專利名稱:鑒定制造粘蛋白抗原細(xì)胞的方法
本發(fā)明是涉及鑒別制造粘蛋白抗原細(xì)胞的方法，包括從病人體內(nèi)取出生理液，再使它與小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原的單克隆或多克隆抗體接觸以鑒別細(xì)胞中粘蛋白抗原是否存在。這種技術(shù)對在探查與癌有關(guān)物質(zhì)為目的的試驗對鑒別健康人與得癌人之間的差異是有很大幫助的。
癌胚抗原(CEA)是研究得最廣泛的與胃腸癌有關(guān)的抗原，事實上也是在所有與腫瘤有關(guān)的抗原研究得最多的。這種抗原存在人胎兒腸胃道中，但不存在或以很少量存在于正常成人結(jié)腸中。癌胚抗原是1956年首先被哥德(Gold)和弗里得曼(Freedman)在人結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的(見參考文獻(xiàn)9)。癌胚抗原出現(xiàn)這種癌病人的血液中，起初被看作成胎抗原，認(rèn)為它很有希望用于人消化系統(tǒng)癌癥的早期診斷。逐漸人們發(fā)現(xiàn)血液的癌胚抗原試驗的特異性對早期診斷胃腸道癌沒有足夠的價值，因為它常常導(dǎo)致包括吸煙者支氣管炎和肝病的新生彈性狀態(tài)的增高數(shù)目(見參考文獻(xiàn)10)。例如10%的正常人顯示了假陽性結(jié)果，這些人血液中癌胚抗原雖然增加了，但并沒有患癌，甚至連良性瘤也沒有(見參考文獻(xiàn)11～13)，就是說也有大量的假陽性率(大約有50%的腸胃道癌病人血液中癌胚抗原水平未顯示提高)。盡管有些局限，癌胚抗原試驗對癌癥患者的手術(shù)前估計和手術(shù)后仍有相當(dāng)?shù)膬r值。癌胚抗原試驗占現(xiàn)代癌診斷的大約40%。
α-胚蛋白(AFP)是在胎兒中大量存在而在正常成人中幾乎沒有的另一種成胎抗原。原發(fā)性肝癌，繼發(fā)肝性肝癌及大多數(shù)各種類型型睪丸癌的患者血液中α-胚蛋白都增加了。但在中毒性肝損傷和肝硬變病人血中α-胚蛋白也增加。盡管它的有用性也是有限的，但α-胚蛋白測定相當(dāng)于占癌診斷的大約20%。
最近，基于單克隆抗體的放射免疫學(xué)測定與腫癌有關(guān)的CA19-9TM抗原已經(jīng)可以在市場上買到。這種CA19-9TM抗原試驗已被證實對胰腺癌各個階段都有很高敏感性和特異性，但對結(jié)直腸(Colorectal)癌，這種抗原試驗敏感性似乎較低。
1980年從大腸癌中分離出一種新的粘糖蛋白抗原(見參考文獻(xiàn)1)，這種物質(zhì)也存在于正常成人的小腸，故被命名為“小腸粘蛋白抗原(SIMA)。小腸粘蛋白抗原是一種成胎抗原，8-12周胎兒的整個胃腸道都可發(fā)現(xiàn)它，到嬰兒誕生時正常情況下它就只在小腸中存在了，但在胃腸道和其它器官的很多部位的癌中卻發(fā)現(xiàn)了小腸粘蛋白抗原。另一種稱作“大腸粘蛋白抗原”(LIMA)的粘蛋白物質(zhì)也從正常大腸中分離出來。大腸粘蛋白抗原也是一種成胎抗原，很很多癌都不同程度地產(chǎn)生它。廣泛的組織免疫學(xué)研究證實大腸粘蛋白抗抗原性質(zhì)上不同于小腸粘蛋白抗原，大、小腸粘蛋白抗原兩者也區(qū)別于癌胚抗原。這些與腸道有關(guān)的粘蛋白抗原在胃、膽囊、肺、乳腺，口腔一些腫瘤及上述器官的潛惡狀態(tài)細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)存在。(見參考文獻(xiàn)1-8)。
用抗小腸粘蛋白抗原和抗大腸粘蛋白抗原的單克隆和多克隆抗體給正常胎兒和成人組織及不同器官的癌免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果示在在表1。
表1人組織中的小腸粘蛋白抗原(SIMA)及大腸粘蛋白抗原(LIMA)的免疫組織化學(xué)研究小結(jié)。
胎兒組織(8-40周) SIMA LIMA胃 + +小腸 + -大腸 8-12周 + -13-40周 - +正常成人組織胃 - -小腸 + -大腸 - +膽囊 - -口腔 - -乳腺 - -肺 - +癌結(jié)腸癌 + +胃癌 + +口腔癌 + +膽囊癌 + +乳腺癌 + -肺癌 - +
首先發(fā)現(xiàn)，盡管這些粘糖蛋白分子量很小，但應(yīng)用抗體試驗大部分患大腸癌的病人血清都可測出小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原。而在健康人對照血清中測不到或只能發(fā)現(xiàn)很少量小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原。開始用一小組病例的研究已經(jīng)表明。小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原試驗結(jié)合使用能診斷出80%的這種癌患者，而用癌胚抗原只能診斷出56%的這種癌患者。這兩種腸粘蛋白抗原在診斷B和C階段癌(Duke氏分級)也比癌胚抗原試驗更為敏感。此外，在大多數(shù)直腸潰瘍性結(jié)腸炎患者的血中也發(fā)現(xiàn)了大腸粘蛋白抗原。這些病人一般都發(fā)展成大腸癌。同樣地，小腸粘蛋白抗原與大腸粘蛋白抗原都可以診斷癌的先兆狀態(tài)。
本說明書中所用的小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原術(shù)語不僅限于下面詳述的粘蛋白抗原，而且也包括其它抗原性質(zhì)有關(guān)的可能在生理液，特別是血清或血漿中存在的部分。
根據(jù)本發(fā)明，提供一個體外診斷有癌細(xì)胞或其它產(chǎn)生粘蛋白抗原細(xì)胞的病人的方法。該方法包括從病人體內(nèi)取出生理液樣品，測定它是否有大腸粘蛋白抗原(和)或小腸粘蛋白抗原的步驟。
