本發(fā)明涉及食品安全檢測，具體涉及一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鼠傷寒沙門氏菌，作為一種普遍存在的食源性病原體，嚴(yán)重威脅著公眾健康，能夠潛在地引發(fā)急性腸胃炎乃至敗血癥等嚴(yán)重疾病。鑒于此，實(shí)現(xiàn)對食品中該菌種的高效、精準(zhǔn)且快速的檢測顯得尤為重要。盡管微生物培養(yǎng)法因其原理直觀、技術(shù)成熟且檢測準(zhǔn)確性高，已被確立為我國國家標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定使用的檢測方法，但其顯著的局限性在于檢測周期冗長，通常需要3-5天才能完成，這明顯滯后于現(xiàn)代食品安全管理中對食源性致病菌快速響應(yīng)的需求。因此，探索并開發(fā)高靈敏度、高準(zhǔn)確性且能在更短時間內(nèi)完成檢測的新技術(shù)，對于提升食品安全檢測效率、保障公眾健康具有迫切意義。

2、基于現(xiàn)有檢測方法的局限性，化學(xué)發(fā)光生物傳感器由于響應(yīng)速度快、無需外部光源激發(fā)等優(yōu)勢在食源性致病菌檢測領(lǐng)域備受關(guān)注。然而，大多數(shù)化學(xué)發(fā)光底物，如魯米諾、吖啶酯等，均呈現(xiàn)閃光型化學(xué)發(fā)光，即發(fā)光和湮滅在幾秒內(nèi)完成，瞬時發(fā)光特性往往會導(dǎo)致較差的檢測精度和重現(xiàn)性。

3、dna水凝膠是dna鏈在溶液中高度交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。利用其致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能夠有效延緩化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物的擴(kuò)散，進(jìn)而延長化學(xué)發(fā)光時間，將閃光型化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)變?yōu)檩x光型化學(xué)發(fā)光。目前，已有基于dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器的報道，然而，這些dna水凝膠多依賴于大量短dna鏈之間的堿基互補(bǔ)配對作用而形成。這種化學(xué)合成的dna需要高純度的原材料和專業(yè)的儀器設(shè)備，由此導(dǎo)致的較高的dna合成成本限制了其在分析檢測領(lǐng)域的進(jìn)一步推廣與應(yīng)用。

4、滾環(huán)擴(kuò)增(rca)技術(shù)是一種等溫核酸放大技術(shù)，憑借其dna序列設(shè)計的靈活性與反應(yīng)條件的恒溫性，已成為構(gòu)建dna水凝膠的理想平臺。該技術(shù)生成的ssdna鏈富含由rca模板互補(bǔ)序列串聯(lián)而成的重復(fù)單元，賦予了dna水凝膠功能性和個性化定制潛力。根據(jù)檢測對象的適配體序列，設(shè)計相應(yīng)的引物和rca反應(yīng)模板序列，利用適配體、引物和目標(biāo)物之間的競爭性結(jié)合作用，可在目標(biāo)物誘導(dǎo)下，生成dna水凝膠，輔以相應(yīng)的檢測信號輸出，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的靈敏檢測。然而，rca產(chǎn)物dna水凝膠的形成通常需要24～72h，較長的成膠時間為現(xiàn)場快速檢測帶來諸多不便，無法滿足鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器及其應(yīng)用。本發(fā)明通過abei/co2+/go加速dna水凝膠的形成，進(jìn)而利用dna水凝膠延緩反應(yīng)物擴(kuò)散以延長化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時間，制備了輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，有效克服了閃光型化學(xué)發(fā)光的缺陷，為鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測提供諸多便利。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種基于abei/co2+/go@dna水凝膠的輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器包括適配體-引物復(fù)合物、環(huán)狀的模板、二級引物、phi29?dna聚合酶、dntps、abei/co2+/go和目標(biāo)物；

4、所述適配體-引物復(fù)合物中適配體序列如seq?no.1所示，引物序列如seq?no.2所示；

5、所述模板序列如seq?no.3所示；

6、所述二級引物序列如seq?no.4所示。

7、進(jìn)一步地，所述abei/co2+/go的制備方法為：

8、(1)將abei溶液與go溶液混合，于25℃、1000rpm條件下避光震蕩孵育12h，得到abei/go；

9、(2)然后加入氯化鈷溶液，于25℃、1000rpm條件下避光震蕩孵育3h，于12500rpm條件下離心20min、棄上清，經(jīng)超純水洗滌，復(fù)溶，得到abei/co2+/go。

10、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述abei溶液的配置方法為：將27.633mg的abei溶解于10ml濃度為0.1mol/l的naoh溶液中；所述go溶液的配置方法為：將0.1mg?go溶解于1ml純水中，于400w超聲處理1h；所述abei溶液與go溶液的體積比為0.1:1。

