本發(fā)明屬于生物藥物領(lǐng)域,具體涉及一種蛋白聚合物的純度分析方法。
背景技術(shù):
1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells,mscs)具有自我復(fù)制和多向分化潛能,廣泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盤、臍帶、胚胎、臍帶血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等組織,具有來源廣泛、無需配型、感染率低、分化潛能強、增殖能力強、采集方便等特點,可產(chǎn)生干細(xì)胞生長因子(scf)、神經(jīng)生長因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、腫瘤壞死因子(tnf)、干擾素(ifn)等活性因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、抗病毒、免疫成熟等過程,可用于免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)及治療急性肺損傷、重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征等疾病。
2、發(fā)明人研發(fā)發(fā)現(xiàn),通過刺激mscs,之后裂解mscs,從胞內(nèi)蛋白中可以分離純化獲得一種具有神經(jīng)修復(fù)活性的蛋白聚合物。該蛋白聚合物在已完成的動物及臨床實驗中取得了顯著的效果,尤其對als有明顯的治療效果,具有明確的成藥可能,現(xiàn)已進入臨床實驗階段。
3、現(xiàn)有階段,蛋白聚合物是通過在特定應(yīng)激狀態(tài)刺激mscs表達(dá),并對提取的生物活性物質(zhì)進行分離純化得到。在實驗期間,對細(xì)胞的選擇性基因表達(dá)的干預(yù)和控制手段相對有限,導(dǎo)致得到的蛋白聚合物的質(zhì)量控制也相對困難。因此,開發(fā)一種蛋白聚合物的純度分析方法,對于分析蛋白聚合物的純度和穩(wěn)定蛋白聚合物的質(zhì)量,有著非常重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個不足,提供一種蛋白聚合物的純度分析方法。
2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
3、一種蛋白聚合物的純度分析方法,包括:
4、s1:對蛋白聚合物進行前處理,制備得到預(yù)定蛋白濃度的樣品;
5、s2:量取預(yù)定進樣量的所述樣品,送入毛細(xì)管電泳儀進行毛細(xì)管電泳檢測,設(shè)定進樣電壓為3-9kv,分離電壓為10-20kv,進樣量為25-100μl,毛細(xì)管溫度設(shè)為10-40℃,流動相設(shè)為:ce-sds?gel?buffer,洗脫壓力為10-40psi,設(shè)定出峰峰寬為1-8秒,得到色譜圖;以及
6、s3:分析所述色譜圖中的信號峰,篩選預(yù)定規(guī)模以上的信號峰為主峰,其中,面積最大的主峰為蛋白峰,分析得出蛋白聚合物的純度信息。
7、通過對蛋白聚合物前處理,得到適配于毛細(xì)管電泳儀的樣品,并設(shè)置相適配的檢測條件,樣品在毛細(xì)管內(nèi)經(jīng)高壓驅(qū)動,不同分子量的分子電泳速度不同而相互分離,并在不同時間點產(chǎn)生對應(yīng)得信號峰,形成色譜圖,篩選色譜圖中預(yù)定規(guī)模以上的信號峰為主峰,定義面積最大的主峰為蛋白峰,并計算各個主峰的面積占比,得出蛋白聚合物的純度信息,篩選出的主峰數(shù)量越少且蛋白峰的面積占比越高代表蛋白聚合物的純度越高,蛋白峰的面積占比的值反映蛋白聚合物中的蛋白純度,經(jīng)過重復(fù)性實驗,采用本純度分析方法所得的檢測結(jié)果一致度好,純度分析結(jié)果的置信度高,可用于建立蛋白聚合物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),還能協(xié)助系統(tǒng)性地進行蛋白聚合物的定性和定量分析??梢岳斫獾氖?,樣品中的內(nèi)標(biāo)物會在色譜圖中形成一個內(nèi)標(biāo)峰,上述信號峰不包含該內(nèi)標(biāo)峰。
8、在一些實施例中,所述毛細(xì)管電泳儀為ab?sciex公司生產(chǎn)的型號為biophase8800的高通量毛細(xì)管電泳儀、所述樣品緩沖液為ab?sciex公司生產(chǎn)的貨號為c57805的low?phsds-sample?buffer,所述毛細(xì)管電泳儀中的毛細(xì)管的長度為30cm,所述樣品中還加入了預(yù)定分子量的內(nèi)標(biāo)物。采用上述儀器試劑,并在優(yōu)選的檢測條件下,得到峰形更好的信號峰。
