專利名稱:鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
的方法，具體是一種鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法。
背景技術(shù)：
禽流感，尤其是HPAI(高致病性禽流感)，對禽類養(yǎng)殖業(yè)具有很大的危害。目前有效控制禽流感的方法之一是疫苗接種，有效評價免疫效果的一個指標(biāo)就是檢測免疫后的抗體水平，因此有效區(qū)分自然感染產(chǎn)生的抗體與免疫接種產(chǎn)生的抗體非常重要。傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷禽流感的方法有HA-HI(血凝和血凝抑制試驗)、AGP(瓊脂免疫擴散)、微量中和以及NIF(神經(jīng)氨酸酶抑制試驗)，由于這些方法所檢測的抗體，不管是接種疫苗還是感染野毒均會產(chǎn)生，因此這些檢測方法不能真實反映禽流感的實際感染情況，給防控禽流感帶來極大的困難。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，王澤霖等在《中國科技》(2006年213卷14-17頁)發(fā)表的題為“非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測禽流感野毒感染抗體”論文，及楊濤等在《中國獸醫(yī)科技》(2005年25卷585-589頁)發(fā)表的題為“H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白的原核表達及其酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法的建立”的論文，都對利用禽流感非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1蛋白)作為包被抗原，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，在個體水平上檢測雞血清中針對NS1蛋白的相關(guān)抗體IgG水平有相關(guān)報道。但是，一方面，NS1蛋白是一種弱抗原，不易激發(fā)機體產(chǎn)生高滴度的抗體。即是自然感染的雞群在不同個體水平上可能不會產(chǎn)生很高的抗體滴度；另一方面，由于目前所用禽流感滅活疫苗均用雞胚制作，雞胚繁殖病毒的過程中，也有NS1蛋白的產(chǎn)生，應(yīng)用雞胚尿囊液制備的油乳劑滅活疫苗中就有NS1蛋白，因此免疫雞群特別是多次免疫的雞群中很可能存在一定量的針對NS1蛋白的抗體，也就是說在個體水平上，自然感染禽流感病毒的雞的NS1抗體水平可能不高，或者是免疫接種雞的NS1抗體水平可能比較高，所以，從個體水平上鑒別診斷禽流感的感染情況往往有很大的偏差。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種群體水平鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，使其利用群體水平上禽流感NS1蛋白抗體在自然感染雞群與免疫接種雞群含量的不同，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法檢測雞血清中與NS1抗原反應(yīng)的抗體IgG水平，通過確定禽流感血清酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值和最少實驗動物數(shù)，從群體水平鑒別診斷雞群禽流感的野毒感染。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明具體步驟包括①通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因；②將步驟①擴增所得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因通過酶切插入到載體質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建出原核表達質(zhì)粒，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，IPTG(異丙基巰基半乳糖苷)誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗鑒定為分子量44.2KD的融合蛋白；③將步驟②所得融合蛋白作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，確定最佳反應(yīng)條件，包括抗原的最佳包被濃度、抗體的最佳稀釋倍數(shù)、抗原抗體最佳反應(yīng)時間、酶標(biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)和酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時間；④按照步驟③建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，對禽流感H9N2感染組雞血清、30日齡非免疫雞的陰性血清、禽流感H9N2滅活疫苗接種組雞血清進行檢測；⑤按照統(tǒng)計學(xué)方法對檢測結(jié)果進行分析，確定禽流感血清的酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值和最少樣本數(shù)；⑥根據(jù)血清樣本酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值和規(guī)定的最少檢測樣本數(shù)，按照雞群血清樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度的大小，平均吸光度高于臨界值的確定為雞群感染了禽流感野毒。
