本發(fā)明涉及化學(xué)分析檢測，尤其是涉及一種基于亞硝酸鹽比色探針快速檢測煙葉霉變的方法。

背景技術(shù)：

1、煙草作為一種重要的經(jīng)濟作物，其從田間種植到最終加工成卷煙的過程復(fù)雜且耗時，通常需歷經(jīng)采收、烘烤、收購、運輸、打葉復(fù)烤以及醇化等多個環(huán)節(jié)，整個周期普遍長達2-3年。在這個過程中，煙草的品質(zhì)保持與儲存管理至關(guān)重要，直接關(guān)系到卷煙產(chǎn)品的質(zhì)量和消費者的接受度。

2、霉菌是自然界廣泛存在的真菌類微生物，它們對生長環(huán)境的溫濕度條件極為敏感，一旦條件適宜，便能迅速繁殖，對煙草造成嚴重的霉變威脅。霉變不僅會導(dǎo)致煙葉的物理結(jié)構(gòu)受損，還會引發(fā)化學(xué)成分的劣變，特別是亞硝酸鹽含量的增加，這不僅影響煙草的口感和香氣，還可能對人體健康構(gòu)成潛在風(fēng)險。因此，探索有效的煙草防霉變技術(shù)，對于保障煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和維護消費者健康具有重要意義。

3、當(dāng)前，針對煙草霉變問題的研究主要集中在探索霉菌生長機制、開發(fā)新型防霉劑以及優(yōu)化倉儲條件等方面。然而，這些措施往往難以從根本上解決霉菌繁殖帶來的亞硝酸鹽含量升高問題。研究表明，霉菌活動能激活煙葉內(nèi)部的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶，這兩種酶活性的升高直接導(dǎo)致亞硝酸鹽積累，加劇了煙草品質(zhì)的惡化。

4、納米酶作為一種新興的酶模擬材料，因其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)和潛在的生物催化活性，在生物傳感、環(huán)境治理和醫(yī)療診斷等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。其中，金屬-有機框架(mofs)材料，特別是介孔鋯-卟啉mofs(如pcn-222)，因其多孔結(jié)構(gòu)、組成可調(diào)性和易于化學(xué)修飾的特點，被視為具有巨大潛力的納米酶候選材料。然而，原始的pcn-222納米顆粒在模擬過氧化物酶活性方面仍存在不足，主要表現(xiàn)為電子轉(zhuǎn)移能力有限，酶活性不強，這限制了其在煙草防霉變及亞硝酸鹽控制方面的應(yīng)用。

5、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于亞硝酸鹽比色探針快速檢測煙葉霉變的方法，本發(fā)明首次提出了利用煙葉霉變過程中亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律，進行煙葉霉變的預(yù)測，并利用ce-pcn-222納米酶建立了亞硝酸鹽比色探針測定的新方法，該霉變煙葉的識別過程簡單、快速、準(zhǔn)確，易于推廣，可有效降低煙葉霉變帶來的經(jīng)濟損失。

2、本發(fā)明提供一種基于亞硝酸鹽比色探針快速檢測煙葉霉變的方法，利用ce-pcn-222納米酶具有將2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸氧化為綠色的氧化2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的性質(zhì)，以及亞硝酸鹽對ce-pcn-222納米酶過氧化物酶氧化體系酶增敏的作用，基于煙葉霉變過程中微生物造成硝酸鹽還原酶變化而引起亞硝酸鹽濃度的變化，建立亞硝酸鹽比色探針快速檢測煙葉霉變的方法。

3、本發(fā)明首次公開了使用亞硝酸鹽作為煙葉霉變標(biāo)記物，并利用煙葉霉變過程中亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律，進行煙葉霉變的預(yù)測；與此同時，利用本發(fā)明所合成的ce-pcn-222納米酶具有的模擬過氧化物酶特性，在亞硝酸鹽存在下，羥基自由基(·oh)激發(fā)no2-產(chǎn)生no2-·，從而提高了體系的過氧化物酶活性，建立了no2-比色探針檢測的新方法。

4、具體地，ce-pcn-222納米酶具備將2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)氧化為呈綠色的氧化2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的(ox-abts)的性質(zhì)，此時，煙葉霉變產(chǎn)生的亞硝酸鹽對ce-pcn-222納米酶過氧化物酶氧化體系會產(chǎn)生酶增敏作用，進而導(dǎo)致吸光度增加。而煙葉霉變過程中，亞硝酸鹽含量先逐漸增加后逐漸降低，出現(xiàn)霉變時，亞硝酸鹽含量達到最大值，其變化率在70％-80％之間，因此，亞硝酸鹽含量變化率在70％-80％之間可作為霉變煙葉的預(yù)測及識別標(biāo)準(zhǔn)。

5、研究表明，該方法能以高達90％以上的準(zhǔn)確率快速識別霉變煙葉，大幅提高了霉變煙葉的識別效率和準(zhǔn)確性。

6、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，本發(fā)明基于亞硝酸鹽比色探針快速檢測煙葉霉變的方法，具體包括以下步驟：

7、首先，在2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、h2o2、ce-pcn-222納米酶和no2-的標(biāo)準(zhǔn)檢測體系中，加入醋酸-醋酸鹽緩沖溶液，反應(yīng)5-10min，建立吸光度與no2-濃度的定量關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程；

8、然后，在2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、h2o2和ce-pcn-222納米酶的樣品檢測體系中，分別加入正常煙葉提取物和霉變煙葉提取物，并分別加入醋酸-醋酸鹽緩沖溶液，反應(yīng)5-10min后，測定吸光度，根據(jù)回歸方程，即可得到煙葉提取物中的no2-的含量。

9、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，在標(biāo)準(zhǔn)檢測體系或樣品檢測體系中，no2-溶液的濃度范圍為0.25-37.5mg/l；

10、ce-pcn-222溶液的濃度范圍為0.1mg/ml，添加量為50-100μl；

11、abts溶液的濃度范圍為50mmol/l，添加量為20-50μl，

12、h2o2的濃度范圍為50mmol/l，添加量為20-50μl。

13、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，本發(fā)明吸光度測試的波長為400-450nm，并優(yōu)選為415nm。

14、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，本發(fā)明所使用醋酸-醋酸鹽緩沖溶液的ph為3.5-5，并優(yōu)選為4。

15、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，所述ce-pcn-222納米酶的制備方法包括以下步驟：

16、s1、取zrcl4和苯甲酸加入純凈水和dmf中，攪拌均勻后，加入中-四(4-羧基苯基)卟吩，攪拌均勻后，加入乙酸，得到均相溶液；

17、s2、將均相溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，加熱至110-130℃下反應(yīng)4-5h，冷卻至室溫，所得產(chǎn)物依次經(jīng)離心分離、洗滌和真空干燥，得到pcn-222；

18、s3、將pcn-222和ce(no3)3分散于乙二醇中，加入去離子，攪拌均勻后，迅速加入預(yù)冷后的nabh4水溶液中，持續(xù)攪拌2-3h，所得產(chǎn)物依次經(jīng)離心分離、洗滌和真空干燥，得到ce-pcn-222納米酶。

19、在本發(fā)明ce-pcn-222納米酶的制備過程中，首先，步驟s1中，選擇zrcl4和苯甲酸作為主要的原料，兩者在水中和dmf(二甲基甲酰胺)溶劑中具有較好的溶解性，為后續(xù)的配位反應(yīng)提供了基礎(chǔ)；中-四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp)作為一種有機配體，具有與金屬離子配位的能力。在攪拌過程中，tcpp與zr4+離子發(fā)生配位反應(yīng)，形成穩(wěn)定的鋯氧簇(zr6?cluster)結(jié)構(gòu)；同時，苯甲酸作為輔助配體，也有助于穩(wěn)定這種結(jié)構(gòu)。然后，步驟s2將配位反應(yīng)后的均相溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中進行溶劑熱合成。在高溫高壓的條件下，zr6?cluster與tcpp進一步組裝形成具有多孔結(jié)構(gòu)的mof(金屬有機框架)材料，即pcn-222。這種mof材料具有較大的孔徑和比表面積，有利于后續(xù)催化反應(yīng)的進行。最后，步驟s3中，將pcn-222與ce(no3)3分散于乙二醇中，通過攪拌使ce3+離子均勻分布在pcn-222的孔道中；其中，乙二醇作為溶劑和還原劑的前體，有助于后續(xù)的還原反應(yīng)；進一步加入去離子水后，迅速加入預(yù)冷后的nabh4水溶液，nabh4作為一種強還原劑，能夠在低溫下將ce3+離子還原為ceo2納米顆?；騝e的低價態(tài)離子，并均勻地沉積在pcn-222的孔道內(nèi)，在這一過程中，乙二醇還起到協(xié)同還原的作用，通過還原反應(yīng)，ceo2納米顆?；騝e的低價態(tài)離子與pcn-222的框架結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合，形成ce-pcn-222納米酶。

20、因此，本發(fā)明所制備得到的ce-pcn-222納米酶不僅繼承了pcn-222的多孔結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，還賦予了ce元素的催化活性，由于ce元素具有多種價態(tài)和優(yōu)異的氧化還原性能，因此ce元素的摻入改變了pcn-222的電子結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)，并賦予了其模擬過氧化物酶活性的特性。

21、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，步驟s1中，每350-400mgzrcl4對應(yīng)所需苯甲酸、純凈水、dmf、中-四(4-羧基苯基)卟吩和乙酸的用量分別為8-10g、8-10ml、80-100ml、350-400mg和5-6ml。

22、具體地，步驟s1包括：稱取350-400mg?zrcl4，8-10g苯甲酸，加到8-10ml純凈水及80-100ml?dmf中，攪拌5-10min后，加入350-400mg中-四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp)，在室溫下繼續(xù)攪拌5-10min，然后加入5-6ml乙酸，混合均勻，得到均相溶液。

23、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，步驟s2包括：將該均相溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，加熱至110-130℃反應(yīng)4-5h，冷卻至室溫后，產(chǎn)物在8000-10000rpm下離心5-10min分離，然后分別使用乙醇及丙酮各洗滌2-3次，最后真空干燥，得到pcn-222。

24、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，步驟s3中，每300-400mgpcn-222對應(yīng)所需ce(no3)3、乙二醇、去離子水和nabh4水溶液的用量分別為120-150mg、15-20ml、20-30ml和5-6ml；其中，nabh4水溶液中，nabh4的濃度為80-120mm。

25、具體地，步驟s3包括：將300-400mg?pcn-222及120-150mg?ce(no3)3充分分散于15-20ml乙二醇中，然后加入20-30ml去離子水，室溫下攪拌5?-10min，后迅速加入5-6ml?nabh4(100mm，預(yù)冷)水溶液，持續(xù)攪拌2-3h，產(chǎn)物在8000-10000rpm下離心5-10min分離，將沉淀物使用去離子水及乙醇交替洗滌2-3次，最后真空干燥，即可得到ce-pcn-222納米酶。

26、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，正常煙葉提取物或霉變煙葉提取物的制備方法包括：

27、稱取煙葉粉末(精確至1mg)和活性炭置于離心管中，并依次加入純凈水和飽和硼砂溶液，混勻后超聲10-15min，再在70-80℃下加熱提取15-20min，以5000r/min轉(zhuǎn)速離心10-15min，取上層清液，得到煙葉提取物。

28、作為本技術(shù)方案優(yōu)選地，每1g煙葉粉末對應(yīng)所需活性炭、純凈水和飽和硼砂溶液的用量分別為1.5-2.0g、50-60ml和3-4ml。

29、其中，霉變煙葉的制備方法包括以下步驟：

30、將煙葉樣品放入恒溫恒濕箱(溫度為25±2℃，濕度為60±5％)條件下進行煙葉霉變實驗，以14天為周期，按照以下方式進行取樣：

31、(1)第0天，即放入25℃和65％濕度條件的恒溫恒濕箱之前，進行第1次采樣；

32、(2)第1-14天，分別在1、2、4、7、9、11、12、13、14天進行采樣。

33、根據(jù)不同霉變程度煙葉樣品中no2-的含量，建立no2-的含量變化率與煙葉霉變相關(guān)性，確定煙葉霉變識別的no2-變化率范圍。

34、本發(fā)明基于亞硝酸鹽比色探針快速檢測煙葉霉變的方法，至少具備以下有益效果：

35、1、本發(fā)明基于煙葉霉變過程中微生物造成硝酸鹽還原酶變化而引起亞硝酸鹽濃度的變化，利用呈納米立方體和片狀混合結(jié)構(gòu)的卟啉基金屬-有機框架化合物(ce-pcn-222)具有的模擬氧化酶納米酶活性，將2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)氧化為呈綠色的氧化ox-abts，由于霉變產(chǎn)生的亞硝酸鹽對納米酶過氧化物酶氧化體系具有酶增敏作用，導(dǎo)致吸光度增加，建立亞硝酸鹽檢測新方法。煙葉霉變過程中，亞硝酸鹽含量逐漸增加后逐漸降低，出現(xiàn)霉變時，亞硝酸鹽含量達到最大值，其變化率在70％-80％間，因此，亞硝酸鹽含量變化率在70％-80％之間可作為霉變煙葉的預(yù)測及識別標(biāo)準(zhǔn)。該方法能以高達90％以上的準(zhǔn)確率快速識別霉變煙葉，大幅提高了霉變煙葉的識別效率和準(zhǔn)確性；

36、2、與傳統(tǒng)煙葉霉變檢測方法相比，如感官評價、化學(xué)分析或微生物培養(yǎng)等，本發(fā)明的方法更為簡單直接，無需復(fù)雜的樣品預(yù)處理或長時間的實驗過程，通過比色反應(yīng)即可快速判斷煙葉的霉變狀態(tài)，大幅縮短了檢測時間，提高了工作效率；

37、3、本發(fā)明使用的材料(如ce-pcn-222納米酶、abts等)相對易于獲取且成本較低，同時操作簡便，減少了高昂的檢測設(shè)備和專業(yè)人員的依賴，降低了檢測成本，具有顯著的經(jīng)濟優(yōu)勢；

38、4、本發(fā)明可及時準(zhǔn)確地識別出霉變煙葉，有助于在霉變初期就采取措施，如調(diào)整存儲條件、及時處理霉變煙葉等，從而有效減少因霉變導(dǎo)致的煙葉質(zhì)量下降和經(jīng)濟損失。對于保障煙草制品的質(zhì)量穩(wěn)定、維護消費者權(quán)益以及促進煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義；

39、綜上所述，本發(fā)明提供的基于亞硝酸鹽比色探針快速識別煙葉霉變的方法，不僅提高了檢測效率和準(zhǔn)確性，還降低了成本，對于保障煙草產(chǎn)品質(zhì)量、減少經(jīng)濟損失以及推動煙草行業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。