本發(fā)明屬于生物樣本免疫檢測(cè)質(zhì)控品領(lǐng)域，具體涉及一種pd-1蛋白表達(dá)檢測(cè)質(zhì)量控制微球、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed?cell?death?protein?1，簡(jiǎn)稱pd-1)，又稱為cd279，屬于一類免疫球蛋白超加速成員的ⅰ型跨膜糖蛋白，結(jié)構(gòu)由288個(gè)氨基酸組成。是t細(xì)胞表面一種重要的免疫抑制分子，主要表達(dá)在t淋巴細(xì)胞表面，通過與靶細(xì)胞上受體結(jié)合傳導(dǎo)抑制性信號(hào)，從而抑制t淋巴細(xì)胞的增殖。正常情形下，免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)聚集在淋巴結(jié)或脾臟的外來(lái)抗原產(chǎn)生反應(yīng)，促進(jìn)具有抗原特異性的t細(xì)胞增殖，而細(xì)胞程序性死亡蛋白-1(pd-1)與細(xì)胞程序性死亡蛋白-配體1(pd-l1)的結(jié)合，可傳導(dǎo)抑制性信號(hào)，從而抑制t細(xì)胞增殖,抑制t細(xì)胞炎癥活動(dòng)，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并促進(jìn)自身耐受。臨床應(yīng)用中，檢測(cè)生物樣本中總t細(xì)胞(cd3+)、輔助t細(xì)胞(cd4+)、細(xì)胞毒性t細(xì)胞(cd8+)表面pd-1的表達(dá)水平，在腫瘤，感染性疾病，自身免疫性疾病，血液疾病等疾病中有重要的臨床意義。

2、目前，臨床上多使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)生物樣本中淋巴細(xì)胞表面pd-1蛋白的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀通過激光照射液流內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)，反映細(xì)胞的物理化學(xué)特征，如細(xì)胞的大小，顆粒度和表面抗原表達(dá)情況等。使用不同的抗體對(duì)生物樣本中的淋巴細(xì)胞表面抗原進(jìn)行標(biāo)記，可以得到不同類型淋巴細(xì)胞中pd-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的比例，進(jìn)而輔助臨床醫(yī)生對(duì)患者情況做出判斷。

3、通過流式細(xì)胞術(shù)分析生物樣本，欲獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定的分析結(jié)果，質(zhì)量控制應(yīng)貫穿始終。現(xiàn)有的流式細(xì)胞檢測(cè)質(zhì)控品有兩類，一類是用于流式細(xì)胞分析儀設(shè)備質(zhì)控的質(zhì)控微球，用于儀器設(shè)備的日常維護(hù)，狀態(tài)監(jiān)測(cè)；另一類來(lái)自臨床真實(shí)樣本，包括全血質(zhì)控品和經(jīng)凍干工藝保存的血液細(xì)胞制品，由于來(lái)自于臨床樣本，檢測(cè)過程與真實(shí)樣本相同，可用于操作過程質(zhì)控，尤其是可作為陽(yáng)性對(duì)照，用于結(jié)果分析時(shí)校正分析方法，或用作細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)使用。上述兩類流式檢測(cè)用質(zhì)控品，雖已被廣泛使用，但存在以下問題：

4、1)質(zhì)控微球：現(xiàn)有技術(shù)制備的質(zhì)控微球，多為設(shè)備校準(zhǔn)微球，雖具有制備工藝成熟、品質(zhì)可控、性能穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，但由于普通微球與淋巴細(xì)胞在光學(xué)上存在差異，導(dǎo)致其在流式平臺(tái)上，無(wú)法與淋巴細(xì)胞使用相同的檢測(cè)程序同時(shí)檢出；且微球與細(xì)胞在生物學(xué)上具有顯著區(qū)別，使微球無(wú)法直接用于流式平臺(tái)上特定靶標(biāo)染色過程的質(zhì)控。因此僅可用于流式細(xì)胞儀設(shè)備光電檢測(cè)器、流體部分及檢測(cè)通道之間的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)置和補(bǔ)償調(diào)節(jié)。使用時(shí)原則上需要每日開機(jī)流程后應(yīng)運(yùn)行儀器的質(zhì)控微球等，理想狀態(tài)是每個(gè)不同的檢測(cè)項(xiàng)目使用前進(jìn)行光路校準(zhǔn)，保證儀器處于最佳性能狀態(tài)，變異系數(shù)小于儀器軟件中的可接受范圍，但實(shí)現(xiàn)起來(lái)較為困難。