9、在一些實施例中,所述蛋白聚合物的前處理還包括蛋白聚合物的非還原處理或還原處理,所述非還原處理為在量取的預(yù)定量的所述蛋白聚合物中加入預(yù)定量的碘乙酰胺;所述還原處理為在量取的預(yù)定量的所述蛋白聚合物中加入預(yù)定量的2-巰基乙醇。
10、在一些實施例中,經(jīng)過所述非還原處理得到的樣品在所述毛細(xì)管電泳儀中的分離條件為:持續(xù)時間10-60分鐘,電壓上升時間為1-5分鐘,自動調(diào)零時間設(shè)為0.1-0.9分鐘。
11、在一些實施例中,經(jīng)過所述還原處理得到的樣品在所述毛細(xì)管電泳儀中的分離條件為:持續(xù)時間10-60分鐘,電壓上升時間為0.5-3分鐘,自動調(diào)零時間設(shè)為2-8分鐘。
12、在一些實施例中,所述樣品中的蛋白濃度范圍為0.1mg/ml-5mg/ml。
13、在一些實施例中,所述蛋白聚合物在進行前處理之前還要進行超濾換液處理,所述超濾換液處理包括:
14、s01:量取預(yù)定體積的所述樣品,加入超濾管內(nèi);
15、s02:將所述超濾管送入離心機,離心10分鐘;
16、s03:再加入ce?water,混勻,繼續(xù)在離心機內(nèi)離心10分鐘;
17、s04:重復(fù)上述步驟s03三次,取最后一次離心后的上清液,將所述上清液濃縮至預(yù)定蛋白濃度。
18、在一些實施例中,所述樣品緩沖液為ph值小于7的低ph樣品緩沖液。
19、在一些實施例中,所述樣品在送入至所述毛細(xì)管電泳儀之前還需進行變性培養(yǎng),所述變性培養(yǎng)包括:
20、s11:將所述樣品移送離心機,離心1分鐘;
21、s12:將離心后的所述樣品在30-100℃水浴條件下靜置5-15分鐘;
22、s13:將水浴后的所述樣品置于室溫下避光靜置3-10分鐘;
23、s14:將所述樣品再次移送離心機,離心1分鐘。
1.一種蛋白聚合物的純度分析方法,其特征在于,所述方法包括:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純度分析方法,其特征在于,所述毛細(xì)管電泳儀為ab?sciex公司生產(chǎn)的型號為biophase8800的高通量毛細(xì)管電泳儀、所述樣品緩沖液為ab?sciex公司生產(chǎn)的貨號為c57805的low?ph?sds-sample?buffer,所述毛細(xì)管電泳儀中的毛細(xì)管的長度為30cm,所述樣品中還加入了預(yù)定分子量的內(nèi)標(biāo)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純度分析方法,其特征在于,所述蛋白聚合物的前處理還包括蛋白聚合物的非還原處理或還原處理,所述非還原處理為在量取的預(yù)定量的所述蛋白聚合物中加入預(yù)定量的碘乙酰胺;所述還原處理為在量取的預(yù)定量的所述蛋白聚合物中加入預(yù)定量的2-巰基乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純度分析方法,其特征在于,經(jīng)過所述非還原處理得到的樣品在所述毛細(xì)管電泳儀中的分離條件為:持續(xù)時間10-60分鐘,電壓上升時間為1-5分鐘,自動調(diào)零時間設(shè)為0.1-0.9分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純度分析方法,其特征在于,經(jīng)過所述還原處理得到的樣品在所述毛細(xì)管電泳儀中的分離條件為:持續(xù)時間10-60分鐘,電壓上升時間為0.5-3分鐘,自動調(diào)零時間設(shè)為2-8分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的純度分析方法,其特征在于,所述樣品中的蛋白濃度范圍為0.1mg/ml-5mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純度分析方法,其特征在于,所述蛋白聚合物在進行前處理之前還要進行超濾換液處理,所述超濾換液處理包括:
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純度分析方法,其特征在于,所述樣品緩沖液為ph值小于7的低ph樣品緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純度分析方法,其特征在于,所述樣品在送入至所述毛細(xì)管電泳儀之前還需進行變性培養(yǎng),所述變性培養(yǎng)包括: