專利名稱：牛生長激素的非變性效能的測(cè)定的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般地涉及牛生長激素(bST)。更具體地講，本發(fā)明涉及以適于提供bST效能測(cè)定的方式從bST中分離生物活性bST蛋白部分的非變性方法。
近來重組DNA技術(shù)促進(jìn)了bST的大規(guī)模生產(chǎn)。重組體微生物如重組體大腸肝菌在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生bST不溶粒。已知作為折射體成包涵體的這些不溶粒含有聚集的變性bST。這些折射體被回收并常用變性劑如鹽酸胍，十二烷基硫酸鈉或脲處理。變性劑將不適當(dāng)?shù)卣郫B的bST分子解開并使其增溶。之后，bST分子恢復(fù)形成適當(dāng)?shù)卣郫B的、生物活性的bST單體蛋白。
但是，由于這些變性和恢復(fù)步驟的效能差，也生成了某些不適當(dāng)折疊的聚集體及非生物活性的bST聚集體。因此，所得bST疏松材料既含生物活性的bST單體也含非生物活性的bST聚集體。因此，在質(zhì)量控制中建立一種測(cè)定bST效能的方法是非常重要的。
從前，bST效能由大鼠體重增加法評(píng)定。實(shí)質(zhì)上，檢測(cè)服用bST試樣的大鼠體重的增加，并由此數(shù)據(jù)得到表示bST效能的數(shù)值。但是，該測(cè)定不能用于常規(guī)分析中精確定量地表示bST。bST效能也可由放射受體分析法(RRA)來測(cè)定。但RRA過于耗時(shí)。而且，RRA精確度低，因而通常要作數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)，將其結(jié)果平均而得到bST效能值。
反相高效液相層析(RPHPLC)已被用于蛋白質(zhì)的測(cè)定，但是，大部分已使用過的RPHPLC法都不適于bST效能的測(cè)量，這是由于在其流動(dòng)相中使用可使bST變性的酸性介質(zhì)和有機(jī)溶劑。
使用含十二烷基硫酸鈉或鹽酸胍作為流動(dòng)相的粒度排阻(size exclusion)高效液相層析(“粒度排阻HPLC”)以前已被用于bST的測(cè)定。但是，由于其流動(dòng)相使bST變性，因而該方法不是生物效能測(cè)定法。
因此，需要一種便利的、準(zhǔn)確的和精密的非變性的測(cè)定bST的生物效能的方法。本發(fā)明致力于這些需要。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案提供了一種測(cè)定牛生長激素試樣的效能的方法。該方法包括通過以具有大約5μm到約15μm平均粒徑的親水多孔聚合物凝膠作為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素試樣是非變性的緩沖水溶液作為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC測(cè)量牛生長激素試樣中生物活性的牛生長激素蛋白的水平。牛生長激素試樣的效能可根據(jù)該試樣中所測(cè)的生物活性牛生長激素蛋白的水平而測(cè)定。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方案提供了一種將生物活性的牛生長激素部分從牛生長激素中分離的方法。該方法包括通過以具有大約5μm到約15μm平均粒子大小的親水多孔聚合物凝膠作為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素是非變性的緩沖水溶液作為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC從牛生長激素中分離生物活性的牛生長激素部分。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方案提供了一種處理疏松重組體牛生長激素，從疏松重組體牛生長激素中含有的非生物活性牛生長激素非共價(jià)可溶聚集體中分離生物活性的牛生長激素蛋白的方法。該方法包括將疏松重組體牛生長激素進(jìn)行經(jīng)過以具有大約5μm到約15μm平均粒子大小的親水性多孔聚合物凝膠作為固定相，以pH值約為8到12的、對(duì)牛生長激素是非變性的緩沖水溶液作為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC的步驟，以便從非生物活性牛生長激素非共價(jià)可溶聚集體中分離生物活性的牛生長激素。
本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)從非生物活性bST形式中便利分離生物活性bST蛋白的方法。該方法也很好地適用于bST樣品的效能的便利的、準(zhǔn)確和精密的測(cè)定。另外，使用本發(fā)明的方法首次實(shí)現(xiàn)了bST非共價(jià)可溶聚集體的分離和廣泛的檢定。本發(fā)明另外的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將由本文的描述而明顯地看出。
附圖的說明

圖1A為用下文實(shí)施例所述的方法的生物活性bST參比標(biāo)準(zhǔn)的粒度排阻HPLC色譜圖。
圖1B到1E為用下文實(shí)施例所述的方法的疏松重組體bST材料的粒度排阻HPLC色譜圖，并證明疏松材料中存在bST可溶聚集體。
圖2A為表示碳酸氫鹽緩沖液濃度對(duì)用下文實(shí)施例所述的方法的生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC的保留時(shí)間的影響的曲線圖。
圖2B為表示在下文實(shí)施例所述條件下碳酸氫鹽緩沖液濃度對(duì)生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC峰面積響應(yīng)值的影響的曲線圖。
圖3A為表示流動(dòng)相pH值的變化對(duì)用下文實(shí)施例所述的方法的生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC的洗脫時(shí)間的影響的曲線圖。
圖3B為表示流動(dòng)相pH值的變化對(duì)用下文實(shí)施例所述的方法的生物活性bST蛋白部分的粒度排阻HPLC峰面積響應(yīng)值的影響的曲線圖。
圖4為表示在下文實(shí)施例所述條件下數(shù)批不同的bST疏松重組體的放射性受體測(cè)定效能值(IU/mg)與粒度排阻HPLC測(cè)量的生物活性bST蛋白水平間相關(guān)性的曲線圖。
圖5為在下文實(shí)施例所述條件下標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)和生物活性bST蛋白(“B/A bST”)以及bST可溶聚集體(“Agg.”)的log MW對(duì)洗脫時(shí)間的粒度排阻HPLC校準(zhǔn)曲線。
圖6為表示在下文實(shí)施例所述條件下碳酸氫銨濃度對(duì)生物活性bST蛋白部分(“B/A bST”)和對(duì)包括bST可溶性聚集體的部分(“Agg.”)的粒度排阻HPLC峰面積響應(yīng)值影響的曲線圖。
圖7為表示在下文實(shí)施例所述條件下流動(dòng)相pH值對(duì)生物活性bST蛋白部分(“B/A bST”)和對(duì)包括bST可溶性聚集體的部分(“Agg.”)的粒度排阻HPLC峰面積影響的曲線圖。
圖8為表示在下文實(shí)施例所述條件下離心對(duì)生物活性bST蛋白部分(“B/A bST”)和包括bST可溶性聚集體的部分(“Agg.”)的粒度排阻HPLC峰面積影響的曲線圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的說明為了有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明的原理，這里給出其優(yōu)選實(shí)施方案作為參考并將使用特殊的語言描述之。不過，顯然這不是為了限制本發(fā)明的范圍，對(duì)于與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域的技術(shù)人員來說通?？梢酝瓿蛇@里所述的本發(fā)明原理的改進(jìn)、進(jìn)一步修改和應(yīng)用。
如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及從牛生長激素中分離生物活性牛生長激素部分的方法。這里使用的“牛生長激素”指具有天然牛生長激素性質(zhì)的天然或合成來源的物質(zhì)。牛生長激素可以從牛的適當(dāng)?shù)南俳M織，例如垂體腺中提取；或者，現(xiàn)已充分建立起了通過使用遺傳改進(jìn)微生物如桿菌合成牛生長激素和其他此類物質(zhì)。通常可便利地，甚至優(yōu)選地使用該方法生產(chǎn)改進(jìn)的牛生長激素，即該物質(zhì)結(jié)構(gòu)上不同于天然存在的生長激素，但它保留了天然存在的生長激素的生物活性。例如，改進(jìn)的牛生長激素可在多肽鏈的一端或兩端含有一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸。其他的改進(jìn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說容易理解。因此，本申請(qǐng)文件使用的術(shù)語牛生長激素既可以是天然存在的牛生長激素，也可以是具有天然存在的牛生長激素的生物性質(zhì)的、結(jié)構(gòu)相同或不同的、作合成方法制備的牛生長激素。
本發(fā)明優(yōu)選地使用通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的bST(“重組體bST”)。典型地，重組體bST通過將含重組體bST的包含體進(jìn)行分離、變性和加溶而得到。然后，將此bST復(fù)原生成生物活性bST蛋白。在變性/復(fù)原步驟過程中，非生物活性的bST非共價(jià)聚集體與所需的生物活性bST蛋白一起生成。通過超濾作用可從加溶的包含體中除去膠體和某些分子量很大的雜質(zhì)。但是，大量的非生物活性bST非共價(jià)聚集體通常和生物活性bST蛋白一起通過超濾器。結(jié)果是，最后得到的疏松重組體bST既含生物活性bST蛋白也含非生物活性bST可溶聚集體。本發(fā)明的方法可用來處理這種疏松重組體bST，使生物活性bST蛋白從非生物活性bST非共價(jià)可溶聚集體中分離。另外，這種分離可以以被用于提供疏松bST的效能的便利的、準(zhǔn)確和精密的測(cè)定的方式來實(shí)現(xiàn)。
重組體bST的兩個(gè)例子是叫作somidobove和sometribove的化合物。本發(fā)明特別優(yōu)選地使用這兩種重組體bST。
本發(fā)明的方法使用以親水性多孔聚合物凝膠作為固定相的粒度排阻HPLC。本發(fā)明優(yōu)選地使用平均粒徑約5μm到約15μm，更優(yōu)選約10μm到約15μm的多孔凝膠。一般地，凝膠的平均孔徑為約100到200埃，本發(fā)明優(yōu)選平均孔徑為約150埃的凝膠。另一方面，本發(fā)明所用的多孔凝膠優(yōu)選具有的排阻限平均分子量大于bST非共價(jià)可溶聚集體分子量，例如約106或更大，更優(yōu)選約107或更大。
本發(fā)明中使用的流動(dòng)相為pH值約8到約12的、不使bST試樣變性的緩沖水溶液。一般地，流動(dòng)相中的緩沖液可包括任何有效濃度，只要流動(dòng)相的離子強(qiáng)度保持足夠低，以避免使蛋白從bST試樣中鹽析即可。碳酸氫鹽(HCO3-)緩沖水溶液，例如碳酸氫銨水溶液，為優(yōu)選的流動(dòng)相。所需碳酸氫鹽緩沖液的濃度小于約0.7M，更優(yōu)選約0.1到約0.4M的范圍。流動(dòng)相的pH值更優(yōu)選約9到約11，最優(yōu)選約9到約10。
固定相被填充在常規(guī)HPLC柱上，該柱是常規(guī)粒度排阻HPLC裝置的元件。例如，粒度排阻HPLC裝置一般包括泵、緩沖水溶液儲(chǔ)蓄器、紫外(UV)吸收檢測(cè)器和流份收集裝置。
欲用本發(fā)明的方法處理的bST試樣優(yōu)選地在與作為流動(dòng)相所用的相同的緩沖水溶液中再生。試樣中bST的濃度宜為每毫升約0.05到約2毫克(mg/mL)。更優(yōu)選地，試樣中bST的濃度約為0.1mg/mL到約1mg/mL。
粒度排阻HPLC柱的壓力提供一個(gè)適于按本發(fā)明進(jìn)行分離的流速。當(dāng)然，達(dá)到適當(dāng)流速所需的壓力取決于固定相的粒子大小。在優(yōu)選的本發(fā)明方法中，用于粒度排阻HPLC的壓力及其導(dǎo)致的流速應(yīng)在約30分鐘內(nèi)完全洗脫掉生物活性bST蛋白部分，以便于測(cè)定。在這一點(diǎn)上，典型的柱壓約為500到約1500psi，更典型約800到約1000psi。
在申請(qǐng)人工作的另一方面，使用上述非變性粒度排阻HPLC法，將高分了量的bST可溶聚集體分離并廣泛地檢定。在圖1B和1C中，開始于大約9分鐘的峰漂移含這些高分子量bST可溶聚集體。根據(jù)粒度排阻HPLC的測(cè)定(圖5)，這些bST可溶聚集體的分子量大于660,000。根據(jù)放射性受體測(cè)定法的測(cè)定，bST可溶性聚集體無生物活性。
這種bST可溶性聚集體在溶液中的物質(zhì)也已被檢定。bST可溶性聚集體在pH值大于約8.5、小于約12的非變性緩沖水溶液中基本溶解(圖1D、1E和7)。在此pH值范圍之外，該可溶性聚集體從非變性緩沖水溶液中沉淀出。高鹽濃度也可導(dǎo)致bST可溶性聚集體沉淀(圖6)。例如，碳酸氫鹽濃度大于約0.7M時(shí)就能觀察到bST可溶性聚集體的鹽析。另外，在16,000倍重力(“16,000g”)下離心時(shí)，bST可溶性聚集體可在0.2M碳酸氫鹽緩沖溶液(pH9)中保持30分鐘或更長(圖8)。變性劑如十二烷基硫酸鈉和脲能使bST可溶性聚集體變性為單體bST。bST可溶性聚集體的這些特性及其他特性將在下文實(shí)施例中進(jìn)一步討論。
為了有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面提供具體的實(shí)施例。顯然，實(shí)質(zhì)上這些實(shí)施例是用于說明而非限制。
實(shí)施例化學(xué)藥品和試劑所有試劑都為分析試劑級(jí)的，使用時(shí)無需進(jìn)一步純化。水由Millipore Milli-Q水純化系統(tǒng)得到。bST參照標(biāo)準(zhǔn)和重組體bST疏松材料(somidobove)來自Eli Lilly and Company。粒度排阻HPLC層析條件一種具有很多親水基的(凝膠為交聯(lián)的羥基化的聚醚)，具有約10μm平均粒度的剛性多孔聚合物凝膠(商品名，BeckmanSpherogel TSK 3000PW柱(600×7.5mm，I.D.))被用于這些實(shí)施例中。除非另外指出，這里所述的分離用的流動(dòng)相為用NaOH調(diào)節(jié)pH值到9的0.2M碳酸氫銨。除非另外指出，所有分離都在室溫及0.5mL/min的流速(相應(yīng)的壓力范圍為約800到1000psi)下完成。試樣注射體積為20μL。大多數(shù)分離使用具有911+光電二極管排列探測(cè)儀和WISP 721自動(dòng)進(jìn)樣器的Waters 625 LC裝置進(jìn)行。但是，精度和線性研究在由Model 126溶劑輸送裝置，Model 166可變波長探測(cè)儀，和Model 507自動(dòng)進(jìn)樣器組成的Beckman System-Gold HPLC裝置上進(jìn)行。試樣的制備將試樣和標(biāo)準(zhǔn)物配制在流動(dòng)相中。除非另外指出，所有bST試樣制成濃度為1mg/mL bST。為最大限度地減少不溶解，將等分的流動(dòng)相加入到bST中并將試樣溶液在室溫下放置30分鐘。然后，將試樣溶液輕搖5至10分鐘。注射前將試樣溶液用Acrodisc0.45μm過濾器過濾。bST試樣的粒度排阻HPLC結(jié)果圖1A為生物活性重組體bST蛋白參比標(biāo)準(zhǔn)物的粒度排阻HPLC色譜圖，其中僅有一個(gè)含生物活性bST蛋白的單主峰。除流速為1mL/min外，圖1A的色譜圖由上述方法得到。圖1B和1C為不同批的重組體bST疏松材料的粒度排阻HPLC色譜圖。觀察到它們之間具有良好的基線分辨的兩個(gè)強(qiáng)峰。色譜的第一個(gè)洗脫峰(～9分鐘)含高分子量的bST可溶性聚集體，第二個(gè)洗脫峰(～13分鐘)為生物活性bST蛋白。
圖1D和1E為與用于制備圖1C色譜圖的相同疏松重組體bST的試樣的粒度排阻色譜圖。圖1D為流動(dòng)相pH值為11.3時(shí)的單一色譜圖。與圖1B一樣也觀察到兩個(gè)強(qiáng)峰。使用pH值范圍為7.9到12.2時(shí)的流動(dòng)相展開圖1E的疊加色譜圖。在所研究的較低和較高的pH值下的減小的峰面積響應(yīng)值顯示減小的bST可溶性聚集體的溶解度。更有利的是，本發(fā)明方法是使用在使bST可溶性聚集體的溶解度較高的pH值下的流動(dòng)相進(jìn)行的，例如，在約9到約12之間的pH值下進(jìn)行。
圖1B和1C批樣的其他粒度排阻HPLC色譜圖在相同的條件下得到，只是用了不同的非變性流動(dòng)相(0.05M硼酸鹽緩沖溶液)。所得的這些色譜圖與圖譜1B和1C的色譜圖相似，具有兩個(gè)強(qiáng)峰并在其間具有良好的基線分辨。因此，按照本發(fā)明，其他非變性緩沖水溶液也易于用粒度排阻HPLC分離。改變粒度排阻HPLC條件研究了改變碳酸氫銨濃度對(duì)粒度排阻HPLC中生物活性bST蛋白部分的洗脫時(shí)間的影響。一系列實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù)碳酸氫銨溶液的變化，生物活性bST蛋白給出一條典型的粒度排阻HPLC曲線(圖2A)。可以觀察到，當(dāng)碳酸氫銨濃度在約0.1M到約0.4M范圍時(shí)，洗脫時(shí)間只有輕微的變化。當(dāng)碳酸氫銨濃度大于約0.4M時(shí)，洗脫時(shí)間增加較快。另外，當(dāng)鹽(碳酸氫銨)濃度增加到約0.7M以上時(shí)，bST峰面積明顯地減小(圖2B)。因此，本發(fā)明優(yōu)選的粒度排阻HPLC方法使用流動(dòng)相中碳酸氫鹽濃度低于約0.7M來進(jìn)行。
流動(dòng)相pH值的變化對(duì)生物活性bST蛋白部分粒度排阻HPLC洗脫時(shí)間和峰面積的響應(yīng)值的影響也進(jìn)行了研究。在約7.5到約10.5的范圍內(nèi)增加0.2M碳酸氫銨流動(dòng)相的pH值對(duì)bST洗脫時(shí)間無影響；但是，在相同的pH值范圍內(nèi)，峰面積響應(yīng)值略有增大(圖3A、3B)。
此項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，最有利的粒度排阻HPLC流速為約0.5mL/min。0.3mL/min的流速也是適用的，并且是等效的，但要幾乎兩倍的操作時(shí)間。在1mL/min的流速下，生物活性bST蛋白峰與空隙峰重疊。bST試樣的非變性為了證明本發(fā)明的方法對(duì)bST是非變性的，將參比標(biāo)準(zhǔn)物(見圖1A)中的生物活性bST蛋白部分收集并通過RRA測(cè)定其生物活性。結(jié)果表明在流動(dòng)相中收集的生物活性bST蛋白組分保持了與經(jīng)粒度排阻HPLC處理前的母體溶液相同的生物活性。
在數(shù)個(gè)不同批量的重組體疏松bST的實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)了通過本發(fā)明粒度排阻HPLC法測(cè)定的生物活性bST蛋白水平與通過RRA測(cè)定的效能數(shù)據(jù)(I.U./mg)之間有很強(qiáng)的聯(lián)系。由粒度排阻HPLC法和RRA所得數(shù)據(jù)的線性回歸曲線如圖4所示。數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)是0.845。這些結(jié)果清楚地證實(shí)，本發(fā)明的粒度排阻HPLC法可用于bST疏松材料的效能值的測(cè)定。也就是，本發(fā)明粒度排阻HPLC法可用于測(cè)定未知效能的bST試樣中的生物活性bST蛋白的水平(例如，以峰面積百分率表示)。然后，可將測(cè)定的試樣中的生物活性bST蛋白水平，給制成與圖4相似的已校準(zhǔn)曲線，包括對(duì)bST對(duì)照組用RRA和粒度排阻HPLC測(cè)定的數(shù)據(jù)。RRA數(shù)據(jù)與通過其他方法，如已知的大鼠重量增加法，得到的生物效能數(shù)據(jù)密切相關(guān)。因此，粒度排阻HPLC結(jié)果可與通過其他已知的bST生物效能測(cè)定法得到的數(shù)據(jù)具有同樣的聯(lián)系。方法的線性和精確度本發(fā)明粒度排阻HPLC法的線性可通過在流動(dòng)相中制備各種濃度的生物活性bST蛋白參比標(biāo)準(zhǔn)物而測(cè)定。將bST濃度范圍為0.1到1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用粒度排阻HPLC處理三次，并對(duì)所得數(shù)據(jù)作線性回歸分析。不同的三天中使用不同的三根柱子得到的線性的可重復(fù)性如表1所示。相關(guān)系數(shù)的范圍為從0.9998到1.000，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(R.S.D)為1.36％。
表1斜度306600301200311400R.S.D.％0.60 1.51 0.77Y-截距 -3940 -2050 -3270相關(guān)系數(shù)1.00000.99980.9999本發(fā)明粒度排阻HPLC法的精確度可在三天內(nèi)使用兩套不同的HPLC裝置、三根不同系列號(hào)的柱子、以及三批不同量的bST疏松材料來評(píng)定。如表2所示的所得數(shù)據(jù)，證明所測(cè)的生物活性bST蛋白的R.S.D.值小于2.8％，洗脫時(shí)間的可重復(fù)性為R.S.D.值小于0.18％。
表2Beckman裝置 Waters裝置批 天 n％bST ％RSD te％RSD ％bST ％RSD te ％RSD001 1 383.5 0.70 851 0.1283.8 2.67 827 0.072 381.7 1.27 831 0.0983.7 0.91 846 0.073 382.7 0.75 822 0.10002 1 387.1 2.23 849 0.1886.1 2.80 824 0.152 38 6.1 2.72 830 0.0686.7 2.56 850 0.093 388.9 1.34 824 0.10003 1 344.9 0.47 853 0.0844.5 2.40 827 0.102 346.3 1.14 837 0.1346.9 1.32 854 0.173 346.8 0.75 829 0.10n＝重復(fù)次數(shù)te＝保留時(shí)間(以秒計(jì))RSD＝相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差通過向兩批不同的bST疏松材料中以兩種不同的濃度加入生物活性bST蛋白參比標(biāo)準(zhǔn)物可進(jìn)行bST回收率的研究。在該實(shí)驗(yàn)中得到的回收率的范圍為101-104％(表3)。
表3加入的參試樣 比標(biāo)準(zhǔn)物 實(shí)測(cè)值n回收率 RSD(mg)(mg) (％) (％)003A 0.1860.191 3102.5％0.34003A 0.4650.471 3101.2％0.58003B 0.1860.193 3103.8％0.90003B 0.4650.472 3101.4％0.72n＝重復(fù)次數(shù)RSD＝相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差上述結(jié)果證明，本發(fā)明粒度排阻HPLC法可精確而精密地測(cè)定bST疏松材料中的bST效能。bST可溶性聚集體的特性如上所示，在約13分鐘處的峰表示生物活性bST蛋白部分，而在約9分鐘處的峰表示bST可溶性聚集體部分(圖1B-1E)。在另外的工作中，粒度排阻HPLC法中光電二極管排列探測(cè)儀測(cè)出的UV光譜證明，生物活性bST蛋白部分與bST可溶性聚集體部分具有相似的UV曲線。bST可溶性聚集體在250-270nm處有一個(gè)UV光譜變化，可能是由于聚集后芳香氨基酸環(huán)境變化所致。
bST可溶性聚集體的分子量可通過粒度排阻HPLC作校準(zhǔn)曲線而測(cè)量。結(jié)果如圖6所示。bST可溶性聚集體由于被排斥在柱體積外而洗脫，它的分子量(MW)超過660,000(甲狀腺球蛋白thyroglobumin的MW)。
為了進(jìn)一步檢定bST可溶性聚集體，將疏松的bST溶于0.4M碳酸氫銨(pH9)中，使其成為5mg/mL溶液。于16,000g離心后，在除流動(dòng)相為0.4M碳酸氫銨溶液外的上述標(biāo)準(zhǔn)粒度排阻HPLC條件下處理上清液，該分離步驟中得到的兩個(gè)組分，生物活性bST蛋白和bST可溶性聚集體，被收集于單獨(dú)的流份中。將每個(gè)收集的流份再次用色譜法分析以證實(shí)其洗脫時(shí)間和純度。結(jié)果證明甚至離心后，bST聚集體仍留在溶液中。
可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)bST可溶性聚集體是以非共價(jià)鍵鍵合的。如果bST可溶性聚集體是非價(jià)鍵鍵合的蛋白，那么它可在變性劑如洗滌劑、高濃度脲和鹽酸脲溶液存在下離解成單體。為了證實(shí)之，將收集到的bST可溶性聚集體流份與2％十二烷基硫酸鈉(SDS)的1∶1昆合物用包括du pont 250柱的裝置和含1％SDS的0.4M碳酸氫鹽流動(dòng)相進(jìn)行層析。正如所預(yù)期的那樣，解離的蛋白的色譜曲線和UV色譜與相同實(shí)驗(yàn)條件下得到的SDS單體的相同。同樣的實(shí)驗(yàn)可證明，bST可溶性聚集體也可被3M脲所解離。
溶液中bST可溶性聚集體的其他性質(zhì)也已被研究。溶液中鹽的濃度可強(qiáng)烈地影響bST可溶性聚集體的溶解度。如圖6中所示，除了在制備的試樣和流動(dòng)相中的碳酸氫銨濃度變化外，在上述條件下進(jìn)行的粒度排阻HPLC所示，由于蛋白的鹽析作用，增加碳酸氫鹽濃度可敏銳地降低可溶性聚集體的溶解度。同樣，碳酸氫鹽緩沖溶液pH值對(duì)bST可溶性聚集體的溶解度的影響也進(jìn)行了研究。當(dāng)pH值小于8.5及pH大于12.5時(shí)，bST可溶性聚集體從0.2M碳酸氫鹽溶液中沉淀出。從pH8.5開始，bST可溶性聚集體的溶解度隨pH值的增加而增加，在pH9.5時(shí)達(dá)到最大(圖7)。
可溶性聚集體在碳酸氫鹽溶液中的穩(wěn)定性也被研究。分離出的bST可溶性聚集體溶液可在4℃穩(wěn)定兩天，在室溫穩(wěn)定9小時(shí)以上(通過在上述時(shí)間內(nèi)測(cè)量粒度排阻HPLC峰面積而測(cè)定)。另外，當(dāng)在16,000g離心時(shí)，bST可溶性聚集體可在溶液中至少保持30分鐘(圖8)。
整個(gè)發(fā)明在前述中已被詳細(xì)地說明和描述，上述內(nèi)容本質(zhì)上應(yīng)被看作是說明性的而非限制性的，顯然，已被描述的僅僅是優(yōu)選方案，而在本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)內(nèi)的所有變化和改良都應(yīng)該被保護(hù)。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1.一種測(cè)定牛生長激素的效能的方法，其中包括通過以平均粒子直徑約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素試樣非變性的緩沖水溶液為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC測(cè)量牛生長激素試樣中的生物活性牛生長激素蛋白的水平；以及根據(jù)測(cè)得的生物活性牛生長激素蛋白水平測(cè)定牛生長激素試樣的效能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的緩沖水溶液為碳酸氫鹽緩沖溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的測(cè)定包括在牛生長激素對(duì)照試樣的RRA效能值與粒度排阻HPLC數(shù)據(jù)相關(guān)的校準(zhǔn)曲線上標(biāo)繪上述生物活性bST蛋白的測(cè)量水平。
6.根據(jù)根據(jù)要求4的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm的平均粒子大小。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中流動(dòng)相的pH值約為9到約11。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中流動(dòng)相為濃度小于約0.7M的碳酸氫銨緩沖溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
14.一種從牛生長激素試樣中的非生物活性牛生長激素部分中分離生物活性牛生長激素部分的方法，其中包括將牛生長激素通過以平均粒子大小約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠為固定相，以pH值約為8到約12的緩沖水溶液為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC層析，從非生物活性牛生長激素中分離生物活性牛生長激素部分，上述流動(dòng)相對(duì)牛生長激素是非變性的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的緩沖水溶液為碳酸氫鹽緩沖溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中流動(dòng)相的pH值約為9到約11。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中流動(dòng)相為濃度小于約0.7M的碳酸氫銨緩沖溶液。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800至約1000psi的壓力下進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
24.一種處理疏松重組體牛生長激素，從在疏松重組體牛生長激素中含有的非生物活性牛生長激素非共價(jià)可溶性聚集體中分離生物活性的牛生長激素蛋白的方法，其中包括將疏松重組體牛生長激素通過以平均粒子大小約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素非變性的緩沖水溶液為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC層析，以便從非生物活性的牛生長激素非共價(jià)可溶性聚集體中分離生物活性牛生長激素。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說的緩沖水溶液是碳酸氫鹽緩沖溶液。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說的粒度排阻HPLC是在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行的。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中流動(dòng)相的pH值約為9到約11。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中流動(dòng)相為濃度小于約0.7M的碳酸氫銨緩沖溶液。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定牛生長激素的效能的方法，其中包括通過以平均粒子直徑約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素試樣非變性的緩沖水溶液為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC測(cè)量牛生長激素試樣中的生物活性牛生長激素蛋白的水平；以及根據(jù)測(cè)得的生物活性牛生長激素蛋白水平測(cè)定牛生長激素試樣的效能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的緩沖水溶液為碳酸氫鹽緩沖溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的測(cè)定包括在牛生長激素對(duì)照試樣的RRA效能值與粒度排阻HPLC數(shù)據(jù)相關(guān)的校準(zhǔn)曲線上標(biāo)繪上述生物活性bST蛋白的測(cè)量水平。
6.根據(jù)根據(jù)要求4的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm的平均粒子大小。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中流動(dòng)相的pH值約為9到約11。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中流動(dòng)相為濃度小于約0.7M的碳酸氫銨緩沖溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
14.一種從牛生長激素中分離生物活性牛生長激素部分的方法，其中包括通過以平均粒子大小約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素非變性的緩沖水溶液為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC從牛生長激素中分離生物活性牛生長激素部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的緩沖水溶液為碳酸氫鹽緩沖溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中流動(dòng)相的pH值約為9到約11。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中流動(dòng)相為濃度小于約0.7M的碳酸氫銨緩沖溶液。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所說的粒度排阻HPLC在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
24.一種處理疏松重組體牛生長激素，從在疏松重組體牛生長激素中含有的非生物活性牛生長激素非共價(jià)可溶性聚集體中分離生物活性的牛生長激素蛋白的方法，其中包括將疏松重組體牛生長激素通過以平均粒子大小約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠為固定相，以pH值約為8到約12的、對(duì)牛生長激素非變性的緩沖水溶液為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC層析，以便從非生物活性的牛生長激素非共價(jià)可溶性聚集體中分離生物活性牛生長激素。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說的緩沖水溶液是碳酸氫鹽緩沖溶液。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約10μm到約15μm的平均粒子大小。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所說的粒度排阻HPLC是在約800到約1000psi的壓力下進(jìn)行的。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中流動(dòng)相的pH值約為9到約11。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中流動(dòng)相為濃度小于約0.7M的碳酸氫銨緩沖溶液。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所說的親水性多孔聚合物凝膠具有約150埃的平均孔徑。
全文摘要
描述了一種測(cè)定牛生長激素效能的方法。通過以平均粒子直徑約為5μm到約15μm的親水性多孔聚合物凝膠作為固定相，以對(duì)牛生長激素試樣非變性的pH值約為8到約12的緩沖水溶液作為流動(dòng)相的粒度排阻HPLC測(cè)量牛生長激素試樣中的生物活性牛生長激素蛋白的水平。根據(jù)所測(cè)生物活性牛生長激素蛋白的水平來測(cè)定牛生長激素試樣的效能。該方法可便利、準(zhǔn)確和精密地測(cè)量bST樣品的效能。
文檔編號(hào)G01N33/483GK1119042SQ94191402
公開日1996年3月20日 申請(qǐng)日期1994年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月26日
發(fā)明者J·P·張 申請(qǐng)人:伊萊利利公司