5、2)真實(shí)樣本制備的全血質(zhì)控品：多為血液制品或細(xì)胞制品的凍干品。一方面，pd-1蛋白在生物樣本中的表達(dá)形式為連續(xù)表達(dá)，即，陰陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)明顯分群界限，難以通過對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果圖的分析，明確劃分pd-1蛋白表達(dá)陰陽(yáng)性界限。同時(shí)，pd-1蛋白在血液中存在的半衰期短，穩(wěn)定性差，目前尚無(wú)對(duì)淋巴細(xì)胞表面pd-1蛋白準(zhǔn)確定量的金標(biāo)準(zhǔn)，使質(zhì)控品賦值過程困難。這些都給使用臨床樣本制備pd-1陽(yáng)性質(zhì)控品造成困難，即難以準(zhǔn)確定量或長(zhǎng)期保存，這也是造成此類質(zhì)控品不穩(wěn)定的最大風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前尚無(wú)商品化的pd-1陽(yáng)性質(zhì)控品；另一方面，使用真實(shí)樣本制備質(zhì)控品，制備工藝復(fù)雜，如凍干工藝對(duì)設(shè)備和工藝條件依賴性高，易造成產(chǎn)品批間差，同時(shí)，凍干類質(zhì)控品使用時(shí)需要復(fù)溶，不僅增加了操作的復(fù)雜度，也引入了不穩(wěn)定因素；而非凍干類的質(zhì)控品，運(yùn)輸和保存條件苛刻，保存時(shí)間短，已有的其它類型全血類質(zhì)控品保存期限僅為3個(gè)月。上述問題，不僅給利用真實(shí)樣本制備pd-1質(zhì)控品造成了困難，也給使用此類質(zhì)控品質(zhì)控生物樣本中pd-1檢測(cè)過程，引入了較高風(fēng)險(xiǎn)。

6、因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種質(zhì)控性能穩(wěn)定、制備工藝簡(jiǎn)便可靠、使用和保存條件相對(duì)簡(jiǎn)便的質(zhì)控品，可滿足對(duì)臨床樣本中pd-1蛋白檢測(cè)全流程系統(tǒng)穩(wěn)定性質(zhì)控的需求，對(duì)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行提示。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，開發(fā)了一種用于血樣pd-1檢測(cè)全流程的質(zhì)控微球及其制備工藝與質(zhì)控方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種pd-1蛋白表達(dá)檢測(cè)質(zhì)量控制微球、其制備方法及應(yīng)用。

2、在闡述本
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
之前，定義本文中所使用的術(shù)語(yǔ)如下：

3、術(shù)語(yǔ)“pd-1”是指：程序性細(xì)胞死亡蛋白-1，英文名為programmed?cell?deathprotein?1，簡(jiǎn)稱pd-1或cd279，是一種重要的免疫抑制分子，主要存在于免疫細(xì)胞表面，如t細(xì)胞和b細(xì)胞等；本文所稱“pd-1”包括人源pd-1蛋白及其重組蛋白。其中，人源pd-1蛋白的全長(zhǎng)包含288個(gè)氨基酸，這些氨基酸可以進(jìn)一步細(xì)分為以下幾個(gè)區(qū)域：信號(hào)肽：位于第1-20位氨基酸；胞外區(qū)：位于第21-170位氨基酸；跨膜區(qū)：位于第171-191位氨基酸；胞內(nèi)區(qū)：位于第192-288位氨基酸。