最可取的方法包括先從病人體內(nèi)取出生理液，再使它與小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原的單克隆或多克隆抗體接觸，或與該抗體一部分片段接觸或與標(biāo)記了的該抗體或抗體一部分片段接觸，這種標(biāo)記可以為以后診斷提供探查信號。從而可以測定該抗體，抗體片段或標(biāo)記了的抗體及其片段是否與相應(yīng)的抗原結(jié)合。
用于這種診斷特別可取的生理液是血液。血清或血漿。
另外，還提供了體外診斷的裝置和系統(tǒng)，以測定病人體內(nèi)癌細(xì)胞或其它產(chǎn)生粘蛋白抗原細(xì)胞是否存在，這套裝置或系統(tǒng)也包括了探查病人生理液樣品中小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原是否存在的手段。
特別是本發(fā)明還提供了以病人血液，血清作為生理樣品時體外測定小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原存在與否的裝置或系統(tǒng)。這套裝置或系統(tǒng)包括與兩種腸粘蛋白抗原起免疫反應(yīng)的單克隆或多克隆抗體及它們的片段，以及顯示所說抗體和它們相應(yīng)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的指示方法。
特別是在本發(fā)明實施中。診斷系統(tǒng)更進(jìn)一步包括一種與固體支撐物連接的組分，該組分即含有(Ⅰ)小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原或(Ⅱ)能與這兩種之一或兩種抗原都能起免疫反應(yīng)的抗體。
這方面還包括一系統(tǒng)用不同形式指示方法的實例。一種是含有一種標(biāo)記，這種標(biāo)記提供了可探查的信號，這種標(biāo)記與和小腸粘蛋白抗原及大腸粘蛋白抗原或二者之一起免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合。另一種指示方法是含有一種提供可探查信號的標(biāo)記，這種標(biāo)記與和小腸粘蛋白抗原及大腸粘蛋白抗原起免疫反應(yīng)的第二抗體結(jié)合，所謂第二抗體激活了所述第一抗體，指示發(fā)生了與第一抗體結(jié)合的免疫反應(yīng)。進(jìn)而，指示方法可包括含有標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白。在任何實施中所用的標(biāo)記物可能包括已知的酶，放射性成分，熒光化合物或諸如生物素等化合物。
用免疫試驗測人腸粘蛋白抗原及大腸粘蛋白抗原能在直腸癌各個階段測定這些粘蛋白抗原。測定結(jié)果使得這個系統(tǒng)比CA19-9TM抗原試驗或癌胚抗原試驗更有用和更有價值。
本發(fā)明所用小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原免疫學(xué)試驗除了主要用于診斷粘膜癌以外，對診斷諸如結(jié)腸炎或胃潰瘍等炎癥及癌的先兆均有價值。
如上述是顯而易見的，粘蛋白抗原SIMA和LIMA首先可以從分離它的來源來定性(用下面詳述的方法)。進(jìn)而可以用小腸粘蛋白抗原及大腸粘蛋白抗原的單克隆和多克隆抗體及免疫組織化學(xué)技術(shù)來鑒別和定性，例如“競爭”免疫試驗技術(shù)，用抑制抗小腸粘蛋白抗原與特異性胃腸組織結(jié)合來測定抗原活性。
下面將進(jìn)一步說明本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的小腸和大腸粘蛋白抗原免疫學(xué)試驗，提供了探測病人癌細(xì)胞和其它產(chǎn)生粘蛋白抗原的細(xì)胞高靈敏度的診斷工具。特別是在手術(shù)前為估計腫癌范圍和外科手術(shù)及其它理療(例如放射治療，化療)后的基本數(shù)據(jù)以在可治療階段檢測復(fù)發(fā)率和監(jiān)測治療效果。本發(fā)明的診斷系統(tǒng)可以首先與癌胚抗原或其它已知的現(xiàn)在正使用著的與腫瘤有關(guān)抗原的免疫學(xué)試驗結(jié)合使用。此外，小腸粘蛋白抗原/大腸粘蛋白抗原(最好與癌胚抗原結(jié)合)診斷系統(tǒng)可用于普查有發(fā)展或腸道癌危險的人，例如潰瘍性結(jié)腸炎及胃潰瘍病人，在這個領(lǐng)域初次檢測后只用癌胚抗原試驗是沒有診斷價值的。
在本發(fā)明中，通過從大腸癌中提取的粘蛋白制劑使老鼠免疫生產(chǎn)了幾種單克隆抗體，用在組織中的免疫組織化學(xué)染色給這些單克隆抗體分類。與類抗小腸粘蛋白抗原的抗體(與大腸癌和正常大腸反應(yīng))。免疫化學(xué)分析表明每類抗體的親和性和差異達(dá)百倍。
下面的例子說明粘蛋白抗原的制備和特性，用于制造小腸和大腸粘蛋白抗原的多克隆和單克隆抗體的方法及根據(jù)本發(fā)明用這些單克隆抗體，體外診斷是否存在癌細(xì)胞或產(chǎn)生其它粘蛋白抗原的細(xì)胞。
例1A.粘蛋白抗原的純化和特性粘蛋白是從切除直腸癌組織得到樣品提取出來的。從摘除腫瘤的組織得到正常大腸末端到腫瘤的區(qū)域，在用以前先用光學(xué)顯微鏡檢查以證實它正常狀態(tài)。從偶然傷亡的人的尸解中得到正常十二指腸，空腸和結(jié)腸的樣品。從結(jié)腸癌(提取LIMA和SIMA)。正常大腸(提取LIMA或正常十二指腸?？漳c(提取SIMA)的樣品中用下述程序提取粘蛋白。
用于使老鼠免疫以生產(chǎn)單克隆抗體和篩選的粘蛋白制品是從組織學(xué)診斷作為“部分粘膜”的乙狀結(jié)腸的腺癌樣品制備的。把這樣品組織(大約5克)切成小塊，用10體積的含24mM EDTA，10mM的N-乙基順丁烯二酰亞胺，1mM的鹽酸苯芐脒的4M鹽酸胍均漿。然后在20，000×g下離心20分鐘，再用新鮮鹽酸胍萃取一次，離心得到沉淀，把含有粘蛋白的上清液再用氯化調(diào)至密度為1.35克/毫升，在105，000×g下離心64小時。得到的梯度分離成六個等分，密度范圍從1.25-1.55克/毫升。每份都在蒸餾水中透析，測定蛋白質(zhì)(用修改的Bradford方法)和已糖(參見文獻(xiàn)21)以及用抗-SIMA和抗-LIMA的抗體來測定其抑制胃腸道組織的免疫熒光染色能力，從而確定其抗原活性，和用單克隆抗體的免疫學(xué)試驗(詳見下)來確定它的抗原活性。把含有最高抗原活性的部分再在氯化銫梯度中分級分離，重復(fù)以上測定。
(1)大腸粘蛋白抗原(LIMA)大腸粘蛋白抗原位于梯度下部第2或第3部分，密度在1.30-1.55毫/毫升。大腸粘蛋白制劑是多分散的，但通常大約在1.4±0.08處發(fā)現(xiàn)最高抗原活性。大腸粘蛋白抗原制劑典型的第三次氯化銫梯度離心的每個分級部分都具有抗原活性，已糖和蛋白質(zhì)含量示在圖1a，第2和第3部分的已糖/蛋白質(zhì)比率(W/W)分別是0.5和0.25。已糖，蛋白質(zhì)的峰與抗原活性并不一致，第3部分含有大部分抗原活性。根據(jù)與酶連結(jié)的免疫學(xué)試驗(EIA)測定，從一個典型試驗中得到的大腸粘蛋白抗原總量為組織均漿液的大約35%。大腸粘蛋白抗原純化后達(dá)到千倍。在從正常大腸得到的大腸粘蛋白抗原制劑中一般測不到小腸粘蛋白抗原。在三明治免疫試驗中(即同一單克隆抗體必須與特定分子結(jié)合一次以上)，成功的應(yīng)用大腸粘蛋白抗原制劑說明了為單克隆抗體辯認(rèn)的抗原決定因子必須在特定分子上至少重復(fù)兩次。
大腸粘蛋白抗原不能透過7%聚丙烯酰胺電泳說明它的分子量很大，進(jìn)一步用凝膠過濾層析研究表明從Sepharose6B瓊脂糖空隙能洗脫出大腸粘蛋白抗原(它可以分離分子量約為1×104-4×106范圍的球蛋白和分子量約為104-106即藥用級的規(guī)格，Sepharose2B也可洗出LIMA(可分離分子量為7×104-4×107球蛋白和105-2×107的葡聚糖)。大腸粘蛋白抗原在Sephacryl 1000柱(1厘米×65.5厘米)上層析，用10mM的磷酸鹽緩沖液洗脫(可分離分子量在5×105-108的葡聚糖)洗脫曲線見圖2a。大部分的大腸粘蛋白抗原的抗原活性在該基質(zhì)上，洗脫后出現(xiàn)寬峰可能說明大腸粘蛋白抗原制備物的多分散性。還發(fā)現(xiàn)很多其它蛋白多糖分子與LIMA有相似的多分散度，這可能是由于其結(jié)構(gòu)或凝集程度的變化影響分子量結(jié)果，但它們均無上述抗原分子的抗原性。
為了更好地估算大腸粘蛋白抗原的大小，把一系列制備物放入甘油梯度(10%-20%)進(jìn)行超速離心以確定其沉降系數(shù)(用Beckman SW50Ti轉(zhuǎn)頭，以22，000轉(zhuǎn)/分，離心15小時或用42，000轉(zhuǎn)/分離心5小時，離心在4℃恒溫下進(jìn)行)。離心后梯度分級分離，取每部分在三明治試驗系統(tǒng)進(jìn)行抗原活性試驗。一個典型的大腸粘蛋白抗原梯度表示在圖3a。從各個離心參數(shù)計算平均分子量的沉降系數(shù)S值，可根據(jù)下式
其中w是角速度，t是離心時間(小時)，Ro是由轉(zhuǎn)軸到梯度頂部的半徑，Rt是由轉(zhuǎn)軸到除去有抗原性峰的梯度部分的平均半徑。從幾個不同試驗計算得到S值為9.5±1.5。
為進(jìn)一步得到大腸粘蛋白抗原性質(zhì)的資料對它進(jìn)行了一系列的物理，化學(xué)及酶學(xué)測定。這些結(jié)果總結(jié)在表2中。在三明治試驗中大腸粘蛋白抗原的抗原性是穩(wěn)定的，它可在40℃下至少貯存1個月，在100℃下至少貯存5分鐘。煮沸10分鐘或更長些時間損失40%活性。大腸粘蛋白抗原對煮沸的穩(wěn)定性意味著這種抗原是一系列糖基化的分子，而抗原決定基包括碳水化合物或為碳水化合物所保護(hù)。把大量腸粘蛋白抗原用堿處理以切開其碳水化合物和蛋白質(zhì)之間的O-配糖鍵，分別用0.01M，0.05M，0.10M，0.25M，0.50M的KOH處理(在4℃下處理2，4或16小時)，處理后分別保留85%，70%，55%和45%的抗原活性。加入諸如0.1M的2-巰基乙醇等親核劑，可以在較溫和的條件(0.01MKOH，4℃，處理4小時)下發(fā)生β-消除反應(yīng)，結(jié)果損失55%抗原活性。加之上述由于堿處理LIMA損失的部分抗原性，在甘油梯度上分析顯示了平均分子量的分子沉降系數(shù)S值明顯地降低(5.5)。這說明其分子量降低了(見圖3a)欲使大腸粘蛋白抗原還原，在6M鹽酸胍，0.5MN-三(羥甲基)氨基甲烷PH8.1，0.002M乙二胺四乙酸，10mM二硫蘇糖醇在50℃下處理2，4或16小時，再用0.4M碘乙酸在4℃下過夜烷基化，對其抗原性沒有明顯影響。
用一些高純度酶酶解它以測定LIMA抗原的化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)行免疫試驗前把處理后樣品煮沸5分鐘或中和，用于胃蛋白酶以純化酶。用一系列濃度的酶與LIMA恒溫反應(yīng)2，4或16小時，試驗結(jié)果表明，不管是胃蛋白酶還是梭菌蛋白酶(clostzipain)對大腸粘蛋白抗原的抗原活性都沒有任何明顯的作用。(見表2)大腸粘蛋白抗原用木瓜蛋白酶消化(0.1或1.0毫克/毫升)在三明治試驗中經(jīng)過2，4或16小時消化后抗原活性明顯喪失，僅剩20%。在競爭性ELISA試驗中(該試驗并不取決抗原上決定基的多價效應(yīng))。用木瓜蛋白酶消化2小時活性保留75%，4小時后65%，16小時后35%。這意味著在木瓜蛋白酶消化的溫和條件下，大腸粘蛋白抗原可以降解成大部分都僅含一個抗原決定基的碎片，而這在三明治試驗中是測不出的，只有在競爭試驗中才能測出。其結(jié)果證明該抗原對木瓜蛋白酶有一定敏感性，但基本上是抗胃蛋白酶和梭菌蛋白酶的。