11、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述氯化鈷溶液的配置方法為：將237.9mg六水合氯化鈷溶解并定容于100ml純水中；所述氯化鈷溶液與go溶液的體積比為0.25:1。

12、進(jìn)一步地，所述適配體-引物復(fù)合物的制備方法為：

13、(1)將20μl?10μmol/l的適配體與20μl?10μmol/l引物于pcr管中混合均勻，置于pcr儀中，在95℃下退火10min，然后緩慢冷卻以獲得適配體-引物復(fù)合物；

14、(2)向其中加入14μl?5u/μl的核酸外切酶ⅰ以酶解未結(jié)合的dna單鏈，制備得到純化后的適配體-引物復(fù)合物。

15、進(jìn)一步地，所述環(huán)狀的模板制備方法如下：

16、(1)將30μl?20μmol/l的成環(huán)引物與鏈狀的模板混合均勻，采用梯度降溫法進(jìn)行雜交，得到模板的環(huán)狀dna前體；

17、所述成環(huán)引物序列如seq?no.5所示；

18、(2)再加入7.5μl?400u/μl的t4?dna連接酶，在37℃下孵育2h，并在65℃下孵育10min滅酶；然后依次加入10μl?5u/μl的exoⅰ酶、5μl?200u/μl的exoⅲ酶，先在37℃孵育1h，然后在80℃下孵育20min，得到純化后的環(huán)狀的模板。

19、一種所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器的應(yīng)用，所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌。

20、進(jìn)一步地，使用所述輝光型化學(xué)發(fā)光傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法包括如下步驟：

21、(1)制備abei/co2+/go@dna水凝膠；

22、(2)向abei/co2+/go@dna水凝膠中加入100μl?0.01mol/l的h2o2溶液中反應(yīng)1min后，拍攝發(fā)光圖像，并使用image?j軟件分析其rgb值，將rgb值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣品中目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌的濃度。

23、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述abei/co2+/go@dna水凝膠的制備方法為：

24、(1)取54μl制備的適配體-引物復(fù)合物，加入246μl待測目標(biāo)物，于37℃、600rpm條件下震蕩孵育45min，使適配體識別并結(jié)合目標(biāo)物，然后經(jīng)0.22μm的濾膜過濾，收集濾液，得到游離的引物；

25、(2)取30μl游離的引物，與15μl?3μmol/l二級引物、3μl環(huán)狀模板、2.5μl?25mmol/l的dntps、1μl純水、6μl?10×phi29?dna聚合酶反應(yīng)緩沖液和2.5μl?10u/μl的phi29?dna聚合酶充分混合，于37℃，800rpm下孵育25min；然后加入15μl?abei/co2+/go，于37℃，1050rpm下孵育10min，得到abei/co2+/go@dna水凝膠。

26、進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝49.24+1.34*x，r2＝0.9942，其中y表示rgb值，x表示鼠傷寒沙門氏菌的濃度的對數(shù)值。

27、本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

28、本發(fā)明利用鼠傷寒沙門氏菌適配體的互補(bǔ)序列和鼠傷寒沙門氏菌對其適配體的競爭性結(jié)合，釋放出游離的互補(bǔ)序列，體系中游離的互補(bǔ)序列作為rca的引物，觸發(fā)rca反應(yīng)，并在二級引物的作用下產(chǎn)生大量長鏈dna。因此，只有在鼠傷寒沙門氏菌存在的情況下，才會觸發(fā)rca反應(yīng)，生成足量長鏈dna用于后續(xù)自組裝為dna水凝膠。通過向rca體系中添加abei/co2+/go，體系中的長鏈dna在靜電吸引、π-π堆積、配位以及物理纏繞等作用下迅速成膠，同時將abei/co2+/go包裹在水凝膠內(nèi)部。當(dāng)檢測樣品中的目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌濃度越高，dna水凝膠越大，被捕獲的abei/co2+/go越多，從而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越強(qiáng)。因此，可以通過智能手機(jī)拍照化學(xué)發(fā)光圖像，image?j軟件分析其rgb值來測定鼠傷寒沙門氏菌的濃度。此外，也將該傳感器用于實(shí)際樣品檢測，檢測結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果之間不存在顯著性差異，證明了該傳感器的優(yōu)良性能。所構(gòu)建的檢測方法具有操作簡單、選擇性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，對在食品安全領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用方面具有重要意義。

29、本發(fā)明通過將abei/co2+/go加入體系中，顯著加速dna水凝膠的形成，可有效縮短檢測時間。

30、本發(fā)明利用dna水凝膠延緩反應(yīng)物擴(kuò)散的能力，將閃光型化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)變?yōu)檩x光型化學(xué)發(fā)光，無需精密、昂貴的化學(xué)發(fā)光儀器，僅需智能手機(jī)拍照、image?j軟件分析rgb值即可測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，能夠滿足鼠傷寒沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測需求。