本發(fā)明屬于生物傳感器，涉及一種利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應(yīng)放大檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝細(xì)胞癌的死亡率幾乎和發(fā)病率持平，是影響人類健康的最大威脅之一，肝細(xì)胞癌危險(xiǎn)因素多，早期癥狀隱匿，預(yù)后差等原因使其患者發(fā)病率逐年增加。因此，探索靈敏、快速、特異的新型肝癌標(biāo)志物和檢測(cè)工具對(duì)肝細(xì)胞癌的早期監(jiān)測(cè)和診斷尤其重要。衰老標(biāo)記蛋白-30(smp30)，又稱調(diào)節(jié)鈣蛋白，主要以正常人肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)為主，而在hcc組織中smp30的表達(dá)量低于hcc癌旁組織。雖然，傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物是由癌細(xì)胞直接產(chǎn)生的，但腫瘤能夠誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體，該抗體表達(dá)水平同腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，能夠在腫瘤相關(guān)抗原濃度低的情況下作為腫瘤的診斷標(biāo)志物相關(guān)研究表明，smp30抗體在afp陰性的早期肝癌中有顯著的陽性表達(dá)，因此，smp30抗體被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌的一個(gè)有吸引力的新型靶點(diǎn)，可作為追蹤、診斷早期肝癌的可靠腫瘤標(biāo)志物。

2、納米酶是指尺寸在納米結(jié)構(gòu)范圍，由單組分的納米材料制備的人造酶。它表現(xiàn)出類似天然酶的催化性能和其獨(dú)特的穩(wěn)定性，同時(shí)還能夠根據(jù)使用條件對(duì)其表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行修改。在過去的幾十年，已有各種類型納米酶被設(shè)計(jì)，根據(jù)其組分和催化活性機(jī)制，主要分為金屬粒子納米酶、金屬化合物納米酶、非金屬納米酶和其它類型：(i)金、銀、鉑和鈀等金屬納米粒子組成的納米酶，這類納米酶對(duì)非均相反應(yīng)表現(xiàn)出良好的催化性能，在不做任何修飾的情況下表現(xiàn)出超高的類過氧化物酶活性。其催化過程與ph、底物在反應(yīng)體系里的量和活化程度有關(guān).(ii)金屬化合物納米酶，包括雙金屬粒子合金和金屬與其它納米材料的復(fù)合物，在催化過程中通過多種納米材料的空間協(xié)同作用，發(fā)揮出超高的催化性能和多酶活性。(iii)非金屬納米酶,部分碳基納米材料如石墨烯、富勒烯、量子點(diǎn)等，因其特有的模擬酶催化能力被視為納米酶研究的新方向。其催化能力主要是由納米材料內(nèi)部電子密度和電子轉(zhuǎn)移效率或帶隙作用發(fā)揮效應(yīng)。(iv)除此之外，目前有研究通過刻蝕方法構(gòu)建了一種具有納米通道的納米酶，其催化氧化還原能力提高多倍。目前，越來越多催化性能優(yōu)異的納米酶被用來開發(fā)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的生物傳感器，為了滿足臨床腫瘤標(biāo)志物診斷的要求，納米酶在腫瘤標(biāo)志物傳感分析設(shè)計(jì)中的特異性和靈敏度也是其未來需要探究的新領(lǐng)域，此外對(duì)于構(gòu)建功能化的生物傳感器仍需探究其納米材料潛在利用價(jià)值。

3、用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的生物傳感器因其結(jié)果可靠、分析速度快而被廣泛應(yīng)用于分子診斷。然而，大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物為惰性的蛋白質(zhì)分子，在檢測(cè)過程中很難被直接檢測(cè)。酶通常被標(biāo)記在識(shí)別探針上作為酶催化信號(hào)放大的外源信號(hào)分子，在三明治型生物傳感系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用。二茂鐵(fc)是一種由兩個(gè)環(huán)戊二烯基環(huán)連接中心鐵原子構(gòu)成的有機(jī)過渡金屬化合物，具有可逆的氧化還原狀態(tài)和較高的電化學(xué)活性，是一種理想的電信號(hào)分子。因此，為了進(jìn)一步提高分析目標(biāo)分子的傳感器性能，基于fc及其衍生物的電活性分子被廣泛用于電子傳遞介質(zhì)的生物傳感器構(gòu)建中。近年來，基于酶催化信號(hào)放大技術(shù)，已有大量報(bào)道用于超靈敏痕量分析的生物傳感器。酪胺信號(hào)放大(tsa)是早期通過原位擴(kuò)增來增強(qiáng)熒光免疫組化分析的技術(shù)。目前，其原位擴(kuò)增的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到傳感器策略中，其反應(yīng)原理中酶在h2o2存在下催化酪胺形成共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)，新加入的酪胺及其復(fù)合物可短時(shí)間內(nèi)與之穩(wěn)定結(jié)合，促使原始信號(hào)幾何放大。

4、目前尚未有合成了一種新型二茂鐵基的電活性物質(zhì)二茂鐵酪作為電活性探針開發(fā)了一個(gè)用于特異性檢測(cè)肝癌標(biāo)志物gpc3的生物傳感分析平臺(tái)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明目的是，針對(duì)上述問題，提供了一種利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應(yīng)放大檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用，以首先以鼠源單克隆抗體為分析物，基于96孔板的獨(dú)立免疫反應(yīng)和納米酶go-hemin催化二茂鐵酪胺沉積反應(yīng)，提出了一種用于檢測(cè)肝癌腫瘤標(biāo)志物smp30抗體的分體式生物傳感器模型。并探究了其可行性，隨后利用該傳感器模型對(duì)smp30抗體進(jìn)行定量分析。在靶標(biāo)物質(zhì)存在的情況下，納米酶高效、穩(wěn)定、快速的酶催化活性與氧化還原性能優(yōu)異的二茂鐵酪胺協(xié)同作用，使大量的電活性物質(zhì)二茂鐵酪胺沉積在電極表面，電流信號(hào)輸出值發(fā)生顯著改變。該分體式生物傳感器特異、靈敏的分析性能實(shí)現(xiàn)了smp30抗體的快速檢測(cè)，也為其它腫瘤標(biāo)志物的傳感分析提供新思路。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

3、利用納米酶促電活性分子二茂鐵-酪胺沉積反應(yīng)放大檢測(cè)信號(hào)的電化學(xué)免疫傳感器，所述電化學(xué)免疫傳感器是基于96孔板和納米酶催化電活性分子二茂鐵-酪胺沉積信號(hào)放大的超靈敏分體式生物傳感器，將電活性分子二茂鐵-酪胺作為信號(hào)放大元件，標(biāo)記于信號(hào)抗體，通過捕獲抗體探針、目標(biāo)抗原和信號(hào)抗體之間的夾心免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)電流檢測(cè)信號(hào)的顯著放大和對(duì)目標(biāo)抗原的靈敏檢測(cè)。

4、本發(fā)明還提供一種入上述所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，具體包括以下步驟：

5、(1)制備免疫復(fù)合物go/hemin-ab2：

6、s1、將羧基化氧化石墨烯溶于超純水中，超聲分散，離心，取上清液，

7、s2、接著再將氯化血紅素溶于二甲基甲酰胺中，與步驟s1得到的上清液混合，超聲處理，再通過離心將沉淀物和上清液分離，pbs緩沖液洗滌2次，在烘箱中干燥得到go/hemin，然后，將得到的氯化血紅素功能化的go/hemin分散到超純水中，超聲后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫下攪拌，再加入多克隆抗體，反應(yīng)，然后離心分離上清和沉淀，用pbs洗滌，最后在真空干燥機(jī)中干燥后置于pbs溶液重懸，制備最終的免疫復(fù)合物go/hemin-ab2，備用；

8、(2)制備ge/au?nps/mpa/tyr修飾的金電極：

9、1)用氧化鋁勻漿拋光金電極，將打磨干凈的金電極放入無水乙醇中超聲清洗，接著在超純水中超聲清洗，如此交替超聲，重復(fù)3次；

10、2)將三電極系統(tǒng)同時(shí)置于0.5m?h2so4溶液中進(jìn)行電化學(xué)清洗，采用電化學(xué)循環(huán)伏安法慢掃，再進(jìn)行電解池充放電，將電解池接通，接著進(jìn)行cv快掃，最后再次進(jìn)行cv慢掃，以上操作重復(fù)兩次，ddh2o洗滌三次；

11、3)將ge浸入haucl4溶液中，電沉積au?nps，形成au?nps修飾的ge/au?nps，將ge/aunps在3-巰基丙酸中孵育過夜，得ge/au?nps/mpa，將edc-nhs溶液滴在ge/au?nps/mpa表面室溫孵育，接著將tyr溶液滴加到ge/au?nps/mpa表面，在室溫下孵育，利用羧基與氨基的縮合反應(yīng)，將酪胺固定在電極表面，用水沖洗后，獲得au?nps/mpa/tyr修飾的金電極(ge/aunps/mpa/tyr)；

12、(3)室溫下孵育目標(biāo)ag，以使ab1與ag發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；再滴加步驟(1)制備好的go-hemin-ab2孵育1h，然后將14μl?1mg.ml-1fc-tyr、14μl?1mg.ml-1tyr、14μl50mm?h2o2組合成的混合溶液繼續(xù)滴入，同時(shí)將步驟(2)獲得的ge/au?nps/mpa/tyr也加入，在37℃中持續(xù)反應(yīng)30min，即可得到所述的電化學(xué)免疫傳感器。

13、進(jìn)一步說明，在步驟s1中，所述羧基化氧化石墨烯與超純水的比例為1mg：1ml，超聲分散3h以上，3000rpm離心30min。

14、進(jìn)一步說明，在步驟s2中，所述氯化血紅素用量為26.076mg、二甲基甲酰胺用量為4ml，超聲處理是室溫條件下130khz進(jìn)行3h，再通過13000rpm離心30min將沉淀物和上清液分離；所述go/hemin與超純水的比例為1mg：ml；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺用量為500μl，室溫下攪拌4h，再加入30μl濃度為1mg/ml的多克隆抗體，整個(gè)混合物體系在4℃下震蕩反應(yīng)24h，然后4℃、3000rpm離心30min分離上清和沉淀，用pbs洗滌2次，最后在真空干燥機(jī)中干燥12h后置于2ml?0.01m的pbs溶液重懸，制備最終的免疫復(fù)合物go/hemin-ab2，并在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

15、進(jìn)一步說明，在步驟1)中，所述氧化鋁勻漿的細(xì)度大小為0.3μm和/或0.05μm；所述超聲清洗均為5min。

16、進(jìn)一步說明，在步驟2)中，所述三電極系統(tǒng)包括金電極、鉑絲對(duì)電極、ag/agcl參比電極。

17、進(jìn)一步說明，在步驟2)中，所述電化學(xué)循環(huán)伏安法慢掃的掃描范圍為-0.25～1.5v，掃描速率為100mv/s；電解池接通的電壓為2v，5s和-0.25v，10s；所述cv快掃的掃描范圍為-0.25～1.5v，掃描速率為400mv/s。

18、進(jìn)一步說明，在步驟3)中，具體操作是將預(yù)處理好的石墨烯ge浸入haucl4溶液中，在-0.5v電勢(shì)下電沉積au?nps?120s，形成au?nps修飾的ge/au?nps，并用水沖洗電極3次，將ge/au?nps在300μl?10mm?3-巰基丙酸中于4℃下孵育過夜，得ge/au?nps/mpa，將40μl?10mmedc-nhs溶液滴在ge/au?nps/mpa表面室溫孵育40min，并用水清洗，接下來，將40μl1mg.ml-1tyr溶液滴加到ge/au?nps/mpa表面，并在室溫下孵育60min，利用羧基與氨基的縮合反應(yīng)，將酪胺固定在電極表面，用水沖洗后，獲得ge/au?nps/mpa/tyr修飾的金電極。

19、進(jìn)一步說明，在步驟(3)中，所述目標(biāo)ag是2.5μg/ml，100μl可溶性his-smp30蛋白滴加到96孔微孔板底部，4℃過夜，然后加入0.5％，100μl的bsa封閉液37℃封閉1h，隨后將不同濃度的100μl?ab1滴加到微孔板底部，37℃結(jié)合1h。

20、本發(fā)明還提供一種如上所述的電化學(xué)免疫傳感器或如上任一所述方法制備的電化學(xué)免疫傳感器在體外診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

21、由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下有益效果：

22、本發(fā)明構(gòu)建了一種基于96孔板和納米酶催化電活性分子二茂鐵-酪胺(fc-tyr)沉積信號(hào)放大的超靈敏分體式生物傳感器，用于檢測(cè)新型肝癌標(biāo)志物衰老標(biāo)記蛋白-30抗體(smp30抗體)。據(jù)報(bào)道，smp30抗體在肝細(xì)胞癌血清中有較高的陽性表達(dá)，功能性的電活性物質(zhì)fc-tyr既具有酪胺信號(hào)放大(tsa)的酶級(jí)聯(lián)催化活性，又具有二茂鐵的優(yōu)異氧化還原性能。在設(shè)計(jì)方面，利用96孔板獨(dú)立免疫反應(yīng)體系協(xié)同納米酶高效催化fc-tyr沉積，減少樣本直接孵育電極表面帶來的空間位阻，引入的納米酶觸發(fā)tsa，從而誘導(dǎo)大量fc-tyr逐層沉積在電極表面，所構(gòu)建的傳感分析平臺(tái)驗(yàn)證了納米酶促信號(hào)放大的分體式生物傳感的概念，smp30抗體分體式生物傳感器在0.1ng/ml至1μg/ml范圍內(nèi)對(duì)smp30抗體表現(xiàn)出較高的選擇性和靈敏度。最后，將該傳感器與elisa同時(shí)用于檢測(cè)臨床肝癌患者血清中的smp30抗體水平，結(jié)果顯示出一致性，回收率為93～104％，對(duì)腫瘤標(biāo)志物的便攜式、快速檢測(cè)又極大的推廣與應(yīng)用價(jià)值。