(Ⅱ)SIMA(小腸粘蛋白抗原)SIMA存在于密度1.29g/ml與1.45g/ml之間的2個或者3個部分，分布比較廣，但是大部分抗原活性存在于密度1.38±0.05的地方。圖1b表示小腸粘蛋白抗原的典型CSCl(氯化銫)密度梯度離心中的第三部分中各組分的抗原性，己糖和蛋白質(zhì)的含量?？乖钚约械?，4兩部分，己糖和蛋白質(zhì)比值。(Wt/Wt即重量/重量)分別是1.5和0.3，通過EIA測定得知，從典型的結(jié)腸癌樣品中可以得到大約40%的小腸粘蛋白抗原。類似LIMA的提純，通過這些程序大約可以提純1000倍左右。象小腸粘蛋白抗原一樣，大多數(shù)的結(jié)腸直腸癌組織中也含有相當(dāng)多的大腸粘蛋白抗原，而在正常的十二指腸和空腸的提取物中只有發(fā)現(xiàn)有小腸粘蛋白抗原，沒有發(fā)現(xiàn)大腸粘蛋白抗原。混雜的粘蛋白提取物通過抗大腸粘蛋白抗原單克隆抗體親合層析柱，可以從結(jié)腸直腸癌的小腸粘蛋白抗原樣品中除去大腸粘蛋白抗原。通過單克隆或多克隆抗體的小腸免疫熒光染色的抑制作用及其與單克隆抗體的反應(yīng)來鑒定制備中的小腸粘蛋白抗原。象對大腸粘蛋白抗原的敘述一樣，SIMA在三明治免疫測定中的應(yīng)用，表明了抗原部分上某個抗原決定部位的存在。
如大腸粘蛋白抗原的情況一樣，小腸粘蛋白抗原不能透過7%的聚丙烯酰胺電泳凝膠。不過用SePharose 2B凝膠柱(1.5cm×7cm)分析，凝膠中顯示出小腸粘蛋白抗原的存在并且分布廣泛，分子量比大腸粘蛋白抗原小得多，瓊脂糖凝膠(SePharose)2B柱用含有4M鹽酸胍;25M，PH8.0，的Tris緩沖液洗脫，洗脫峰很多(圖4)。小腸粘蛋白抗原同樣要過SePhacryl 1000柱，再次洗脫可以出現(xiàn)一個寬闊的小腸粘蛋白抗原峰，其中所含小腸粘蛋白抗原比所有的大腸粘蛋白抗原的分子量都低很多。(圖2a，2b)。
象上述的大腸粘蛋白抗原一樣，在10%到20%的甘油梯度之間測定了許多小腸粘蛋白抗原的S值，一個典型的SIMA的梯度呈現(xiàn)在圖3b中。從大量實驗計算得到S值是4.8±1.4，比大腸粘蛋白抗原低很多。
SIMA對堿和熱的處理比LIMA更穩(wěn)定，按照上述用堿處理大腸腸粘蛋白抗原的方法處理小腸粘蛋白抗原。抗原活性沒有值得注意的改變。另外，煮沸5分鐘。對小腸粘蛋白抗原的抗原活性亦沒有明顯影響，煮沸10分鐘后只有6%的抗原活性喪失。(看表2)象上述大腸粘蛋白抗原一樣，小腸粘蛋白抗原用高純度的酶消化(表2)。在三明治法酶連結(jié)免疫測定時(a Sandwich EIA)。小腸粘蛋白抗原的抗原活性不受梭菌蛋白酶的影響。用木瓜蛋白酶消化2小時，抗原活性也不受影響，然而在消化16小時后，抗原活性喪失50%。用胃蛋白酶消化，SIMA抗原活性喪失70%，與此相反，LIMA對胃蛋白酶的消化有抗性(胃蛋白酶10μg/ml室溫下過夜)。
表2有關(guān)粘蛋白抗原的不同降解過程的結(jié)果。
＊處理后剩余活性百分率LIMA SIMA煮沸10分鐘 60 94堿處理 45 100胃蛋白酶消化 100 30木瓜蛋白酶消化(2小時) 20 100木瓜蛋白酶消化(16小時) 20 50梭菌蛋白酶消化 100 100二硫化物還原作用 100 未做許多提純方法可以用于粘蛋白的純化，方法如下1.1M過氯酸，用乙酸鈉處理并且于70℃加熱，或煮沸5分鐘同樣可以用于提高粘蛋白的純度。
2.已經(jīng)證明反復(fù)的Cscl梯度超速離心明顯地改進(jìn)了粘蛋白制劑的純度。(提高10倍)
3.利用單克隆抗體親合層析，可以有兩種方法首先，如用抗大腸粘蛋白抗原單克隆抗體，從小腸粘蛋白抗原制備中除去大腸粘蛋白抗原(反之亦然);其次利用吸附作用和洗脫抗小腸粘蛋白抗原單克隆抗體上結(jié)合的粘蛋白(SIMA)的方法，從其它雜蛋白質(zhì)中純化SIMA。
4.利用植物凝集素柱，凝膠電泳，離子交換或者凝膠過濾層析，從正常組織或者癌組織中同樣可以提純粘蛋白抗原。
利用競爭性免疫組織化學(xué)方法和應(yīng)用測定制備中小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原組分的單克隆和多克隆的EIA法，可以監(jiān)視粘蛋白純化的不同。
B.多克隆抗血清的生產(chǎn)應(yīng)用在這些研究中的多克隆抗SIMA抗血清是Ma等人在兔子體內(nèi)得到的(1980)。按照Ma等的方法(1980)從正常大腸提取粘蛋白給兔子免疫接種的技術(shù)與生產(chǎn)辨認(rèn)LIMA的多克隆抗血清的技術(shù)相似。這些類型的抗血清雖然最初用于監(jiān)測粘蛋白的純化步驟，但是相對而言，這些抗血清無特異性，有交叉反應(yīng)，高度提純的SIMA和LIMA制備的多克隆抗血清，可以用于下述的三明治法免疫測定的兩個面。
C.單克隆抗體的制備免疫接種程序大約八周的雌性BaIb/c小鼠，每只用大約50μg不完全純化的癌組織粘蛋白，分4次皮下注射和1次腹膜內(nèi)注射。開始時用完全弗氏佐劑(Freund′S aejurant)大約4周后，用同樣的方法注射，改用不完全左劑。第二次免疫后大約12天，自小鼠尾靜脈取血，并且用ELISA法測定血清抗體滴度。第二次免疫三周，具有高滴度血清的小鼠通過腹膜內(nèi)注射增強免疫力的輔助藥，在磷酸鹽緩沖液中的10μg癌粘蛋白連續(xù)用4天，第5天殺死小鼠，取出脾臟與小鼠骨髓細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)的融合。
細(xì)胞融合，雜交瘤生長，克隆化一個免疫小鼠的脾臟在磷酸鹽生理緩沖液中(GKN)輕輕地梳理，制成脾細(xì)胞懸液，108脾細(xì)胞與5×107骨髓瘤細(xì)胞〔X63-Ag8.653〕〔從T-Stahelin，Hoffman La Roche公司，巴塞爾(Basel)，瑞士(Switzerland)得到〕。按照標(biāo)準(zhǔn)的程序融合，脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞用1分多鐘的時間，慢慢地與50%的PEG-4000混合。1.5分鐘后，在PEG中懸浮的細(xì)胞用7ml GKN溶液緩慢稀釋(超過5分鐘)，然后用含有10%胎牛血清，次黃嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶的RPMI1640稀釋到大約300ml，將這些稀釋的細(xì)胞懸液注入12塊24孔的多孔培養(yǎng)皿中(multi-dishes)。每孔中含有105腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)基大約7天以后更換，以后根據(jù)細(xì)胞生長需要而定。
經(jīng)過EIA篩選后，分泌抗粘蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞用稀釋法，在有腹腔巨噬細(xì)胞滋養(yǎng)層的多孔培養(yǎng)皿上克隆兩次。為了得到大量的單克隆抗體，使分泌抗體的雜交瘤在8-12周的小鼠體內(nèi)。象腹水癌一樣地生長，小鼠應(yīng)提前1-7天用0.5ml樸日斯烷(Pristane)腹膜內(nèi)注射。注射后2-4周收集腹水，并且貯于-20℃。當(dāng)需要的時候，用蛋白A-SePharose親合層析從腹水中提純免疫球蛋白。
雜交瘤的篩選(Ⅰ)EIA聚苯乙烯多孔培養(yǎng)皿用粗制的癌粘蛋白包被，放置于37℃，3小時。(癌粘蛋白含量10μg/ml，緩沖系
，PH＝9.6)包被后，小孔用磷酸鹽緩沖液和吐溫液(PBS/Tween)洗4次。培養(yǎng)雜交瘤的上清液在孔中保溫培養(yǎng)1小時，然后再用PBS/Tween洗4次，再加堿性酸酶連結(jié)的綿羊抗鼠免疫球蛋白于孔內(nèi)保溫培養(yǎng)。用PBS/TWeen洗過后，再向蒸餾水洗，向孔內(nèi)加入酶作用底物-磷酸對硝基苯酚。那些孔由于出現(xiàn)黃色產(chǎn)物一對一硝基苯酚，而被確認(rèn)為陰性孔(含有粘歪白抗體的上清液)。
(Ⅱ)熒光免疫組織化學(xué)通過在EIA試驗的第一輪篩選而鑒定的“陽性”雜交瘤細(xì)胞，再用免疫熒光技術(shù)篩選單克隆抗體給正常胃腸道器官和胃腸道癌切片上特有的細(xì)胞或組織染色的能力。雜交瘤培養(yǎng)液與玻片上的組織切片共同保溫培養(yǎng)，用牛血清清蛋白封閉非特異性結(jié)合部位。然后組織切片與連結(jié)熒光物質(zhì)的
抗鼠免疫球蛋白共同保溫培養(yǎng)。再洗去過量示蹤抗體。組織切片用紫外光或者狹窄的蘭色激發(fā)光光照射。通過熒光顯微鏡檢查。
利用上述的方法，5種抗小腸粘蛋白抗原單克隆抗體(與正常小腸或結(jié)腸直腸癌粘蛋白反應(yīng)的)和5種抗大腸粘蛋白抗原單克隆抗體(與正常大腸和結(jié)腸直腸癌粘蛋白反應(yīng)的)得到鑒定。
單克隆抗體的定性利用酶偶聯(lián)抗IgG和IgM抗體(CSL)檢測抗體的亞型。發(fā)現(xiàn)所有的單克隆抗體都是IgG的亞型。
為了充分地表示單克隆抗體的特性，它們的相對親合力用兩種方法測量，其一，通過蛋白A-SePharose親合層析，得到各種單克隆抗體純凈的IgG，精制的IgG用EIA滴定(滴度對蛋白濃度制做滴定曲線)曲線可以作為測量抗體相對親合力的對照。其二，產(chǎn)生了競爭性EIA實驗(看下文)。計算相對親和常數(shù)利用具備抗SIMA單克隆抗體性質(zhì)的SIMA制劑作為抑制劑和利用具備抗LIMA單克隆抗體性質(zhì)的LIMA制劑作抑制劑，按照下面的等式進(jìn)行計算。
Ab+Ag ()/() AbAgKa＝ (〔Ab·Ag〕)/(〔Ab〕·〔Ag〕)
在競爭性EIA測定中，當(dāng)(粘蛋白)抗原的濃度可以產(chǎn)生5%抑制作用時。游離的和結(jié)合的抗體濃度相等的。即;〔Ab〕＝〔AbAg〕?？梢韵鄬τH合常數(shù)Ka＝ 1/(〔Ag〕) 。計算數(shù)據(jù)在表3。(如果制劑不十分純并且有雜蛋白存在時)因為真空的抗原濃度可能較低，所以Ka值是最小值，但是實際上可能仍是比較高的。
表3抗體 相對親合常數(shù)抗SIMA單克隆抗體(1/mole)4D1 4.2×10104C2 3.3×10103C5 2.4×10104D3 1.6×10102A1 1.0×1010抗LIMA單克隆抗體3B4 2.4×10103D4 1.5×10103C3 8.9×10102D3 2.8×10102C3 2.4×1010一方面測定是否每個抗小腸粘蛋白抗原單克隆抗體，以及另一方面是否每個抗大腸粘蛋白抗原單克隆抗體都分別結(jié)合于小腸粘蛋白抗原和大腸粘蛋白抗原分子上的相同抗原決定簇的方法，取自于Friguet20等人的方法(1983)。用包被于培養(yǎng)皿上的一定量的抗原，在所有可能的結(jié)合中，分別滴定各自的抗體。人們發(fā)現(xiàn)目前實驗中所制備的單克隆抗體結(jié)合于抗原分子表面相同的或者是部分相同的抗原決定簇上。
例2 體外免疫診斷為了探測血液中循環(huán)的粘蛋白，產(chǎn)生了兩種免疫測定法，簡述如下A.競爭性ELISA試驗(Ⅰ)有關(guān)這種測定方法的步驟，簡述在圖5。初步實驗表明加入肝素化或用EDTA處理或者加未經(jīng)處理的血液的粘蛋白全部能夠被回收，并且在稀釋的血清或血漿中定量。未稀釋的血清或血漿加到免疫測定的系統(tǒng)中將引起干擾。然而如果用稀釋10倍的血漿就將不會觀察到這種干擾。因此，用一系列并發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎的直腸結(jié)腸癌患者的血樣和健康對照組一起，用競爭性ELISA鑒定SIMA和LIMA。在正常人的血漿中添加SIMA和LIMA作標(biāo)準(zhǔn)?？赡馨l(fā)現(xiàn)13/23(大約60%)的患不同期的結(jié)腸直腸癌患者LIMA及SIMA的含量高;4/5并發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎患者LIMA的含量高(但是無SIMA)。7名健康對照，用此種方法測定既未測到SIMA，又未測到LIMA。
(Ⅱ)為了觀察低濃度的粘蛋白是否能夠測定，設(shè)計了從血漿中濃縮和提取粘蛋白的方法。等體積的2M過氯酸(PCA)。在室溫15分鐘內(nèi)加到血漿或血清之中。8000×g，離心2分鐘，除去上清液，沉淀物用與原樣品體積相同的PBS分兩次洗滌，混合再以8000×g，離心2分鐘。上清液加PBS，最終體積是原始體積的10倍，然后在Minicon B15濃縮器中透析并濃縮10倍(Minicon B15可除去分子量150，000，Amicon Co)樣品再稀釋到原體積的10倍，再濃縮50倍，用過氯酸提取的結(jié)果是原樣品體積的1/5，樣品用前面說過的競爭性ELISA法分析鑒定。添加不同濃度的粘蛋白于健康志愿者的血漿樣品中，作為標(biāo)準(zhǔn)。39名患結(jié)腸直腸癌患者測定SIMA的結(jié)果。2名患乳腺癌，5名患潰瘍性腸炎。7各對照表明，在一些對照組的病人中SIMA抗原活性低，也能夠檢測。全部對照中除2名癌癥病人外全處于較高水平，患者中60%的Ⅱ期結(jié)腸直腸癌(沒有明顯擴散)，91%的Ⅲ期結(jié)腸直腸癌(有可覺察的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，86%的Ⅳ期結(jié)腸直腸癌(擴散癌，有播散到較遠(yuǎn)組織的可能，如肝)與對照組比較粘蛋白的水平升高。從一個Ⅰ期結(jié)腸直腸癌病人的血中也測到了SIMA，并且有兩名Ⅰ期患者有乳腺癌。
LIMA的測定只用于稀釋的血清樣品，沒有SIMA測定程序中的透析，濃縮步驟。僅小部分早期結(jié)腸直腸癌患者有可測定的LIMA。11%的Ⅱ期患者，Ⅲ期患者的29%，除67%的Ⅳ期患者外，血清LIMA都升高，大部分(80%并發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎的患者循環(huán)的LIMA水平高，即便是使用這種相對來說不敏感的檢測方法也高。因此這個方法在測定炎癥性大腸疾患者方面可能是有價值的。
B.三明治(Sandwich)免疫測定上述單克隆抗體也可以用在三明治法測定中，這種測定方法，在改進(jìn)檢測靈敏度方面確實有不少優(yōu)點，而且比上述競爭性抑制法步驟要簡單的多。此外，三明治法的“信號”(如孔中的放射性，酶標(biāo)記抗體顏色)與粘蛋白的抗原濃度呈正比，這種關(guān)系大大地簡化了計算而且簡化了與競爭性抑制法比較時的結(jié)果處理。
這種方法的使用，可以使粘蛋白分子固定的單克隆抗體包被一個固體的表面，(用125Ⅰ或者酶標(biāo)記)相同的被標(biāo)記的單克隆抗體可以檢測與包被抗體結(jié)合的粘蛋白(看圖6)。
a.SIMA或LIMA同位素免疫測定(RIA)的程序(圖6)。
1.如果用HA多孔培養(yǎng)皿(millititer HA Plates)(milliPore CorPoratinn，USA)，培養(yǎng)皿的孔用以緩沖液稀釋的精制單克隆抗體IgG和蛋白-A(大約10μg/ml)包被(每孔50μl，
緩沖液，PH9.6)，多孔培養(yǎng)皿在37℃保溫培養(yǎng)3-5小時。
2.加100μl血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)液，加200μl的0.2M PH 5.0乙酸鈉，70℃±1℃，加熱15分鐘，然后在9000×g離心10分鐘。用志愿者血清配制標(biāo)準(zhǔn)液，含SIMA或LIMAO，1.5，5.0，15，50，150和500μg/ml。
3.用含1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋125Ⅰ標(biāo)記的單克隆抗體，然后加到乙酸鹽提取物的上清液中(100μl上清液加0.1μci)。39℃下保溫培養(yǎng)1小時。
4.已包被的培養(yǎng)皿的孔用PBS/Tween洗4次，并且用含1%BSA的PBS在37℃封閉此培養(yǎng)皿30分鐘。
5.封閉后，培養(yǎng)皿用PBS/Tween洗3次。樣品(每孔50μl，每個樣品兩個孔)與125Ⅰ標(biāo)記抗體提前保溫培養(yǎng)，然后加入孔內(nèi)，在4℃條件下，保溫培養(yǎng)過夜。
6.過夜后，這些孔用PBS/Tween洗5次，用濾紙吸干，并且取出每個孔底部的濾紙片，在γ-計數(shù)器上計數(shù)。
規(guī)定以μ(單位)/ml表示SIMA和LIMA的含量，測定的SIMA和LIMA的含量與對照管SIMA和LIMA的標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量成比例。
為了評價三明治法的可靠性和可重復(fù)性，做了大量的實驗，表4表示對照血清的典型測定時，三次測定間的變差，血清SIMA的測定，在1.5μ/ml的水平上，可變性最高(CV＝10%)，在1.5μ/ml以上可以不考慮可靠性，(因此，并非所有少于5μ/ml SIMA的值都不是給定的具體值)。測定血清中SIMA為5-500μ/ml。那么這種方法內(nèi)可變性是5.6%或者更少一些。
