像裝置示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細說明參照圖1，本發(fā)明主要由高重復頻率的超短脈沖激光器1、半波片2、功率衰減器3、 光子晶體光纖4、胰管鏡探頭5、二相色鏡7、圖像傳感器CXD 8、分束鏡10、帶通或高通濾光 片11、窄帶濾光片14、偏振分光棱鏡15、光電倍增管(12、16、18)、計算機控制處理單元20 組成，胰管鏡探頭5由單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡組成，高重復頻率 的超短脈沖激光器1發(fā)出的近紅外超短脈沖光經(jīng)半波片2改變其偏振方向后再經(jīng)功率衰減 器3進行衰減，然后經(jīng)光子晶體光纖4壓縮激發(fā)脈沖的寬度，入射胰管鏡探頭5，經(jīng)胰管鏡探 頭的單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡到達胰管上皮6，激發(fā)產(chǎn)生二次諧波 信號和雙光子激發(fā)熒光信號，與由白光照射產(chǎn)生的反射光信號一起從胰管鏡探頭5輸出； 小型掃描器件的掃描控制單元19與計算機控制處理單元20相連，控制其對胰管進行逐點
6掃描成像；反射光信號經(jīng)二相色鏡7從混合信號中分離出來，采用高靈敏度的CCD 8進行探 測，探測到的信號輸入計算機控制處理單元20，實現(xiàn)白光照射反射成像9 ；剩余的混合信號 經(jīng)分束鏡10分為兩束，一束經(jīng)帶通或高通濾光片11分離出雙光子激發(fā)熒光信號由一光電 倍增管12進行探測，探測到的信號輸入計算機控制處理單元20，實現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光成像 13 ；另一束經(jīng)窄帶濾光片14分離出二次諧波信號，再經(jīng)偏振分光棱鏡15分成平行與垂直于 激發(fā)光偏振方向的兩路偏振正交信號由另兩個光電倍增管18和16分別進行探測，探測到 的信號輸入計算機控制處理單元20，實現(xiàn)二次諧波或偏振敏感二次諧波成像17 ；切換半波 片2可以使激發(fā)光的偏振方向與原激發(fā)光的偏振方向平行或垂直，再加上偏振分光棱鏡15 的作用，一共可以得到四幅二次諧波圖像，實現(xiàn)二次諧波或偏振敏感二次諧波成像17。結(jié)合熒光光譜儀，直接反映生物組織的熒光物質(zhì)來源，可獲得各種熒光團的分布 與差異信息，通過檢測光譜學變化為光學顯微內(nèi)窺成像提供更為豐富的信息?；谒@得 的雙光子熒光和諧波信號的光學圖像，可建立信息整合與分析方法及相應(yīng)軟件，提取和計 算胰腺腫瘤不同階段的熒光和諧波強度、細胞代謝水平、細胞核尺寸、膠原和彈性蛋白的分 布等多個參數(shù)信息。同時，結(jié)合病理切片的結(jié)果，可研究胰腺腫瘤不同階段的光學表征規(guī) 律，建立胰腺腫瘤在體高分辨率成像數(shù)據(jù)庫，為研究胰腺腫瘤的光學辨識標準提供信息。目前診斷腫瘤的“金標準”是組織病理(細胞)學檢查，其檢查結(jié)果最為準確、可 靠。通常對惡性腫瘤進行病理學診斷的依據(jù)是形態(tài)學特征，其中核增大、核大小形態(tài)不一、 核與胞質(zhì)比例失常和結(jié)締組織增生(主要是I型膠原纖維和糖蛋白等)是胰腺癌中存在的 顯著病理特征?；谝裙芙M織的成像結(jié)果提取出胰腺腫瘤不同階段的多個參數(shù)信息，不僅 可以通過熒光圖像和二次諧波圖像分別獲得細胞核尺寸、形態(tài)、核質(zhì)比大小以及膠原纖維 增生的信息，從而與傳統(tǒng)的組織病理學診斷結(jié)果相聯(lián)系，而且還能獲得各種熒光團的分布 和組織代謝水平差異等更為豐富的信息，并在此基礎(chǔ)上對多種參數(shù)進行定量分析可以實現(xiàn) 更準確的早期診斷。此外，病理學診斷方法需要從患者體內(nèi)取材才能確定腫瘤的性質(zhì)，如取 患病器官的分泌物、組織表面的刮片制成細胞學涂片或直接取病灶組織制成切片或印片， 同時因其屬抽樣檢查，不能代表整個病變，且受到取材部位、腫瘤組織是否存活以及醫(yī)師的 取材技術(shù)等多方面因素的影響。相比之下，利用高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)可以在無損的情況下 對活體胰管組織進行成像，避免了對生物體的損傷和取材等因素對診斷的影響。綜上所述，本發(fā)明所闡述的適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)結(jié)合了雙光子 激發(fā)熒光成像、二次諧波成像和偏振敏感二次諧波成像，為胰腺癌的病理研究和早期診斷 提供了新的方法和依據(jù)，對有效治療胰腺癌、改善預后有著重要的意義，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學 研究領(lǐng)域和臨床醫(yī)學診斷方面。該實例是以本發(fā)明的技術(shù)方案為前提進行實施的，給出了詳細的實施方式，但本 發(fā)明的保護范圍不限于上述實施例。
權(quán)利要求
適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)，主要由高重復頻率的超短脈沖激光器、半波片、功率衰減器、光子晶體光纖、胰管鏡探頭、二相色鏡、圖像傳感器CCD、分束鏡、帶通或高通濾光片、窄帶濾光片、偏振分光棱鏡、光電倍增管、計算機控制處理單元組成，所述的胰管鏡探頭由單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡組成，其特征在于高重復頻率的超短脈沖激光器發(fā)出的近紅外超短脈沖光依次經(jīng)半波片、功率衰減器、光子晶體光纖入射胰管鏡探頭的單根光子晶體光纖、小型掃描器件和微型成像透鏡到達胰管上皮，激發(fā)產(chǎn)生二次諧波信號和雙光子激發(fā)熒光信號，與由白光照射產(chǎn)生的反射光信號一起經(jīng)胰管鏡探頭的微型成像透鏡輸出；胰管鏡探頭中小型掃描器件的控制單元與計算機控制處理單元相連；反射光信號經(jīng)二相色鏡從混合信號中分離出來，采用CCD進行探測，探測到的信號輸入計算機控制處理單元，實現(xiàn)白光照射反射成像；剩余的混合信號經(jīng)分束鏡分為兩束，一束經(jīng)帶通或高通濾光片分離出雙光子激發(fā)熒光信號由一光電倍增管進行探測，探測到的信號輸入計算機控制處理單元，實現(xiàn)雙光子激發(fā)熒光成像；另一束經(jīng)窄帶濾光片分離出二次諧波信號，再經(jīng)偏振分光棱鏡分成平行與垂直于激發(fā)光偏振方向的兩路偏振正交信號由另兩個光電倍增管分別進行探測，探測到的信號輸入計算機控制處理單元，實現(xiàn)二次諧波或偏振敏感二次諧波成像，所述的高重復頻率達80MHz，超短脈沖為15fs 1ps。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)，其特征在于所述 的高重復頻率的超短脈沖激光器為鎖模鈦寶石飛秒激光器、鎖模鈦寶石皮秒激光器或超快 鎖模激光器，波長范圍為720-990nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及適用于胰管成像的高分辨光學內(nèi)窺系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)如下激光器發(fā)出的光依次經(jīng)半波片、功率衰減器、光子晶體光纖入射胰管鏡探頭到達胰管上皮，產(chǎn)生二次諧波信號、雙光子激發(fā)熒光信號，與白光照射產(chǎn)生的反射光信號一起經(jīng)胰管鏡探頭輸出；然后經(jīng)二相色鏡分離出反射光信號后，經(jīng)CCD輸入計算機控制處理單元；剩余混合信號經(jīng)分束鏡分為兩束一束經(jīng)帶通或高通濾光片分離出雙光子激發(fā)熒光信號，進入一光電倍增管再輸入計算機控制處理單元；另一束經(jīng)窄帶濾光片再經(jīng)偏振分光棱鏡分成兩路偏振正交二次諧波信號分別進入另兩個光電倍增管再輸入計算機控制處理單元。本發(fā)明為胰腺癌的早期診斷提供新的方法，對降低胰腺癌的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。
文檔編號A61B1/04GK101947097SQ20101025888
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者付玲, 曾紹群, 李慧, 胡文艷, 駱清銘 申請人:華中科技大學