4、術(shù)語(yǔ)“總t細(xì)胞”是指：各種t淋巴細(xì)胞的總和。

5、術(shù)語(yǔ)“輔助t細(xì)胞”是指：cd4+t細(xì)胞，英文名為helper?t?cell，縮寫th，表達(dá)cd4。

6、術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性t細(xì)胞”是指：cd8+t細(xì)胞，英文名為cytotoxic?tlymphocyte，縮寫ctl，表達(dá)cd8。

7、術(shù)語(yǔ)“biotin”是指：生物素。

8、術(shù)語(yǔ)“sa”是指：鏈霉親和素，英文名為streptavidin。

9、術(shù)語(yǔ)“nhs羧基”是指：nhs活化的羧基，nhs是指n-羥基琥珀酰亞胺，英文名為n-hydroxy?succinimide。

10、術(shù)語(yǔ)“trishcl緩沖液”是指：含三羥甲基氨基甲烷(tris)的緩沖液。

11、術(shù)語(yǔ)“edta緩沖液”是指：含乙二胺四乙酸(edta)的緩沖液。

12、術(shù)語(yǔ)“mes緩沖液”是指：含2-嗎啉乙磺酸(mes)的緩沖液。

13、術(shù)語(yǔ)“cd45”是指：白細(xì)胞上的一種膜蛋白，在所有白細(xì)胞中均有表達(dá)。t淋巴細(xì)胞屬于白細(xì)胞，臨床上以cd45表達(dá)情況在流式上區(qū)分白細(xì)胞，再將t淋巴細(xì)胞從白細(xì)胞中篩選出來(lái)。

14、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面提供了一種用于pd-1蛋白表達(dá)檢測(cè)質(zhì)量控制的陽(yáng)性微球，所述陽(yáng)性微球通過表面有修飾基團(tuán)的微球與pd-1蛋白偶聯(lián)制得；其中：

15、所述微球?yàn)榇判曰蚍谴判晕⑶?，?yōu)選選自以下一種或多種：包含四氧化三鐵磁核的微球、包含三氧化二鐵磁核的微球、不含磁核的微球，更優(yōu)選為包含四氧化三鐵磁核的微球或包含三氧化二鐵磁核的微球，最優(yōu)選為包含四氧化三鐵磁核的微球。

16、根據(jù)本發(fā)明第一方面的陽(yáng)性微球，其中，

17、所述修飾基團(tuán)選自以下一種或多種：鏈霉親和素、羥基、羧基、nhs羧基，優(yōu)選為鏈霉親和素或nhs羧基，最優(yōu)選為鏈霉親和素；和/或

18、所述pd-1蛋白結(jié)合有生物素；

19、優(yōu)選地，所述陽(yáng)性微球和所述pd-1蛋白的質(zhì)量比為800～6667:1，更優(yōu)選為1000～6250:1，進(jìn)一步優(yōu)選為1587～3226:1。

20、本發(fā)明的第二方面提供了一種用于pd-1蛋白表達(dá)檢測(cè)質(zhì)量控制的微球產(chǎn)品，所述微球產(chǎn)品包括：第一方面所述的陽(yáng)性微球和未與所述pd-1蛋白偶聯(lián)的陰性微球；

21、優(yōu)選地，所述陰性微球和所述陽(yáng)性微球的體積比為1～4:1～4，更優(yōu)選為1～2:1～2，最優(yōu)選為2:1。

22、根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的陽(yáng)性微球和第二方面所述的微球產(chǎn)品，其中，

23、所述陰性微球和/或所述陽(yáng)性微球的粒徑均為1～6μm，優(yōu)選為1.5～5μm，更優(yōu)選為2～4μm：

24、所述陽(yáng)性微球和/或微球產(chǎn)品的比重均為1～5g/cm3，優(yōu)選為2～4g/cm3，更優(yōu)選為2～3g/cm3：和/或

25、所述陰性微球和/或所述陽(yáng)性微球的背景熒光與淋巴細(xì)胞不同。

26、本發(fā)明的第三方面提供了制備第二方面所述的微球產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟：

27、1)將磁性或非磁性材料微球懸浮于緩沖液中進(jìn)行分散，并將分散后的微球懸浮緩沖液分成陰性微球和陽(yáng)性微球原料；

28、2)將步驟1)分散好的陽(yáng)性微球原料與結(jié)合有生物素的pd-1蛋白進(jìn)行偶聯(lián)；

29、3)將步驟2)偶聯(lián)得到的微球進(jìn)行純化，得到所述陽(yáng)性微球；

30、4)將所述陰性微球和所述陽(yáng)性微球混合定容，即得所述微球產(chǎn)品。

31、根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中，

32、所述步驟1)中，所述磁性或非磁性材料微球懸浮的終濃度為0.1mg/ml～0.5mg/ml，優(yōu)選為0.1mg/ml～0.3mg/ml，最優(yōu)選為0.1mg/ml；和/或

33、所述步驟3)中還包括：對(duì)步驟2)偶聯(lián)后的微球進(jìn)行洗滌，去除游離狀態(tài)的pd-1蛋白，離心棄上清液，加入緩沖液，渦旋混勻，即得所述陽(yáng)性微球；

34、優(yōu)選地，所述步驟3)中，所述離心的時(shí)間為2～10min，更優(yōu)選為2～6min，進(jìn)一步優(yōu)選為2～4min。

35、根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中，所述步驟2)中還包括：將步驟1)中分散好的陽(yáng)性微球原料加入結(jié)合有生物素的pd-1蛋白，渦旋混勻得到分散液，然后將分散液垂直混勻，即得偶聯(lián)后的微球；

36、優(yōu)選地，所述結(jié)合有生物素的pd-1蛋白的加入濃度為0.15ng/μg～1.25ng/μg，更優(yōu)選為0.16ng/μg～1.00ng/μg，進(jìn)一步優(yōu)選為0.31ng/μg～0.63ng/μg；和/或

37、優(yōu)選地，所述偶聯(lián)的時(shí)間為30min～1.5h，更優(yōu)選為40min～1.0h，最優(yōu)選為1.0h。

38、根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中，所述步驟4)中還包括：將步驟1)中的陰性微球和步驟3)中的陽(yáng)性微球渦旋混勻，重懸于緩沖液中，即得所述微球產(chǎn)品；

39、優(yōu)選地，所述緩沖液選自以下一種或多種：磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、trishcl緩沖液、edta緩沖液、硼酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、mes緩沖液，更優(yōu)選選自以下一種或多種：磷酸鹽緩沖液、trishcl緩沖液、碳酸鹽緩沖液，最優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液；和/或

40、優(yōu)選地，所述緩沖液的ph值為7～8.5，更優(yōu)選為7.0～8.0，進(jìn)一步優(yōu)選為7.2～7.5。

41、本發(fā)明的第四方面提供了第一方面所述的陽(yáng)性微球或第二方面所述的微球產(chǎn)品在制備用于檢測(cè)細(xì)胞pd-1蛋白表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

42、優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為質(zhì)控品。

43、根據(jù)本發(fā)明第四方面的應(yīng)用，所述細(xì)胞為t淋巴細(xì)胞，所述t淋巴細(xì)胞優(yōu)選選自以下一種或多種：總t細(xì)胞、輔助t細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞。

44、根據(jù)本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種用于血液樣本淋巴細(xì)胞pd-1表達(dá)檢測(cè)的質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：

45、步驟1.微球材料的分散。

46、步驟2.微球與pd-1蛋白的偶聯(lián)。

47、步驟3.質(zhì)控微球的純化。

48、步驟4.質(zhì)控微球的混合定容。

49、微球材料特指：粒徑2.5-3.5μm、比重2-3g/cm3、表面修飾有鏈霉親和素的微球。

50、微球分散液組分為：磷酸鹽緩沖液(ph7-8)，微球以適宜濃度在分散液中。

51、微球與pd-1蛋白的偶聯(lián)，偶聯(lián)蛋白的量的范圍為在0.15ng/μg-1.25ng/μg。

52、質(zhì)控微球分為陰性質(zhì)控微球和陽(yáng)性質(zhì)控微球。兩種微球的混合比例與臨床需求相關(guān)，制備不同陽(yáng)性百分比的質(zhì)控微球，兩種微球的混合比例為20％-80％。

53、根據(jù)所述方法制備而來(lái)的用于淋巴細(xì)胞pd-1表達(dá)檢測(cè)的質(zhì)控品。

54、所述質(zhì)控品的質(zhì)控方法包括步驟：

55、1).質(zhì)控微球與pd-1抗體的結(jié)合。

56、2).使用清洗液對(duì)結(jié)合后的產(chǎn)物進(jìn)行清洗。

57、3).反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)。

58、4).檢測(cè)結(jié)果的分析。

59、其結(jié)果分析方法如下：

60、pd-1質(zhì)控微球的陽(yáng)性百分比應(yīng)在其95％置信區(qū)間范圍內(nèi)，如出現(xiàn)陽(yáng)性百分比波動(dòng)范圍超出95％置信區(qū)間范圍的情況，則提示檢測(cè)出現(xiàn)異常，需對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行排查及校準(zhǔn)。

61、根據(jù)另一個(gè)具體的實(shí)施例，基于步驟1-步驟4：所述微球?yàn)榱皆?-6μm、比重1-4g/cm3、表面修飾有鏈霉親和素的磁性或非磁性微球(材質(zhì))。

62、所述微球材料的分散，指將微球材料以一定終濃度懸浮于磷酸鹽緩沖液中，懸浮終濃度可以是0.1mg/ml至0.5mg/ml，本實(shí)施例優(yōu)選0.1mg/ml。

63、本發(fā)明首先對(duì)微球進(jìn)行了篩選。篩選條件包括微球的材質(zhì)、粒徑、比重、背景熒光以及表面修飾基團(tuán)性質(zhì)。

64、目前常用的微球包括含四氧化三鐵磁核、三氧化二鐵磁核、以及不含磁核，表面修飾有羥基、羧基、nhs羧基或鏈霉親和素的微球。考慮到所選微球原料需要兼顧生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性及使用的便捷性。本實(shí)施例優(yōu)先選擇含四氧化三鐵磁核、表面修飾有鏈霉親和素的微球。由于微球含有四氧化三鐵磁核，其比重能夠維持在合適的范圍，使其能夠與臨床樣本的操作條件統(tǒng)一，使用便捷。表面的鏈霉親和素修飾能夠保證生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。

65、同時(shí)，微球的材質(zhì)和粒徑，決定了流式檢測(cè)的電壓范圍?？紤]到后續(xù)本發(fā)明的質(zhì)控微球，將與臨床樣本一起進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)選擇檢測(cè)條件與臨床樣本兼容的微球，本實(shí)施例優(yōu)選粒徑在2-5μm，含四氧化三鐵磁核的微球；

66、另外，微球的比重，影響操作過程中離心的速率和時(shí)間，本發(fā)明對(duì)不同比重的微球進(jìn)行了篩選，確定比重大于2g/cm3的微球與臨床樣本中相應(yīng)細(xì)胞的離心條件一致；

67、微球的背景熒光以及表面修飾基團(tuán)的性質(zhì)，也會(huì)影響到質(zhì)控微球的性能。結(jié)合后續(xù)蛋白標(biāo)記及檢測(cè)需求，控制微球原材料的背景熒光與淋巴細(xì)胞能夠相互區(qū)分。

68、微球表面修飾基團(tuán)的種類，決定了后續(xù)微球與目標(biāo)蛋白的偶聯(lián)方法。目前較常見的修飾集團(tuán)包括羥基、羧基、氨基等化學(xué)基團(tuán)及igg、鏈霉親和素等生物蛋白基團(tuán)。微球表面蛋白偶聯(lián)方法包括戊二醛法、碳二亞胺法等化學(xué)交聯(lián)法，以及以鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)為代表的生物偶聯(lián)法。本發(fā)明選擇鏈霉親和素-生物素偶聯(lián)方法，相對(duì)于化學(xué)交聯(lián)，鏈霉親和素—生物素偶聯(lián)工藝簡(jiǎn)單，過程可控，偶聯(lián)效率高，產(chǎn)物穩(wěn)定性好。具體原理如下：

69、鏈霉親和素(streptavidin，sa)是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量約65kd，由4條相同的肽鏈組成，其中每條肽鏈都能結(jié)合一個(gè)生物素，二者親和常數(shù)(k)為1015mol/l，比抗原抗體間的結(jié)合力更強(qiáng)，且受溫度、ph、試劑影響較小，因此在免疫反應(yīng)中具有廣泛的應(yīng)用。

70、生物素是免疫反應(yīng)中常見的小分子偶聯(lián)物，常用于蛋白、抗體的標(biāo)記。標(biāo)記生物素的抗原可借助鏈霉親和素—生物素系統(tǒng)快速、穩(wěn)定的偶聯(lián)到修飾有鏈霉親和素的固相載體(微球)上。

71、進(jìn)一步的，本發(fā)明對(duì)蛋白偶聯(lián)條件進(jìn)行了優(yōu)化，

72、為滿足臨床使用需求，本發(fā)明對(duì)偶聯(lián)蛋白的濃度進(jìn)行了研究，分別對(duì)1.25ng/μg、0.63ng/μg、0.31ng/μg及0.16ng/μg的偶聯(lián)濃度進(jìn)行研究，通過標(biāo)記后的質(zhì)控微球在檢測(cè)通道內(nèi)的熒光值判斷偶聯(lián)濃度的適宜性。本實(shí)施例優(yōu)選0.31ng/μg的偶聯(lián)濃度。

73、進(jìn)一步的，本發(fā)明對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，分別偶聯(lián)10min、20min、40min等不同時(shí)間，使用垂直混勻儀，室溫(25℃)旋轉(zhuǎn)混勻20分鐘(20rpm/min)輔助偶聯(lián)反應(yīng)過程。

74、對(duì)偶聯(lián)后的微球進(jìn)行洗滌，以去除游離狀態(tài)的pd-1蛋白。包括以下步驟：

75、10000rpm離心3min，小心吸出上清；

76、加入50μl?1×pbs(ph7.4)，渦旋混勻；

77、重復(fù)以上步驟2次。

78、進(jìn)一步的，本發(fā)明對(duì)陰性質(zhì)控微球和陽(yáng)性質(zhì)控微球混合的比例進(jìn)行了優(yōu)化，

79、本實(shí)施例對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控微球和陰性質(zhì)控微球混合的比例進(jìn)行了優(yōu)化，分別以4︰1、2︰1、1︰1、1︰2以及1︰4的條件對(duì)微球進(jìn)行了混合，獲得陽(yáng)性百分比約80％，66％，50％，33％，以及20％的質(zhì)控微球，優(yōu)選陽(yáng)性質(zhì)控微球與陰性質(zhì)控微球1︰2混合，制備陽(yáng)性百分比約34％的質(zhì)控微球。

80、對(duì)混合后的微球進(jìn)行定容，將質(zhì)控微球重懸于1×pbs中，終濃度1mg/ml。

81、經(jīng)上述方法制備的質(zhì)控微球，使用便捷，性能穩(wěn)定。具體表現(xiàn)為，質(zhì)控微球全程參與淋巴細(xì)胞pd-1的檢測(cè)過程，包括pd-1抗體染色過程、流式檢測(cè)過程及數(shù)據(jù)分析過程，整體流程所適用條件均與淋巴細(xì)胞一致。質(zhì)控微球自身性能穩(wěn)定，在校準(zhǔn)后的流式設(shè)備上熒光穩(wěn)定，可對(duì)超出質(zhì)控微球陽(yáng)性百分比95％置信區(qū)間范圍的波動(dòng)給予示警，對(duì)pd-1的染色過程及流式設(shè)備波動(dòng)進(jìn)行提示。