表4 SIMA放射免疫測定的檢測可變性平均SIMA濃度(u/ml 標(biāo)準(zhǔn)差 可變性(%)1.5 0.15 10.05.0 0.12 2.350 2.4 4.7150 8.4 5.6500 17.8 3.4b.LIMA酶聯(lián)免疫測定(EIA)的程序(圖7)1.聚苯乙烯多孔培養(yǎng)皿(Nunc免疫板)在碳酸氫鹽緩沖系中用抗LIMA單克隆抗體IgG包被，(來自雜交瘤細(xì)胞系2C3)在37℃下放置3小時，培養(yǎng)皿用洗滌液(PBS/Tween/疊氮鈉，PH＝7.2-7.6)洗2次，然后放干。
2.在多孔培養(yǎng)皿的孔中，每孔加入50μl的封閉液(含疊氮鈉的PH＝7.4的PBS及牛血清清蛋白)，37℃下保溫培養(yǎng)1小時。
3.加200μl的乙酸提取液(含疊氮鈉的，PH＝5.0的0.2M乙酸鈉)到100μl的標(biāo)準(zhǔn)LIMA中或血清樣品中(標(biāo)準(zhǔn)LIMA溶于含疊氮鈉的正常人血清中)(標(biāo)準(zhǔn)LIMA的抗原濃度為每毫升0，1.5，5，15，50，150和500單位)在70±1℃條件下加熱15分鐘。冷卻到室溫。用水平轉(zhuǎn)頭，在10，000×g下離心10分鐘。
4.用洗滌液洗多孔培養(yǎng)皿3次，放干。
5.從用乙酸鹽提取并經(jīng)過熱處理的標(biāo)準(zhǔn)液或者血清樣品上清液取50μl加到每個孔中(每個樣品兩個孔)，于37℃保溫1小時。
6.用洗滌液洗多孔培養(yǎng)皿4次，然后放干。
7.堿性磷酸鹽酶和抗LIMA單克隆抗體復(fù)合物用含1%牛血清清蛋白的磷酸鹽緩沖液1∶300稀釋，每孔加50μl，在37℃下保溫1.5小時。用洗滌液洗4次，用蒸餾水洗3次，然后放干，用(含0.1M氯化鎂的0.2M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液)稀釋緩沖液溶解底物(P-硝基苯酚磷酸鹽)，濃度為2mg/ml。每孔加1.00μl，于37℃保溫20分鐘。
8.每孔加入100μl酶促反應(yīng)抑制劑(0.5M氫氧化鈉)。
9.在405mm處，用適當(dāng)?shù)亩嗫着囵B(yǎng)皿讀數(shù)器讀取光密度(O·D)。
實驗結(jié)果的評價(Ⅰ)以標(biāo)準(zhǔn)管平均光密度為y軸，以相對應(yīng)的LIMA濃度為X軸。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(Ⅱ)利用每個血樣的平均光密度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，查相對應(yīng)的LIMA的密度(u/ml)。
假和樣本(LIMA濃度大于150u/ml)需要另外稀釋，從而得到一個可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到的數(shù)值，那么從曲線上查到的值必須乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，方能得到血清中LIMA的濃度。
實例在表5和圖8，圖8是根據(jù)表5的數(shù)據(jù)繪制的。
表5 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的代表性數(shù)據(jù)樣本 記錄(O·D) 平均值 LIMA濃度標(biāo)準(zhǔn)1 0.012-0.010 0.011 02 0.037-0.025 0.031 1.53 0.106-0.117 0.112 54 0.293-0.340 0.316 155 0.655-0.702 0.678 506 1.057-1.138 1.097 1507 1.281-1.345 1.313 500樣本1 0.607-0.633 0.620 402 0.445-0.446 0.445 230.868-0.893 0.881 88在表6中表示的是上述LIMA EIA的可重復(fù)性的實例，表6表示含有不同濃度LIMA的血清樣品檢測兩次之間的數(shù)值變化(每項測定取三個數(shù)據(jù))。數(shù)值小于1.5u/ml(變化率10%的系數(shù))或者大于100u/ml(變化率12%的系數(shù))可變性最高。血清中LIMA濃度超過這個范圍(即＜2或＞150u/ml)即認(rèn)為不可靠，因此，樣品中若含LIMA大于150u/ml就應(yīng)該稀釋后重新測定。
表6 LIMA EIA檢測可變性試驗平均LIMA濃度 標(biāo)準(zhǔn)離差 可變性(u/ml) (u/ml) (%)1.5 0.15 105 0.30 650 3.7 6150 7.0 5500 6.0 12c.臨床結(jié)果表7羅列了一些不同疾病的患者和健康對照者血樣的簡要測定結(jié)果。表7表示檢測血清中SIMA，LIMA RIA(看上面a)和CEA的結(jié)果，為了比較單純SIMA陽性，單純LIMB陽性，單純CEA陽性，或者三種抗原陽性之間任何組合的陽性樣品數(shù)。
表7 臨床檢驗的簡要結(jié)果
根據(jù)這個表，LIMA濃度≥10u/ml即視為陽性，CEA值≥10%即視為陽性。病人血SIMA濃度≥25u/ml視為陽性，對照經(jīng)反復(fù)同樣試驗者≥20u/ml亦視為陽性。
c.其它的免疫分析程序上述的“兩相”免疫測定方向的變差，使得使用多克隆抗粘蛋白抗血清(如
和羊中升高)包被固體相成為可能，這將使未標(biāo)記的單克隆抗體在測定時能作為“第二抗體”而加以利用，緊接著用標(biāo)記的
或綿羊抗鼠抗體測定鼠的單克隆抗體。這個體系(反之亦然，以單克隆抗體為固體包被相測定多克隆抗體也一樣)比直接標(biāo)定一種單克隆抗體提供了更多的陽性指征。
目前，圍繞在三明治免疫測定中熒光酶底物的應(yīng)用也應(yīng)該受到重視。如堿性磷酸酶的底物;4-甲基繖酰磷酸酯(4-methy lumbelliferyl-(4MU)-PhosPhate)或β-半乳糖苷酶的底物4-甲基繖形酰-β-半乳糖苷(4-mu-P-D-galactoside)。相同的單克隆抗體連結(jié)酶可以用上述的光譜光度計測定。估計靈敏度會增加10倍。已知的其它測定系統(tǒng)，如蛋白A，抗生素蛋白-生物素，等也可以應(yīng)用，在這些三明治免疫測定中標(biāo)記的蛋白A是一個檢測系統(tǒng)，那時固定相的包被抗體(單克隆的或者多克隆的)大概是一個F(ab)碎片，而檢測抗體是一個含F(xiàn)e片段的完整分子。除多孔培養(yǎng)皿外，還有大量的不同的固體相可以應(yīng)用于這個系統(tǒng)，如各種類型的帶孔小珠。另外，膜也可以用作結(jié)合抗體的吸附表面。
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權(quán)利要求
1.一種鑒定制造粘蛋白抗原細(xì)胞的方法，該方法包括從病人體內(nèi)取出生理液作為樣品，再測定人生理液樣品中是否出現(xiàn)大腸粘蛋白抗原(LIMA)或(和)小腸粘蛋白抗原(SIMA)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，其中所說的樣品是病人體內(nèi)的血，血清或血漿。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，包括把上述樣品與SIMA和(或)LIMA的抗體或抗體的片段接觸測定是否所述抗體或抗體片段與它們相應(yīng)的抗原結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，包括所述的樣品與標(biāo)記了的SIMA和(或)LIMA的抗體或抗體的片段接觸，這種標(biāo)記可以提供測信號，從而測定是否標(biāo)記的抗體或抗體片段與它們相應(yīng)的抗原相結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述方法，其中所說抗體里單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3，4或5所述方法，其中所述抗體或片段是用酶或放射性同位素標(biāo)記的。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法，包括步驟(1)把小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原的抗體或其片段與固體支持物結(jié)合;(2)使所述樣品與所述固體支持物接觸;(3)檢測是否所述樣品中存在與固體支持物相聯(lián)結(jié)的抗體或其片段相結(jié)合的抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述方法，其中所述檢測結(jié)合相應(yīng)抗原的步驟包括(4)使大腸粘蛋白抗原和(或)小腸粘蛋白抗原的抗體或其片段與所述固體支持物接觸，這些抗體及其片段被標(biāo)記，從而能提供檢測信號。(5)檢測所述標(biāo)記了的抗體或其片段是否與結(jié)合在固體支持物上的抗原相結(jié)合。
9.一套體外診斷出現(xiàn)癌細(xì)胞或其它產(chǎn)生粘蛋白抗原病人的裝置或系統(tǒng)，這套裝置或系統(tǒng)包括檢測病人生理液樣品中小腸粘白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原是否存在的手段。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述裝置或系統(tǒng)，包括能與小腸粘蛋白抗原和(或)大腸粘蛋白抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體或它們的片段，與指示所述抗體或其片段與它們相應(yīng)抗原間發(fā)生免疫反應(yīng)的指示手段。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述裝置或系統(tǒng)，進(jìn)而包括一個含有與所述抗體或其片段連接的固體支持物。
12.根據(jù)權(quán)利要求
10所述裝置或系統(tǒng)，其中所述指示手段包括能提供檢測信號的標(biāo)記，這標(biāo)記與所述抗體或其片段結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的裝置和系統(tǒng)，其中所說指示手段包括能提供檢測信號的標(biāo)記，這標(biāo)記與提高所述第一抗體并指示與第一抗體結(jié)合發(fā)生免疫反應(yīng)的第二抗體結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求
12或13所述裝置或系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記是酶或放射性同位素。
專利摘要
一種鑒定制造粘蛋白抗原細(xì)胞的方法，包括從病人體內(nèi)生理液，特別是諸如血，血清或血漿等取出的樣品，測定其小腸粘蛋白抗原(SIMA)或(和)大腸粘蛋白抗原(LIMA)的存在。它可為早期診斷癌提出依據(jù)，同時也揭示了用于鑒定的裝置。
文檔編號G01N33/53GK85105430SQ85105430
公開日1987年5月13日 申請日期1985年7月16日
發(fā)明者安東尼·威廉·尼納尼 申請人:馬肯·戴格諾斯蒂克·普蒂有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan