專利名稱：Rib蛋白，一種可提供對多種B族鏈球菌菌株免疫的細(xì)胞表面蛋白，其純化方法，試劑盒及 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種被稱為Rib的新蛋白質(zhì)(及其亞碎片、變型、多體蛋白)—它可提供對大部分侵入的B族鏈球菌菌株的免疫，該蛋白的純化方法，該蛋白的特異性抗體，試劑盒及含有該蛋白或其片斷的藥物組合物。
在近三十年，B族鏈球菌已成為西方國家新生兒疾病的主要原因。僅在美國，每年約有10000病例是由這種細(xì)菌的侵入引起的。這種感染的總死亡率約為20％，許多幸存的嬰兒終生患有神經(jīng)性后遺癥。基于這些發(fā)現(xiàn)，人們已做了大量工作來尋求預(yù)防和治療的方法，并分析B族鏈球菌引起感染的機(jī)制。
約有20％的婦女陰道中攜帶B族鏈球菌，而且由這種細(xì)菌引起的新生兒疾病最普通的感染途徑可能是從母親的產(chǎn)道垂直傳播。但在初生時(shí)帶有B族鏈球菌的嬰兒中僅有1～2％受到嚴(yán)重感染。因引，除了在出生時(shí)暴露于此細(xì)菌中之外，還有其它因素導(dǎo)致了新生兒疾病的發(fā)展?；純耗赣H對III型莢膜的抗體水平明顯低下，這意味著這些抗體對預(yù)防新生兒疾病是很重要的(Baker，C.J.和D.L.Kasper，N.Engl.J.Med.1976.294753)。
根據(jù)多糖莢膜的不同結(jié)構(gòu)B族鏈球菌菌株可分為四種主要的血清型(Ia，Ib，II和III)(Baker，J Inf Dis 1990.161917)。在正常菌群的菌株中，血清型I、II和III的比例基本相同，但從侵入感染分離出的菌株中III型約占三分之二。由于已知莢膜是毒性因素，所以已對比(特別是III型菌株)進(jìn)行了深入研究。已研制出一種疫苗，其中的必要成份是III型多糖莢膜。但多糖莢膜疫苗會(huì)與人體組織交叉反應(yīng)引起一些問題(Pritchard等人，InfectImmun1992.601598)。因此如果能研制出一種基于蛋白而不是多糖的疫苗將很有價(jià)值。
B族鏈球菌還會(huì)引起母牛乳腺炎，這是一種有經(jīng)濟(jì)重要性的牛類疾病。因此，研制抗B族鏈球菌感染的疫苗在獸醫(yī)學(xué)中也是有意義的。
先前已對兩種B族鏈球菌細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行過細(xì)致研究α和β蛋白。這些蛋白提供對表達(dá)該蛋白的菌株的預(yù)防，免疫，但是它們對B族鏈球菌疾病意義不大，因?yàn)檫@些蛋白通常不被引起大部分嚴(yán)重感染的III型菌株表達(dá)。
本發(fā)明涉及一種鏈球菌細(xì)胞表面蛋白及其變型和亞碎片。這種蛋白被稱為Rib蛋白，是從血清型III的B族鏈球菌菌株中分離出來的95KD(千道爾頓)蛋白。Rib蛋白可被幾乎所有血清型III的B族鏈球菌菌株和部分其它血清型如血清型II的菌株表達(dá)。設(shè)計(jì)了一種純化Rib蛋白的方法，并表明這種蛋白的抗體可以預(yù)防由Rib蛋白表達(dá)菌株引起的致命性感染。
本發(fā)明還涉及可以預(yù)防由Rib蛋白表達(dá)菌株(即，特別是血清型III的B族鏈球菌)引起的感染，天然存在及人工修飾的該種蛋白的變型、亞碎片和多體蛋白。
本發(fā)明還涉及一種載體，如質(zhì)粒、粘性質(zhì)?；蚴删w，其中含有Rib蛋白及其變型、亞碎片和片斷的遺傳密碼，并適于插入非人生物體宿主中并在該宿主中表達(dá)。本發(fā)明中特別涉及三種噬菌體克隆λRib1—3，λRib1—5和λRib1—7。其保藏號(hào)分別為DSM…。
本發(fā)明還涉及可編碼Rib蛋白及其變型、亞碎片斷片和多體蛋白的DNA序列，該序列可插入適宜載體中，如質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒或噬菌體。該DNA序列可得自所保藏的噬菌體λRib1—3，λRib1—5，λRib1—7。
Rib蛋白可由不同的III型菌株表達(dá)。從幾種不同的菌株制備提取物，用Western印跡法檢測(用抗—Rib血清分析)，結(jié)果表明幾乎所有的提取物中均含有Rib蛋白，但該蛋白的分子量在65和125kD之間變化(未列出數(shù)據(jù))。此結(jié)果并不意外，因?yàn)橄惹皩ζ渌麭族鏈球菌蛋白(α和β蛋白)的大小變化進(jìn)行過描述。
現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明該蛋白可由多個(gè)單位組成，每個(gè)單位相應(yīng)的分子量約為9kD。所以本發(fā)明包括95kD蛋白的或具有相同性質(zhì)之基本單位的亞碎片和多體蛋白。變型包括氨基酸的替代或插入，但不能改變對抗該蛋白表達(dá)菌株引起的感染的保護(hù)能力。
已對B族鏈球菌有較多了解并可從被感染人體的血液中分離出來。本發(fā)明人所用的BM110菌株得自Dr.S.Mattingly(Uni-versity of Texas，San Antonio，Texas)。此處所提及的菌株均可從University of Lund和Lund University Hospital的發(fā)明人處得到Doctor Gunnar Lindahal，Department of Medical Microbiology，Solvegatan23，S22362 Lund，Sweden)。
可從血清型III的B族鏈球菌菌株，優(yōu)選菌株BS30或BM110中分離Rib蛋白。本發(fā)明涉及一種純化Rib蛋白的方法。
可按下列步驟分離該蛋白培養(yǎng)表達(dá)該蛋白的B族鏈球菌菌株，分離培養(yǎng)基和/或微生物，用一種酶消化該細(xì)菌，優(yōu)選變?nèi)芫?，可選擇性加入蛋白酶抑制劑，從上清液中分離消化后的細(xì)菌并從上清液中提取Rib蛋白。所用培養(yǎng)基可為任何適于培養(yǎng)鏈球菌的培養(yǎng)基，如Todd-Hewitt培養(yǎng)液(Oxoid)，優(yōu)選將細(xì)胞培養(yǎng)1—30，特別是12—20小時(shí)。用一種酶消化，優(yōu)選變?nèi)芫兀诓徽袷帡l件下消化1—30，特別是10—20，優(yōu)選15—18小時(shí)，溫度為20—40℃，優(yōu)選37℃。也可以從培養(yǎng)基中分離蛋白質(zhì)，在這種情況下不必用酶消化來破碎細(xì)胞壁。加入一種蛋白酶抑制劑，如氯化苯甲脒、碘乙酸或苯基甲基磺酰氟，以防止污染變?nèi)芫鼗虼嬖谟谖⑸镏械牡鞍酌傅淖饔谩?br> 該蛋白可用離子交換色譜法(優(yōu)選陰離子交換色譜法)和凝膠過濾法純化，并按照本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已建立的方法收集含有該蛋白的部分。
本發(fā)明特別涉及基本純的Rib蛋白及其亞碎片?！盎炯儭笔侵敢环N物質(zhì)中不含藥學(xué)上有害的成分。
本發(fā)明特別涉及基本純的Rib蛋白及其亞碎片、變型或多體蛋白相應(yīng)的抗體。已知用抗原免疫動(dòng)物的方法，在這里是用Rib蛋白免疫，收集血液，分離血清，使用與該蛋反應(yīng)的抗體。含有該抗體的血清或IgG部分可用于分析該蛋白。
由于Rib蛋白的抗體可以預(yù)防由B族鏈球菌引起的致命性感染，所以如有一種適于檢測該抗體的方法會(huì)很有價(jià)值，例如用以估算妊娠婦女是否具有足夠的抗體來預(yù)防嬰兒的該種感染。因此可用Rib蛋白或其碎片來檢測該蛋白的抗體。所以本發(fā)明還涉及一種含有Rib蛋白或其亞碎片的試劑盒。
另外，分析各種試樣中是否存在Rib蛋白也是很有意義的?？捎迷摰鞍椎目贵w達(dá)到此目的。因此本發(fā)明還涉及一種檢測該蛋白的試劑盒，其中含有Rib蛋白或其亞碎片的抗體。該試劑盒可含有含該抗體的任何上述血液成分。其中還可含有該蛋白質(zhì)及其亞碎片或多體蛋白，以用作標(biāo)準(zhǔn)品。
Rib蛋白的性質(zhì)表明該蛋白可用以研制抗B族鏈球菌疫苗。因此本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其中含有該蛋白或其片斷作為活性組分，同時(shí)可含有藥學(xué)上可接受的輔料和賦形劑。適用的藥學(xué)上的輔料是本領(lǐng)域中常用的那些。適用的賦形劑的例子有甘露糖醇、乳糖、淀粉、纖維素、葡萄糖等，此處僅提及一部分。所列舉的輔料和賦形劑不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。
下面用附圖詳細(xì)介紹本發(fā)明，其中

圖1表明了用Western印跡法分析由代表四種主要血清型(Ia型A909菌株；Ib型SB35；II型B1284；III型BS30)的B族鏈球菌株制備的提取物的結(jié)果。如免疫印跡所示，Ia型和Ib型表達(dá)α和β蛋白，用箭頭表示這些蛋白在染色后的凝膠中的位置(下面的箭頭α抗原；上面的箭頭β抗原)。用星號(hào)表示III型BS30菌株的95—kD Rib蛋白在染色后的凝膠中的位置。分子量標(biāo)準(zhǔn)品示于左側(cè)，單位為kD。
圖2A和2B表明了從III型BS30菌株純化Rib蛋白的方法。(A)將預(yù)先用DEAE離子交換色譜法部分純化的變?nèi)芫靥崛∫河肈EAE Bio-Gel A的30ml離子交換色譜柱處理，用NaCl在10mM Tris中的溶液(800ml，PH8.0)進(jìn)行線性梯度洗脫，再用1MNaCl(60ml)洗脫。陰影區(qū)表示含有Rib蛋白的部分。插圖表示用SDS-PAGE法分析含有Rib蛋白部分的合并液的結(jié)果；分子量標(biāo)準(zhǔn)示于左側(cè)，單位為kD，用箭頭表示Rib蛋白(95kD)的位置。(B)將離子交換色譜中得到的含有Rib蛋白部分的合并液再用Sepharose CL6B凝膠過濾柱(4.2×90cm)處理。陰影區(qū)表示含有Rib蛋白的部分，插圖表示用SDS-PAGE法分析這些部分的合并液的結(jié)果。Vo為空體積，Vt為總體積。
圖3A、3B和3C表明了四種主要血清型的B族鏈球菌菌株對α、β和Rib蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)。測定了五種菌株A909(Ia型)；SB35(Ib型)；B1284(II型)；BS30(III型)和BM110(III型)。表示這五種菌株的符號(hào)示于框C中。如圖所示，用不同濃度的α、β和Rib蛋白兔抗血清培養(yǎng)細(xì)菌懸浮液。X軸上的數(shù)字表示細(xì)菌混合液中抗體的最終稀釋度。與放射性同位素標(biāo)記的蛋白G孵育測定結(jié)合抗體。在所有實(shí)驗(yàn)中均包括預(yù)免疫兔血清的對照液，并均呈陰性反應(yīng)。
圖4表明了用純化蛋白誘導(dǎo)的兔抗血清檢測純化α、β和Rib蛋白的Western印跡分析結(jié)果。所用抗血清的稀釋度為1∶1000，用放射標(biāo)記的蛋白G測定結(jié)合抗體。分子量標(biāo)準(zhǔn)示于左側(cè)，單位為kD。
圖5表明了純化α、β和Rib蛋白經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后的SDS—PAGE分析結(jié)果。在PH7.5進(jìn)行胰蛋白酶處理，在PH4.0進(jìn)行胃蛋白酶處理。在SDS—PAGE分析之前先中和樣品。對照組與含有胰蛋白酶或胃蛋白酶的樣品同樣處理，但不加入酶；這種處理不會(huì)消化蛋白。P＝胰胃蛋白酶；T＝胰蛋白酶。分子量標(biāo)準(zhǔn)示于左側(cè)，單位為kD。
圖6A、6B和6C表明了由BM110菌株克隆rib—基因以及用大腸桿菌表達(dá)Rib蛋白的結(jié)果。(A)用Westerr印跡法分析7種不同的λ克隆。用Rib抗體孵育。(B)限制性消化BM110菌株的染色體DNA。(C)限制性消化表達(dá)Rib的λ—克隆，λRib3。
用SDS—PAGE法和免疫印跡法分析了幾種不同血清型菌株的變?nèi)芫靥崛∥?用α和β蛋白的抗血清)，參見實(shí)施例1。圖1表明了從代表4個(gè)主要血清型的4種菌株得到的結(jié)果。由Ia型和Ib型菌株表達(dá)的α和β蛋白在染色凝膠的高分子區(qū)域有特征條帶。與以前的發(fā)現(xiàn)相同，兩個(gè)菌株間這些蛋白的大小有所不同。III型菌株提取液中還有一種主要蛋白出現(xiàn)在高分子區(qū)域內(nèi)，盡管該菌株并不表達(dá)α蛋白或β蛋白。在其他III型菌株的提取液中也發(fā)現(xiàn)有這種高分子量特征蛋白。不同菌株間該蛋白大小有變化。這些與α和β蛋白共同的特點(diǎn)吸引人們對III型菌株高分子量蛋白進(jìn)行更細(xì)致的研究。選用了BS30菌株，因?yàn)橐阎鼘κ笥卸拘?。從變?nèi)芫靥崛∫褐屑兓?實(shí)施例2)該菌株表達(dá)的95kD蛋白(圖1)。用兩個(gè)連續(xù)的離子交換色譜步驟，再用凝膠過濾(圖2)進(jìn)行純化。用SDS—PAGE法分析各部分中是否出現(xiàn)95kD蛋白。當(dāng)合并并分析凝膠過濾后相應(yīng)的部分時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)兩種蛋白大量的95kD蛋白和少量的90kD蛋白(參見圖2B中的插圖)。90kD蛋白很可能是95kD蛋白的降解產(chǎn)物，因?yàn)橹蟀l(fā)現(xiàn)這兩種蛋白具有相同的氨基末端序列。這種純化的蛋白被稱為Rib蛋白(R—抗蛋白酶，i—免疫，B—族)。用SDS—PAGE凝膠的切片免疫家兔制備95kD型Rib蛋白的抗血清。
為了分析Rib蛋白是否是一種細(xì)胞表面蛋白，測定了代表4種主要血清型的菌株與抗Rib血清的結(jié)合能力。研究的五種菌株中包括上述四種菌株和另一種III型菌株，BM110，它是一種高毒性的III型菌株克隆。作為對照，還測定了這五種菌株對α和β蛋白的表達(dá)(用高度純化的α和β蛋白制備物的抗血清)。
正如所預(yù)料的，抗α血清與Ia和Ib菌株反應(yīng)劇烈，但它也與兩種III型菌株有微弱反應(yīng)(圖3A)。但是，用Western印跡法分析表明III型菌株變?nèi)芫靥崛∫褐胁缓锌蓹z測的α蛋白。因此抗α血清與整個(gè)III型細(xì)菌的微弱反應(yīng)可能是與其它細(xì)胞壁成份的交叉反應(yīng)。該結(jié)果表明可用與抗α血清的反應(yīng)明確檢測某菌株細(xì)胞表面是否表達(dá)α抗原。從抗β血清獲得了類似的結(jié)果(圖3B)。
Rib蛋白的抗血清與兩種III型菌株反應(yīng)，而不與Ia型和Ib型菌株反應(yīng)(圖3C)。與II型菌株顯示出中等水平的結(jié)合。用West-ern印跡實(shí)驗(yàn)分析五種菌株的變?nèi)芫靥崛∫?用抗—Rib血清進(jìn)行測定)III型菌株反應(yīng)強(qiáng)，在95kD有主要印跡條帶，但其它三種菌株的提取液完全沒有反應(yīng)(未列出結(jié)果)。此結(jié)果表明抗—Rib血清與II型菌株的中等反應(yīng)是交叉反應(yīng)，在Western印跡條件下便消失了?？膳卸≧ib蛋白是由兩種III型菌株的細(xì)胞表面表達(dá)的，而不被另外三種菌株表達(dá)。
從侵入感染中分離了已知血清型的共58個(gè)菌株，測定它們與Rib蛋白抗體的結(jié)合能力(參見表1，實(shí)施例6)。還測定了每種菌株與α和β蛋白抗體的結(jié)合。為了簡化對眾多菌株的研究，每種抗血清僅在1000倍的稀釋度進(jìn)行測定，這是基于圖3中所示結(jié)果選擇的。此類分析得出明確結(jié)果，總結(jié)于實(shí)施例6的表1中。33種II型菌株中有31種、13種II型菌株中有1種細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)有Rib蛋白，但12種Ia和Ib型菌株中均未發(fā)現(xiàn)。
細(xì)胞表面缺乏Rib蛋白的菌株可能會(huì)向培養(yǎng)基中分泌該種蛋白。將列于表1中的58種菌株的培養(yǎng)基上清液用點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析(用抗Rib血清測定)。在細(xì)胞表面不表達(dá)該蛋白的26種菌株的培養(yǎng)基上清液中均未發(fā)現(xiàn)Rib蛋白，但在細(xì)胞表面表達(dá)該蛋白的32種菌株中有26種的培養(yǎng)基上清液中發(fā)現(xiàn)了Rib蛋白(未列出結(jié)果)。
用鼠保護(hù)模型研究家兔Rib蛋白抗體是否能防止B族鏈球菌致命性感染(表2，實(shí)施例7)。如所示，對照組動(dòng)物接受α蛋白抗血清或預(yù)免疫抗血清。結(jié)果表明Rib蛋白抗血清可以防止鼠對Rib蛋白表達(dá)菌株的致命性感染。
由于Rib蛋白象α和β蛋白一樣可以提供保護(hù)性免疫，所以對這三種蛋白質(zhì)的比較是很有意義的。進(jìn)行了Western印跡實(shí)驗(yàn)(用純化蛋白的抗血清進(jìn)行分析)(圖4)。染色凝膠表明三種蛋白是高度純化的(在每個(gè)制品中有一種主要的蛋白)，但在三種蛋白之間沒有血清學(xué)交叉反應(yīng)，如Western印跡所示。
最開始區(qū)別α和β蛋白是由于其蛋白酶敏感性不同。α蛋白對胰蛋白酶穩(wěn)定而對胃蛋白酶敏感，而β蛋白對這兩種蛋白酶均敏感(Bevanger和Maeland，Acta Path Microbiol Scand Sect B1979.8785)。用純化的α和β蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一區(qū)別，并表明Rib蛋白對胰蛋白酶和胃蛋白酶都穩(wěn)定(圖5)。如所預(yù)料的，三種蛋白質(zhì)均對蛋白酶K的消化敏感(未列出結(jié)果)。Rib蛋白對蛋白酶的穩(wěn)定性不是由于出現(xiàn)了抑制劑，因?yàn)榧词乖赗ib蛋白存在下β蛋白也可被胰蛋白酶和胃蛋白酶完全消化(未列出結(jié)果)。下列實(shí)施例將詳細(xì)介紹本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1蛋白質(zhì)的鑒別。
這里用代表4種主要血清型的四種B族鏈球菌作為參照菌株A909，Ia/c型；SB35，Ib型；B1284，II型；BS30，III型。BS30菌株是從Lund University Hospital某患新生兒感染的男孩體內(nèi)分離的。所有菌株均在37℃的Todd-Hewitt培養(yǎng)基中(Oxoid)生長，不振蕩。各菌株的變?nèi)芫靥崛∫河肧DS-PAGE法和免疫印跡法(用α和β蛋白的抗血清)進(jìn)行分析。小規(guī)模制備鏈球菌菌株變?nèi)芫靥崛∫旱姆椒ㄅc大規(guī)模制備用于蛋白純化的提取液的方法相同，但僅用50ml的培養(yǎng)液制備20％的細(xì)菌懸浮液，從中取1ml試樣用酶消化。
按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，聚丙烯酰胺的總濃度為10％，交聯(lián)度為3.3％。樣品在含有2％的SDS和5％2—疏基乙醇的溶液中煮沸3分鐘后再進(jìn)行電泳。分離后的蛋白用考馬思亮藍(lán)R—250染色或者經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到甲醇活化的聚偏二氟乙烯基膜(Immobilon-P；Millipore Corp.，Molsheim，F(xiàn)rance)上(用Semi-Dry電印跡儀(Ancos，Vig，Denmark))。按標(biāo)準(zhǔn)步驟用明膠封閉Immobilon膜，再用稀釋了1000倍的指定型家兔抗血清孵育(參見實(shí)施例7)然后用放射標(biāo)記的蛋白G孵育，并進(jìn)行放射自顯影。
按氯胺-T法用無載體的放射性同位素I125(Amersham Inter-national，England)標(biāo)記蛋白。用MicroBCA蛋白檢定試劑(Pierce)測定蛋白質(zhì)的總濃度。用Bio-Rad422型電洗脫儀從SDS-PAGE凝膠中電洗脫蛋白。
結(jié)果示于圖1。
實(shí)施例2.Rib蛋白的純化從10L培養(yǎng)過液的BS30菌株的培養(yǎng)物中沉降細(xì)菌，并用50mM Tris緩沖液(PH7.3)洗滌2次，再用同種緩沖液懸浮成20％(V/V)的懸液。將變?nèi)芫?Sigma Chemical CO.，ST.Louis，MO)在10mM)磷酸鉀溶液(PH6.2)中溶解成5000單位/ml，然后加到細(xì)菌懸液(125ml)中至最終濃度為350單位/ml。輕微振蕩使消化在37℃持續(xù)17小時(shí)，再加入蛋白酶抑制劑至下列濃度氯化苯甲脒，5mM；碘乙酸，5mM；苯基甲基磺酰氟，2mM。將懸浮液離心并立即將上清液對10mMTris(PH8.0)緩沖液滲析(滲析管為Spectrapor No.4)。如初始實(shí)驗(yàn)所示，將滲析后的產(chǎn)物連續(xù)兩次進(jìn)行離子交換層析，以最佳回收純Rib蛋白。用SDS-PAGE檢測Rib蛋白的存在并目測凝膠中出現(xiàn)的95kD條帶。在第一步層析中，將滲析液(110mM)與等體積0.4M NaCl在10mM Tris中的溶液(PH8.0)及30ml DEAE Bio-Gel A(BioRad Laboratories，Richmond，CA)混合，用10mMTris(pH8.0)平衡。將該混合液緩緩攪動(dòng)1小時(shí)(4℃)，用玻璃濾器過濾，將未吸附的物質(zhì)(含Rib蛋白)與凝膠分離。在第二步層析中(圖2A)，將含有Rib蛋白的濾液用蒸鎦水稀釋20倍，以降低離子強(qiáng)度，并與30ml DEAE Bio-Gel A混合，如上所述進(jìn)行平衡。緩緩攪動(dòng)16小時(shí)(4℃)，過濾，回收凝膠，用10mM Tris(PH8.0)洗滌。將吸附的蛋白(包括Rib蛋白)用800ml鹽溶液線性梯度洗脫(0-0.2M NaCl于10mM Tris中，PH8.0)，再用1M NaCl(60ml)洗脫。收集各部分，合并含有Rib蛋白的部分，濃縮，再進(jìn)行凝膠過濾，用Sepharose CL6B(4.2cm×90)柱，洗脫液為PBSA(0.12MNacl，0.03M磷酸鹽，0.02％NaN3，PH7.2)(圖2B)。用SDS-PAEG電泳分析各部分中是否出現(xiàn)95kD條帶。合并含有Rib蛋白的部分并冷凍。25g細(xì)菌中約得到Rib蛋白6mg。為了保證用于免疫化學(xué)分析的Rib蛋白制品的純度，將該蛋白進(jìn)一步用SDS-PAGE純化，然后用電洗脫洗脫95kD條帶。但SDS-PAGE分析并未顯示這種電洗脫得到的物質(zhì)與凝膠過濾步驟中回收的物質(zhì)間的純度差別。
前面已提及，Rib蛋白還存在于表達(dá)該蛋白的菌株的培養(yǎng)基中?？捎妙愃朴谏鲜黾夹g(shù)的方法從這樣的培養(yǎng)基中純化該蛋白。
將轉(zhuǎn)移到Immobililon上的蛋白條帶直接在膜上進(jìn)行自動(dòng)氨基酸序列分析(用Applied Biosystem 470A氣—液固相序列儀)。用考馬思亮藍(lán)將膜淡淡地染色以確定蛋白條帶的位置，然后將該蛋白條帶切下來用于序列分析。用Swissport Data Bank分析蛋白質(zhì)序列。
得自BS30菌株的Rib蛋白的氨基末端序列示于SEQ ID No.1純化的Rib蛋白中含有分子量約為95kD和90kD的兩種蛋白質(zhì)(圖2B)，它們含有相同的氨基末端序列，這表明小分子是大分子的降解產(chǎn)物。研究結(jié)果表明Rib蛋白的氨基末端序列是獨(dú)特的。
還用同樣的純化步驟從BM110菌株中分離了Rib蛋白。從BM110菌株分離的Rib蛋白的氨基末端序列(SEQ ID No2)與從BS30菌株分離的Rib蛋白的氨基末端序列在第7位有所不同，BM110的蛋白中為Ser，而不是ASP。
實(shí)施例3α蛋白的純化。
從SB35菌株中純化α蛋白，它是表達(dá)α和β蛋白的Ib型菌株。使用類似于從BS30菌株中純化Rib蛋白的方法。用點(diǎn)印跡法分析各組分中α蛋白的存在，使用了家兔抗—α血清(由挪威Trondheim大學(xué)Dr.L.Bevanger提供)和125I放射性同位素標(biāo)記的蛋白G(Calbiochem Co.，San Diego CA)進(jìn)行分析。在離子交換和凝膠過濾步驟中，α蛋白的現(xiàn)象類似于Rib蛋白(cf.圖2)。凝膠過濾步驟中回收的α蛋白呈現(xiàn)一尖峰。用不同的抗血清分析該物質(zhì)表明，其中含有痕量的β蛋白，β蛋白是將制品通過一個(gè)IgA-Sepharose小柱子除去的。根據(jù)SDS-PAGE分析，純化的α蛋白分子量約為110,000(cf.圖4)。從39g細(xì)菌中得到了12mgα蛋白。如前面對Rib蛋白所述，將用于免疫化學(xué)研究的α蛋白從SDS-PAGE凝膠上電洗脫進(jìn)一步純化。但SDS-PAGE分析未表明這種電洗脫得到的物質(zhì)與從凝膠過濾中回收的物質(zhì)間的純度差別實(shí)施例4.β蛋白的純化。
用類似于純化Rib和α蛋白的方法純化與IgA結(jié)合的β蛋白(Russell-Jones等人，J.Exp，Med.1984，1601467)。將洗滌過的細(xì)菌SB35在50mM甘氨酸-NaOH緩沖液中(PH11.0)孵育(懸液的最終PH為9.7)得到初始材料。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明在這樣的提取液中主要的蛋白種類是β蛋白。將提取液(220ml)立即對10mM Tris(PH8.0)滲析，用蒸餾水稀釋20倍，并與40ml DEAE Bio-Gel A混合(用10mM Tris平衡，pH8.0)。在4℃緩緩攪拌2小時(shí)，將凝膠轉(zhuǎn)移到柱中用800ml鹽水線性梯度洗脫(0-0.2M NaCl在10mM Tris中的溶液，pH8.0)，用點(diǎn)印跡法分析各部分(10ml)中是否存在β蛋白，用放射標(biāo)記的IGA或抗-β血清和放射標(biāo)記的蛋白G進(jìn)行分析。β蛋白在梯度的第一區(qū)段被洗脫下來。合并相應(yīng)的部分，濃縮，用AcA34(Pharmacia-LKB，Uppsala，Sweden)柱(4.2×100cm)在PBSA中進(jìn)行凝膠過濾，洗脫β蛋白，其峰形很好。合并相應(yīng)的部分、濃縮、冷卻。23g細(xì)菌中得到了9mg純化蛋白。根據(jù)SDS-PAGE分析，在該制品中主要蛋白的分子量為130,000，但用Western印跡法分析該蛋白時(shí)還發(fā)現(xiàn)有少量低分子量的降解產(chǎn)物。
實(shí)施例5對蛋白酶敏感性的分析。
取200微升純化的α、β或Rib蛋白(0.5mg/ml)，與胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶K(0.2mg/ml)在37℃孵育1小時(shí)，分析對蛋白酶的敏感性(圖5)。胰蛋白酶的消化是在0.25M磷酸鈉(pH7.5)中進(jìn)行，胃蛋白酶的消化在0.25M醋酸鈉(pH4.0)中進(jìn)行，蛋白酶K的消化在0.25M Tris(pH7.4)中進(jìn)行。在用SDS-PAGE分析之前中和樣品。
實(shí)施例6對鏈球菌菌株α、β和Rib蛋白細(xì)胞表面表達(dá)的分析。
首先分析了可從本實(shí)驗(yàn)室得到的五種菌株的α、β和Rib蛋白細(xì)胞表面表達(dá)。然后從侵入感染的病例中分離并獲得了58個(gè)B族鏈球菌菌株，用于分析對這些細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)(見表1)。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在Lund University Hospital的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室將B族鏈球菌分型。
取10ml過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)物，將細(xì)菌用PBSAT(PBSA中添加0.05％吐溫20)洗滌2次，并制備1％PBSAT細(xì)菌懸液。將該細(xì)菌懸液的試樣(180μg)與20μl稀釋于PBSAT的兔抗血清混合，將混合液在23℃孵育1小時(shí)。再加入2mg PBSAT，離心沉降細(xì)菌，用2mlPBSAT，洗滌1次，再懸浮于200μlPBSAT中。然后加入25μl放射標(biāo)記的蛋白G(在PBSAT中，約104pm)，在23℃再保溫1小時(shí)，以測定結(jié)合的IgG。再加入2mlPBSAT，離心沉降細(xì)菌并加入2ml PBSAT洗滌沉淀物。最后一次離心后棄去上清液，測定沉淀的放射性。測定多種菌株對α、β和Rib蛋白的表達(dá)時(shí)(表1)，僅使用最后的稀釋度為1∶1000的抗血清。在所有實(shí)驗(yàn)中均包括預(yù)免疫兔抗血清對照組并均呈陰性反應(yīng)。33種III型菌株中有31種菌株中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面有Rib蛋白，但12種Ia和Ib型菌株中均未發(fā)現(xiàn)該蛋白。
表1.從侵入感染的患者體內(nèi)分離的58種B族鏈球菌對α、β和Rib蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)。
莢膜型所表達(dá)的 IaIb II III蛋白 (n＝9)(n＝3) (n＝13) (n＝33)α 6 0 40β 1 0 00α和β 1 3 50Rib 0 0 13無 1 0 32
用特異性抗血清分析α、β和Rib蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)，用放射標(biāo)記的蛋白G測定結(jié)合抗體，結(jié)果示于圖3。
此處研究的58種菌株均是從侵入感染的病例中分離出來的，但并不代表隨機(jī)收集菌株，因?yàn)樽畛跏占木曛袃H有2種是II型菌株，大多數(shù)II型菌株是后來補(bǔ)充的。
實(shí)施例7抗血清的制備和鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)所有抗血清均由家兔產(chǎn)生，在背部皮下免疫，將SDS-PAGE凝膠中相應(yīng)的95kD條帶切下，分成小片并與弗氏完全佐劑混合，用以制備菌株BS30表達(dá)的Rib蛋白的抗血清。初次免疫時(shí)將6片(約60μg蛋白)溶于1mlPBS中并與1ml佐劑混合。用3個(gè)條帶(30μg蛋白)進(jìn)行加強(qiáng)劑量注射。4周后給第一次加強(qiáng)劑量，再給3次加強(qiáng)劑量，間隔為2周。然后從家兔抽血3次，間隔為3周，將從3個(gè)血樣中得到的血清合并，用于本實(shí)驗(yàn)。用同樣方法制備α蛋白的抗血清。在純化中用于各部分分析的抗α血清的第一個(gè)試樣得自Dr Lars Bevanger，Trondheim。純化β蛋白的抗血清可從本實(shí)驗(yàn)室得到。
所用的C3H/HeN鼠由本部門飼養(yǎng)，年齡為10—20周。給鼠腹腔注射0.5ml用PBS稀釋了5倍的兔血清，4小時(shí)后腹腔注射0.5ml用Todd-Hewitt培養(yǎng)基稀釋的對數(shù)期的細(xì)菌來感染。所用的細(xì)菌的數(shù)量約為90％致死劑量(LD90)。對于BM110，BE210和SB35 sed l為2×106c.f.u.，對于BS30和L25為2×107c.f.u。每天記錄死亡動(dòng)物的數(shù)量，記錄4天。對照組動(dòng)物通常在24小時(shí)內(nèi)死亡。
表2Rib蛋白的兔抗血清防止表達(dá)該蛋白的B族鏈球菌對鼠的致命性感染。菌株莢膜型相關(guān)的細(xì)用下列血清預(yù)處理后小鼠內(nèi)存活數(shù)＋胞表面蛋白抗-Rib 抗-α血清 正常血清血清BS30IIIRib 29/32′ 1/154/20BM110 IIIRib 15/24′ 0/150/15L25 III -0/15 2/14n.d.11BE210IIRib 10/15′ 0/14n.d.SB35sedl Ib alpha 1/1510/15-n.d.給C3H/HeN鼠由腹腔注射0.1ml兔抗血清(用PBS稀釋至0.5ml)，4小時(shí)后用LD90劑量的對數(shù)期細(xì)菌(用Todd-Hewitt培養(yǎng)基稀釋至0.5ml)攻擊。用X2檢驗(yàn)分析存活數(shù)據(jù)。
-Rib蛋白或α蛋白的表達(dá)(與這些實(shí)驗(yàn)相關(guān)的兩種抗原)。+存活了4天的鼠的數(shù)量/被感染的鼠的總數(shù)。 P＜0.001，與接受抗α血清或正常血清的對照組相比。
n.d＝未檢測。
1P＜0.001，與接受抗α血清的對照組相比。
-P＜0.01，與接受抗Rib血清的對照組相比。
表2中的數(shù)據(jù)表明Rib蛋白的抗血清防止了BS30的致命性感染，BS30是從中純化了Rib蛋白的III型菌株。如對照組血清的實(shí)驗(yàn)所示，這種保護(hù)不是非特異性的?？?Rib血清還可防止另一種III型菌株的致命性感染，BM110，一種高毒力B族鏈球菌菌株克隆(Musser等，Proc.Natl.Acad.Sci USA1989.864731).相反?？?Rib血清不能防止L25菌株(一種不表達(dá)Rib蛋白的III型菌株)的感染。(表1)。如表達(dá)Rib蛋白的II型菌株的實(shí)驗(yàn)所示，抗-Rib血清的保護(hù)作用并不僅限于III型菌株。如同所預(yù)料的，抗-Rib血清不能防止表達(dá)α抗原的Ib型菌株?？傊@些數(shù)據(jù)有力地說明了在幾乎所有III型菌株中和部分II型菌株中，即，在大部分引起侵入感染的B族鏈球菌中，Rib蛋白是一種毒性因素。
實(shí)施例8 rib-基因的克隆以及Rib蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)從菌株BM110(一種高毒性的血清型III菌株克隆)中克隆Rib蛋白的結(jié)構(gòu)基因。由該菌株表達(dá)的Rib蛋白(SEQ ID No.2)和由菌株BS30表達(dá)的Rib蛋白(SEQ ID No.1)具有類似的大小和氨基未端序列。在噬菌體α中構(gòu)建BM110菌株的DNA文庫。將500ml Todd-Hewitt培養(yǎng)液中對數(shù)期BM110菌株的細(xì)菌離心沉降。將沉淀物冷凍、再融化，反復(fù)3次，懸浮于20ml TE緩沖液中(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)，離心，洗滌，再懸浮于4ml同種緩沖液中。將變?nèi)芫?Sigma Chemical Co.St Louis，Mo，USA)在10mM磷酸鉀(pH6.2)中溶解成5000單位/ml，加入細(xì)菌懸液中使最終濃度為500單位/ml。加入溶菌酶(Sigma)至最終濃度為8mg/ml，在37℃消化3小時(shí)。加入200μl 10％SDS和500μl吐溫溶菌混合液(2％吐溫—20，50mM Tris pH8.0，60mMEDTA)使細(xì)菌細(xì)胞溶解，然后再加入200ml10％SDS。將溶菌產(chǎn)物用蛋白酶K(Sigma，100μg/ml于50℃處理19小時(shí)，然后用苯酚和氯仿反復(fù)提取。用乙醇沉淀DNA，用高速真空濃縮儀(SAVAC)干燥，溶于4.5ml TE緩沖液中。然后將DNA用CsCl密度梯度超速離心進(jìn)一步純化，再對TE緩沖液透析。DNA濃度約為2.5μg/ml。將DNA用Sau 3AI(Promega)部分消化，并連接于Bam HI切割的λEMBL 3(Statagene)的臂上。將重組噬菌體DNA用Gigapack II Gold Packaing Extract(Stagagne)體外包裝。將DNA文庫覆在大腸桿菌菌株LE392上，用免疫印跡技術(shù)篩選產(chǎn)生Rib蛋白的菌株用硝酸纖維素薄膜覆蓋約有1000個(gè)溶菌斑的板，于4℃放置1小時(shí)。將膜移開、封閉、用含有兔抗Rib血清的緩沖液孵育，稀釋50倍。加入過氧化物酶標(biāo)記的蛋白A(Sigma)(20μg/ml)檢測陽性溶菌斑(即與兔IgG結(jié)合的溶菌斑)，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯現(xiàn)過氧化物酶的存在。分離出7種獨(dú)立表達(dá)Rib的λ克隆，其中三種克隆，即λRib-3、λRib1—5和λRib1—7保藏于Deutsche Sammlung Von Microorganismen，保藏號(hào)分別為DSM……。另外還制備了λRib1—3克隆的DNA，DNA濃度約為0.5μg/μl。將7種克隆的溶菌產(chǎn)物用抗—Rib血清進(jìn)行Western印跡分析(參見圖6)。有些克隆所表達(dá)的Rib蛋白與從BM110菌株中直接分離的Rib蛋白大小相等。
(1)一般信息
(i)申請人(A)姓名Gunnar Lindahl(B)地址Magnus Stenbocksgatan 5(C)城市Lund(E)國別瑞典(F)郵編(ZIP)22224(ii)發(fā)明名稱Rib蛋白，一種可提供對多種B族鏈球菌菌株免疫的細(xì)胞表面蛋白；其純化方法，試劑盒及藥物組合物。
(iii)序列數(shù)目2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，Version#1.25(EPO)(V)目前申請資料申請?zhí)?2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)形式氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(iv)反義無
(v)片斷形式氨基未端(vi)來源(A)生物體B族鏈球菌(B)菌株BS30(xi)對序列的描述SEQ ID NO.1Ala Glu Val Ile Ser Gly Asp Ala Val Thr Leu Asn1 5 10(3)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(v)片斷形式氨基末端(vi)來源(A)生物體B族鏈球菌(B)菌株BM110(xi)對序列的描述AEQ ID No2Ala Glu Val Ile Ser Gly SerAla Val Thr Leu Asn15 10
權(quán)利要求
1.一種被稱為Rib的純化的蛋白質(zhì)，其特征在于a)它可得自B族鏈球菌菌株，特別是血清型III的B族鏈球菌菌株；b)它對胰蛋白酶或胃蛋白酶的消化相對穩(wěn)定；c)它具有根據(jù)SEQ ID No.1的氨基末端氨基酸序列或與該序列有至少90％同源性的序列；以及d)它可提供對表達(dá)該蛋白的B族鏈球菌菌株的保護(hù)免疫；及其具有保護(hù)免疫功能的天然存在或人工修飾的變型、亞碎片和多體蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所說的菌株為BS30或BM110，并且用SDS—PAGE所測的該蛋白的表觀分子量為約95kD。
3.一種分離Rib蛋白的方法，其特征在于培養(yǎng)表達(dá)該蛋白的B族鏈球菌菌株，分離培養(yǎng)基和/或微生物，用一種酶消化細(xì)菌，優(yōu)選變?nèi)芫?，可選擇性加入蛋白酶抑制劑，從上清液分離出消化后的細(xì)菌并從上清液中提取Rib蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中用滲析法從上清液中提取該蛋白，用離子交換色譜和凝膠過濾分離。
5.對權(quán)利要求1中所定義的Rib蛋白及其變型、亞碎片和多體蛋白高度特異性的抗體。
6.一種檢測Rib蛋白抗體的試劑盒，其特征在于它含有權(quán)利要求1中所定義的Rib蛋白或其變型、亞碎片和多體蛋白。
7.一種檢測Rib蛋白的試劑盒，其特征在于它含有權(quán)利要求1中所定義的蛋白質(zhì)的特異性抗體，還選擇性地含有Rib蛋白及其變型、亞碎片和/或多體蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。
8.一種含有編碼權(quán)利要求1所定義的Rib蛋白或其變型、亞碎片或多體蛋白的DNA序列的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其特征在于編碼Rib蛋白的載體DNA序列基本上與噬菌體λRib1—3的任何相應(yīng)DNA序列相同，所述噬菌體的保藏號(hào)為DSM……
10.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其特征在于編碼Rib蛋白的載體DNA序列基本上與噬菌體λRib1—5的任何相應(yīng)DNA序列相同，所述噬菌體的保藏號(hào)為DSM……
11.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其特征在于編碼Rib蛋白載的體DNA序列基本上與噬菌體λRib1—7的任何相應(yīng)DNA序列相同，所述噬菌體的保藏號(hào)為DSM……
12.噬菌體λRib1—3，其保藏號(hào)為DSM……
13.噬菌體λRib1—5，其保藏號(hào)為DSM……
14.噬菌體λRib1—7，其保藏號(hào)為DSM……
15.編碼Rib蛋白或其變型、亞碎片、多體蛋白的DNA序列，它可從權(quán)利要求8所定義的載體中得到。
16.一種含有權(quán)利要求1所定義的Rib蛋白或其變型、亞碎片或多體蛋白的藥物組合物，該組合物還含有藥學(xué)上可接受的輔料或賦形劑。
17.一種含有權(quán)利要求1所定義的Rib蛋白或其變型、亞碎片或多體蛋白的疫苗，該疫苗還含有藥學(xué)上可接受的輔料或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種被稱為Rib的新蛋白質(zhì)，及其亞碎片、多體蛋白和變型，它們可提供對由B族鏈球菌，特別是B族鏈球菌血清型III的菌株引起的感染的保護(hù)性免疫。本發(fā)明包括該蛋白質(zhì)的純化方法，其高度特異性抗體的制備方法，試劑盒、編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列以及含有該蛋白或其片斷或變型的藥物組合物。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1119442SQ94191519
公開日1996年3月27日 申請日期1994年3月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月19日
發(fā)明者G·林達(dá)爾, M·斯塔哈馬卡萊馬姆, L·斯坦伯格 申請人:G·林達(dá)爾