82、另一方面，本發(fā)明提供了基于上述工藝制備的一種用于pd-1檢測(cè)的質(zhì)控微球。

83、另一方面，本發(fā)明提供了應(yīng)用所述質(zhì)控微球進(jìn)行質(zhì)控的方法，包括步驟：

84、(1).質(zhì)控微球染色

85、(2).反應(yīng)產(chǎn)物的流式檢測(cè)

86、(3).結(jié)果分析，根據(jù)陰陽(yáng)性質(zhì)控微球染色情況，對(duì)操作過程及檢測(cè)設(shè)備情況進(jìn)行質(zhì)控。

87、本發(fā)明通過對(duì)質(zhì)控微球制備工藝的優(yōu)化，使質(zhì)控微球與臨床樣本中的淋巴細(xì)胞性質(zhì)接近，染色操作過程及流式平臺(tái)檢測(cè)參數(shù)，可與臨床樣本保持一致，無(wú)需單獨(dú)操作，簡(jiǎn)化了質(zhì)控過程。只需在數(shù)據(jù)采集時(shí)設(shè)置質(zhì)控微球的數(shù)據(jù)采集方法，過程如下：

88、使用pd-1質(zhì)控微球進(jìn)行第一次檢測(cè)前，需確保流式細(xì)胞儀經(jīng)過日常質(zhì)控且運(yùn)行正常，以便在流式上設(shè)置檢測(cè)模板，設(shè)置檢測(cè)模板的具體方法如下：

89、a)打開流式軟件，使用原有淋巴細(xì)胞pd-1檢測(cè)模板對(duì)質(zhì)控微球進(jìn)行收樣，檢測(cè)條件及數(shù)據(jù)采集條件與原有淋巴細(xì)胞pd-1檢測(cè)的條件保持一致；

90、b)完成pd-1質(zhì)控微球數(shù)據(jù)采集后，選擇圈門工具，在cd45熒光與ssc散點(diǎn)圖中，將pd-1質(zhì)控微球的散點(diǎn)群選中，設(shè)置門名稱為“pd-1beads”；

91、c)選擇散點(diǎn)圖工具，新建pd-1熒光與ssc散點(diǎn)圖，選擇圈門工具，根據(jù)pd-1陰性和陽(yáng)性質(zhì)控微球比例圈陽(yáng)性門；

92、d)完成以上操作后，將模板保存為含pd-1質(zhì)控微球的淋巴細(xì)胞pd-1表達(dá)量檢測(cè)模板。

93、e)后續(xù)使用pd-1質(zhì)控微球進(jìn)行流式分析時(shí)，使用已保存的含pd-1質(zhì)控微球的淋巴細(xì)胞pd-1表達(dá)量檢測(cè)模板即可。

94、流式檢測(cè)后，首先分析質(zhì)控微球的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)過程進(jìn)行質(zhì)控。方法如下：

95、a)質(zhì)控微球結(jié)果分析：pd-1陰性與陽(yáng)性質(zhì)控微球在pd-1熒光—ssc散點(diǎn)圖上的位置正常、陽(yáng)性比例正常，則流式pd-1通道檢測(cè)光路正常，染色過程正常；

96、b)pd-1陰性質(zhì)控微球在pd-1熒光—ssc散點(diǎn)圖上的位置正常，陽(yáng)性百分比較低或無(wú)陽(yáng)性粒子，則提示流式pd-1通道檢測(cè)光路正常，染色過程異常；

97、c)pd-1陰性及陽(yáng)性質(zhì)控微球在pd-1熒光—ssc散點(diǎn)圖上的位置整體偏移，質(zhì)控微球陽(yáng)性百分比檢測(cè)值超出95％置信區(qū)間范圍，提示流式pd-1通道檢測(cè)光路出現(xiàn)異常，需進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。

98、基于上述問題，本發(fā)明主要解決以下技術(shù)問題：

99、創(chuàng)新性的開發(fā)了一種pd-1檢測(cè)用質(zhì)控微球，通過對(duì)微球材質(zhì)、粒徑、沉降系數(shù)等參數(shù)的篩選及微球表面標(biāo)記工藝的優(yōu)化，以穩(wěn)定的工藝，實(shí)現(xiàn)了兩種不同pd-1蛋白含量的質(zhì)控微球制備，為pd-1臨床樣本檢測(cè)全流程提供了靈敏的系統(tǒng)誤差質(zhì)控品。對(duì)pd-1蛋白免疫檢測(cè)操作過程和檢測(cè)設(shè)備狀態(tài)等系統(tǒng)誤差質(zhì)控效果可以達(dá)到：對(duì)超出質(zhì)控微球陽(yáng)性百分比95％置信區(qū)間范圍的波動(dòng)給予示警。指導(dǎo)使用者對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果可靠性進(jìn)行判斷。同時(shí)，質(zhì)控微球制備工藝穩(wěn)定，成本可控。本發(fā)明提供了該質(zhì)控微球的制備工藝和使用方法。

100、本發(fā)明提供了一種生物樣本中pd-1蛋白檢測(cè)用質(zhì)控微球及其制備和使用方法。通過篩選獲得含四氧化三鐵磁核、2.5-3.5μm表面修飾有鏈霉親和素的微球，使用本發(fā)明確定的制備工藝，在微球表面偶聯(lián)不同含量的pd-1蛋白，制備成固定陽(yáng)性百分比的pd-1質(zhì)控微球，制備工藝穩(wěn)定、成本低廉；同時(shí)，本發(fā)明提供了上述質(zhì)控微球在生物樣本檢測(cè)過程中的使用方法。使用上述質(zhì)控品，可以加強(qiáng)對(duì)生物樣本中pd-1蛋白檢測(cè)操作過程的質(zhì)量控制，并對(duì)超出質(zhì)控微球陽(yáng)性百分比95％置信區(qū)間的檢測(cè)波動(dòng)給予預(yù)警。

101、本發(fā)明的用于pd-1蛋白表達(dá)檢測(cè)質(zhì)量控制的陽(yáng)性微球、微球產(chǎn)品及其制備方法可以具有但不限于以下有益效果：

102、1、首次采用蛋白標(biāo)記微球的方式，實(shí)現(xiàn)pd-1檢測(cè)質(zhì)控品的制備。該質(zhì)控品為外部質(zhì)控品，可以對(duì)樣本pd-1蛋白檢測(cè)全過程進(jìn)行質(zhì)量控制，并對(duì)超出質(zhì)控微球陽(yáng)性百分比95％置信區(qū)間范圍的波動(dòng)進(jìn)行提示。

103、2、通過篩選和表面修飾，實(shí)現(xiàn)質(zhì)控微球與臨床樣本在操作和檢測(cè)流程等方面保持一致，操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)對(duì)pd-1蛋白檢測(cè)全流程系統(tǒng)誤差進(jìn)行質(zhì)控。

104、3、基于微球表面修飾的質(zhì)控微球制備工藝，工藝簡(jiǎn)單、可靠，穩(wěn)定性好。三批次質(zhì)控微球pd-1檢測(cè)熒光mean值的cv<3％。無(wú)需凍干等對(duì)設(shè)備和工藝要求高的工藝過程。

105、4、質(zhì)控微球包括兩種不同濃度pd-1蛋白標(biāo)記的質(zhì)控微球，兩種微球混合后作為一個(gè)獨(dú)立樣本，參與染色和檢測(cè)全過程，通過流式檢測(cè)結(jié)果中pd-1陽(yáng)性質(zhì)控微球的占比，判斷染色及檢測(cè)過程的系統(tǒng)誤差。質(zhì)控微球?qū)α鞒讨械牟僮髡`差或系統(tǒng)誤差反應(yīng)靈敏，可對(duì)超出質(zhì)控微球陽(yáng)性百分比95％置信區(qū)間范圍的波動(dòng)給予示警,有效提示臨床樣本檢測(cè)結(jié)果可靠性。且操作過程與臨床樣本相同，無(wú)需額外操作。

106、5、質(zhì)控微球穩(wěn)定性好，可于4℃保存12個(gè)月以上，相對(duì)已有技術(shù)制備的質(zhì)控品，更易保存和運(yùn)輸。