所述的禽流感血清酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值，是對70份禽流感H9N2感染組雞血清、30份30日齡非免疫雞的陰性血清、95份禽流感H9N2滅活疫苗接種組雞血清進行統(tǒng)計學(xué)分析后，取30日齡非免疫雞的陰性血清的平均值加三個標(biāo)準(zhǔn)差作為禽流感血清陰陽性判定的臨界值。
所述的禽流感血清酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值是0.5。
所述的最少樣本數(shù)，是通過統(tǒng)計學(xué)分析，規(guī)定酶聯(lián)免疫吸附試驗確定雞群整體是否感染禽流感病毒的所需要的最少的雞的個數(shù)。最少樣本數(shù)是30。
所述的最佳反應(yīng)條件為抗原的最佳包被濃度為40μg/mL、抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1∶200、抗原抗體最佳反應(yīng)時間是1h、酶標(biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)是1∶10000和酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時間是1h。
所述的抗原，是經(jīng)大腸桿菌原核表達的H9N2型禽流感病毒NS1蛋白，包被在固相載體上進行抗體的測定，對待測血清樣品進行定性分析。
酶聯(lián)免疫吸附試驗利用酶標(biāo)記的抗原或抗體，在固相載體上進行的抗原或抗體的測定。酶聯(lián)免疫吸附試驗的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈現(xiàn)的顏色的深淺進行定性或定量分析。本發(fā)明是以禽流感病毒NS1蛋白作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，將待測血清樣品按照一定比例稀釋與抗原反應(yīng)，加入酶標(biāo)二抗，最后加底物顯色，根據(jù)測定顯色樣品的OD值來判定結(jié)果。
所述H9N2型禽流感病毒，是指甲型流感病毒血凝素(H)及神經(jīng)氨酸酶(N)分為15個H型和9個N型。本發(fā)明所用的是H9N2型禽流感病毒。
本發(fā)明是鑒于NS1蛋白在自然感染雞群體內(nèi)和疫苗免疫雞群體內(nèi)產(chǎn)生抗體的不同，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗計算雞群血清的平均OD值來鑒別診斷的。用原核表達的NS1蛋白作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，將待檢血清通過一定稀釋與包被的抗原反應(yīng)，再加入抗IgG的酶標(biāo)二抗顯色，通過測定雞群平均OD值的大小來判定雞群是否感染了禽流感。
本發(fā)明方法通過計算雞群總體NS1抗體水平，可以鑒別禽流感自然感染的雞群與滅活疫苗免疫雞群，而傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷禽流感的方法有血凝和血凝抑制試驗、瓊脂免疫擴散、微量中和以及神經(jīng)氨酸酶抑制試驗，由于這些方法所檢測的抗體，不管是接種疫苗還是感染野毒均會產(chǎn)生，因此這些檢測方法不能真實反映禽流感的實際感染情況，給防控禽流感帶來極大的困難。本發(fā)明方法從總體鑒別診斷，忽略了個體差異，通過計算血清平均OD值的方法，從群體水平來鑒別診斷整個雞群是否感染了禽流感病毒。在95份疫苗接種組血清中，OD450＞0.5的樣品數(shù)量占33.6％，但是這些雞并沒有感染禽流感病毒，而是疫苗效價高才導(dǎo)致如此。如果從個體水平檢測，這些雞會被判定為陽性；70份禽流感H9N2陽性血清中，OD450＞0.5的樣品數(shù)量占74.3％，剩余的25.7％的雞從個體水平檢測會被判定為陰性，而利用本發(fā)明的方法可以鑒別雞群的整體是否感染了禽流感病毒，為診斷、預(yù)防禽流感提供依據(jù)。
具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等在《分子克隆實驗室手冊》(紐約冷泉港實驗室出版社，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本實施例首先將H9N2型禽流感病毒進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，獲得目的片斷，再將目的片斷與載體pET-32a(+)質(zhì)粒連接，得到重組表達質(zhì)粒，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21表達，獲得一個分子量為44.2KD的融合蛋白，該融合蛋白經(jīng)過純化，得到純度較高的H9N2型禽流感病毒NS1蛋白；將該NS1蛋白作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，確定酶聯(lián)免疫吸附試驗的最佳反應(yīng)條件(具體包括抗原的最佳包被濃度，抗體的最佳稀釋倍數(shù)，抗原抗體最佳反應(yīng)時間，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)和酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時間)；按上述最佳反應(yīng)條件建立酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，測定70份禽流感H9N2感染血清、95份滅活疫苗接種血清、30份非免疫雞的陰性血清的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度，通過統(tǒng)計學(xué)分析確定血清樣本酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值、最少樣本數(shù)；最后根據(jù)雞群樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度，從群體水平鑒別診斷雞群是否被禽流感病毒感染。
H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的原核表達H9N2型禽流感NS1基因的克隆用Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提總RNA。根據(jù)禽流感NS1基因保守序列設(shè)計引物進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增，擴增后連接到pMD-18 T載體(Takara公司)上測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計上游包含EcoR I限制性酶切位點和下游包含Xho I限制性酶切位點的引物，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增。
NS1蛋白表達載體的構(gòu)建以EcoR I和Xho I分別酶切上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物和pET-32a(+)，T4 DNA連接酶(Takara公司)10-16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I酶切鑒定，將鑒定呈陽性的重組質(zhì)粒測序，結(jié)果顯示所擴增序列與禽流感病毒香港株(A/aquatic bird/HongKong/399/99)的NS1蛋白同源性達到98％，所以經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，所擴增的序列是禽流感NS1蛋白。
NS1蛋白的表達將經(jīng)鑒定過的陽性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，挑取1個菌落接種2ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取200μl過夜培養(yǎng)菌液接種20ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37℃150轉(zhuǎn)/分搖菌2h，至OD600為0.4-1，加異丙基巰基半乳糖苷至終濃度為1mM，25℃搖菌4h后，收取菌液。
NS1蛋白的檢測(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳配制14％的分離膠和5％的濃縮膠。樣品用上樣緩沖液沸水煮4min，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓136V，電泳4-5h，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用考馬斯亮蘭對聚丙烯酰胺凝膠染色2h，以脫色液脫色，觀察凝膠上的蛋白條帶，在44KD處有明顯的條帶出現(xiàn)，(2)蛋白質(zhì)免疫印跡實驗鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束時，保留上述聚丙烯酰胺凝膠，用蒸餾水淋洗石墨板，保持石墨板的清潔，然后用紙揩干，切6張濾紙和一張硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜浸沒于去離子水的水面上，濾紙浸沒于轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡5min，然后將濾紙、硝酸纖維素膜和聚丙烯酰胺凝膠按濾紙(三張)、硝酸纖維素膜、聚丙烯酰胺凝膠、濾紙(三張)的順序從陽極到陰極擺放正確，按照0.65mA/cm2通電轉(zhuǎn)印5h，將硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內(nèi)加封閉液和禽流感陽性血清(禽流感陽性血清為1∶100稀釋)，4℃過夜孵育，再轉(zhuǎn)入37℃孵育2h，反應(yīng)后，取出硝酸纖維素膜先用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗三次，每次10min，再用雜交膜清洗液(TBST)漂洗10min，然后將硝酸纖維素膜放在密封的塑料袋中，內(nèi)加封閉液和1∶1000稀釋的免抗雞IgG二抗(Bethyl laboratories.Inc)，37℃孵育2h，反應(yīng)結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放雜交膜清洗液中漂洗3次，每次1h，然后加入底物顯色2-3min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸纖維素膜上在44KD處有黑色條帶出現(xiàn)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗方法的建立利用純化的重組禽流感NS1蛋白作為抗原建立酶聯(lián)免疫吸附試驗，測定抗原的最佳包被濃度、抗體的最佳稀釋濃度，抗原抗體最佳反應(yīng)時間，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)，酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時間?？乖?0μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL濃度稀釋，包被反應(yīng)板100μL/孔，4℃過夜，然后用酶聯(lián)免疫吸附試驗洗液洗滌5次，再用5％的脫脂乳封閉液37℃封閉2小時；禽流感病毒感染血清、滅活疫苗接種血清及陰性血清分別用抗體稀釋液稀釋50、100、200、400倍，與上述抗原的不同稀釋度組成方陣100μL/孔，按常規(guī)方法建立檢測NS1抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗，將相同稀釋度作一個重復(fù)，在酶標(biāo)儀上讀出OD450，比較三種血清的OD450值，選擇陰性血清OD值為0.3以下以及病毒感染與疫苗接種組血清OD值比值較高的包被抗原的最大稀釋度為抗原包被的最佳濃度，相應(yīng)的血清的最大稀釋度為最佳血清稀釋度，從而確定了抗原的最佳包被濃度和抗體的最適稀釋倍數(shù)。抗原的最佳包被濃度為40μg/mL，抗體的最佳稀釋倍數(shù)為1∶200。
重組抗原和H9N2型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清最佳倍數(shù)稀釋反應(yīng)1h后，將HRP標(biāo)記的免抗雞IgG抗體按1∶500、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀釋，反應(yīng)1h，再加入底物液顯色測定OD450，當(dāng)出現(xiàn)OD450最大的二抗?jié)舛燃礊樽罴严♂対舛?。酶?biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)是1∶10000。
重組抗原和H9N2型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清各6份按最佳倍數(shù)稀釋后，分別反應(yīng)0.5h、1h、1.5h，加入酶標(biāo)二抗，顯色，測定OD450，當(dāng)陽性和陰性血清比值最大時的反應(yīng)時間即為最佳反應(yīng)時間?？乖贵w最佳反應(yīng)時間是1h。
抗原和4份H9N2型禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清按最佳倍數(shù)稀釋后，反應(yīng)一定時間，加入酶標(biāo)二抗，分別反應(yīng)0.5h、1h、1.5h，顯色測定OD450，當(dāng)陽性和陰性血清比值最大時的反應(yīng)時間即為酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時間。酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時間是1h。
酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性臨界值和最少樣本數(shù)的制定通過測定70份禽流感H9N2感染血清、95份滅活疫苗接種血清、30份非免疫雞的陰性血清的OD值，疫苗接種組血清酶聯(lián)免疫吸附試驗OD450值的平均值X＝0.428，標(biāo)準(zhǔn)差SD＝0.228。禽流感H9N2感染血清組酶聯(lián)免疫吸附試驗OD450值的平均值X＝0.576，標(biāo)準(zhǔn)差SD＝0.151。參照文獻(《獸醫(yī)流行病學(xué)原理》，劉秀梵主編，農(nóng)業(yè)出版社)，對二者進行t檢驗，t＝5.016。t＞t83，0.05(雙側(cè))(83為t檢驗的自由度)，差異顯著。即通過酶聯(lián)免疫吸附試驗可以在群體水平將滅活疫苗接種組血清和禽流感H9N2感染組血清區(qū)別。
本實施例采用的判定標(biāo)準(zhǔn)是陰性樣本的平均值加三個標(biāo)準(zhǔn)差，非免疫雞陰性血清組的平均值為X＝0.222，標(biāo)準(zhǔn)差SD＝0.09221。判定陰陽性結(jié)果的OD450臨界值為X+3SD＝0.5，如果群體血清的OD450平均值高于0.5，則判定為陽性；如果低于0.5，判定為陰性。
本實施例是從整體水平檢測雞群是否感染禽流感病毒。通過檢驗雞群平均OD450來判定雞群全體是否感染禽流感病毒。參考文獻(《獸醫(yī)流行病學(xué)原理》，劉秀梵主編，農(nóng)業(yè)出版社，147-148頁)中實驗樣本數(shù)的規(guī)定2.58=p-qp(1-p)-q(1-q)n]]>p為病毒感染組樣品中OD450＞0.5的樣本數(shù)量所占的百分?jǐn)?shù)；q為疫苗免疫組樣品中OD450＞0.5的樣本數(shù)量所占的百分?jǐn)?shù)；n為所需的實驗動物數(shù)。
95份疫苗接種組血清中，OD450＞0.5的樣品數(shù)量占33.6％；70份禽流感H9N2陽性血清中，OD450＞0.5的樣品數(shù)量占74.3％。按照以上公式，得到實驗血清樣本數(shù)為30份。所以，在進行群體檢測時，所檢測的實驗血清樣本數(shù)至少為30，才可以有效鑒別雞群是否感染禽流感病毒。
酶聯(lián)免疫吸附試驗鑒別診斷禽流感病毒自然感染雞群將純化的NS1蛋白用包被稀釋液稀釋到40μg/ml后，每孔加入100μl，4℃過夜，37℃2h后，棄去孔內(nèi)液體，再選擇5％脫脂乳37℃封閉2h，然后棄去孔內(nèi)液體，洗滌緩沖液(PBST)清洗5遍；將待測血清樣本1∶200倍稀釋，每孔加入100μl，37℃1h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液清洗清洗5遍，其后加入酶標(biāo)抗IgG抗體100μl，37℃1h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗液清洗5遍。再加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMD)100μl室溫顯色8min，其后加入50μl終止液終止反應(yīng)，測定OD450。判定結(jié)果。當(dāng)所檢測的雞的數(shù)量大于30時，所檢測雞血清平均OD450大于0.5時，判定雞群感染了禽流感，當(dāng)所檢測雞血清平均OD450小于0.5時，判定雞群未感染禽流感。
權(quán)利要求
1.一種鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征在于，所述方法具體步驟包括①通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因；②將步驟①擴增所得H9N2型禽流感病毒NS1蛋白的基因通過酶切插入到載體質(zhì)粒pET-32a(+)中，構(gòu)建出原核表達質(zhì)粒，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，異丙基巰基半乳糖苷誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗鑒定為融合蛋白；③將步驟②所得融合蛋白作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，確定反應(yīng)條件；④按照步驟③建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法，對禽流感H9N2感染組雞血清、30日齡非免疫雞的陰性血清、禽流感H9N2滅活疫苗接種組雞血清進行檢測；⑤按照統(tǒng)計學(xué)方法對檢測結(jié)果進行分析，確定禽流感血清的酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值和最少樣本數(shù)；⑥根據(jù)血清樣本酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值和規(guī)定的最少檢測樣本數(shù)，按照雞群血清樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度的大小，平均吸光度高于臨界值的確定為雞群感染了禽流感野毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟②中所述的融合蛋白，其分子量為44.2KD。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟③中所述的酶聯(lián)免疫吸附試驗，其反應(yīng)條件為抗原的包被濃度為40μg/mL，抗體的稀釋倍數(shù)為1∶200，抗原抗體反應(yīng)時間是1h，酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)是1∶10000，酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時間是1h。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟④中所述的禽流感血清酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值，是由對70份禽流感H9N2感染組雞血清、30份30日齡非免疫雞的陰性血清、95份禽流感H9N2滅活疫苗接種組雞血清進行統(tǒng)計學(xué)分析后，取30日齡非免疫雞的陰性血清的平均值加三個標(biāo)準(zhǔn)差而得。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟④中所述的禽流感血清酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值是0.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟④中所述的最少檢測樣本數(shù)是通過統(tǒng)計學(xué)分析，規(guī)定酶聯(lián)免疫吸附試驗確定雞群整體是否感染禽流感病毒的所需要的最少的雞的個數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟④中所述的最少檢測樣本數(shù)是30。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，其特征是，步驟⑤中所述的按照雞群血清樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度的大小，確定雞群是否感染禽流感野毒，是指雞群血清樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度大于0.5，雞群感染禽流感病毒；雞群血清樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均吸光度小于0.5，雞群沒有感染禽流感野毒。
專利摘要
一種鑒別診斷禽流感感染雞群的酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明首先將H9N2型禽流感病毒進行擴增，獲得目的片斷，將該片斷與載體連接，得到重組表達質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌表達，獲得一個融合蛋白；該融合蛋白經(jīng)過純化，得到H9N2型禽流感病毒NS1蛋白，將該蛋白作為抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗方法測定待檢血清中與抗原反應(yīng)的抗體水平，通過統(tǒng)計學(xué)分析確定酶聯(lián)免疫吸附試驗陰陽性判定的臨界值、最少的檢測樣本數(shù)；最后根據(jù)雞群樣本的酶聯(lián)免疫吸附試驗平均OD值大小，從群體水平鑒別診斷雞群是否被禽流感野毒感染。本發(fā)明方法從總體鑒別診斷，降低了非特異性反應(yīng)，為及時診斷、預(yù)防禽流感提供科學(xué)依據(jù)。
文檔編號G01N33/543GK1996021SQ200610148212
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發(fā)明者孫建和, 王琰, 陸承平, 嚴(yán)亞賢 申請人:上海交通大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan