本發(fā)明涉及神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，用于分析免疫熒光染色后神經(jīng)元細(xì)胞膜上膜蛋白的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和大小測(cè)量，以及兩種熒光信號(hào)的共定位分析。本發(fā)明主要適用于對(duì)軸突-胞體突觸的共定位和定量分析。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)信號(hào)傳遞是生物體內(nèi)最重要的基本生物學(xué)過程之一，有助于促進(jìn)身體各個(gè)部分之間適當(dāng)?shù)膮f(xié)調(diào)和互動(dòng)。細(xì)胞膜蛋白在神經(jīng)信號(hào)傳遞中的作用研究成為了領(lǐng)域最關(guān)注的問題之一。在神經(jīng)信號(hào)傳遞的情況下，細(xì)胞膜蛋白的作用不僅限于維護(hù)細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性，還主要控制著神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和迅速傳遞。因此對(duì)神經(jīng)信號(hào)傳遞的研究離不開對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞膜蛋白的研究。

2、目前對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞膜蛋白的分離還停留在蛋白質(zhì)組學(xué)中，需要依靠蛋白組學(xué)的方法提取純化目標(biāo)蛋白用于后續(xù)研究，過程復(fù)雜且漫長，且對(duì)于多種膜蛋白的相互作用、共定位、分布情況無法獲知。

3、突觸前和突觸后膜蛋白的共定位分析是神經(jīng)科學(xué)研究中的重要技術(shù)，主要用于理解神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞機(jī)制。有助于理解不同膜蛋白之間的相互作用及其在突觸功能中的角色。通過分析膜蛋白的共定位變化，可以幫助理解神經(jīng)退行性疾病、精神疾病等的發(fā)病機(jī)制，識(shí)別關(guān)鍵膜蛋白的相互作用還可以為新藥物的靶點(diǎn)提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請(qǐng)的目的在于提供一種針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。

2、本申請(qǐng)實(shí)施例提供了一種針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，包括以下步驟：

3、s1、對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的切片進(jìn)行免疫熒光染色，層掃獲得rgb三通道的共聚焦圖片；

4、s2、選擇具有軸突-胞體突觸結(jié)構(gòu)的一張2d圖片，通過fiji軟件手動(dòng)選取細(xì)胞膜上感興趣的區(qū)域圖像，并將選取的圖像進(jìn)行拉直處理，獲得rgb三色通道下的線型細(xì)胞膜蛋白分布圖像；

5、s3、在步驟s2的基礎(chǔ)上，將獲得的原始圖像轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制圖像，再將兩張二進(jìn)制圖像重疊在一起形成合成圖像，合成圖像上顯示不同膜蛋白的分布和共定位信息；

6、s4、通過fiji軟件對(duì)合成圖像上的膜蛋白進(jìn)行定量分析，生成數(shù)據(jù)結(jié)果包括以下參數(shù)：所選感興趣區(qū)域圖像的面積和周長、突觸前和突觸后蛋白的數(shù)量和大小的測(cè)量值以及共定位區(qū)域的大小。

7、進(jìn)一步地，膜蛋白包括突觸前膜蛋白viaat、glyt2以及突觸后膜蛋白gephyrin、gabaars以及glyr簇。

8、進(jìn)一步地，選擇感興趣的區(qū)域圖像時(shí)，應(yīng)選擇同時(shí)具有突觸前膜和突觸后膜的免疫染色陽性熒光點(diǎn)，并避開非特異性的免疫熒光雜點(diǎn)。

9、進(jìn)一步地，在檢測(cè)膜蛋白大小時(shí)，設(shè)定膜蛋白大小的下限值，以排除假陽性結(jié)果。

10、進(jìn)一步地，共定位時(shí)，共定位的熒光點(diǎn)大小的算法為size>30％·kμm2，其中k為膜蛋白大小的下限值，30％定義為成熟突觸，即突觸前膜和突觸后膜上的熒光點(diǎn)存在至少30％的重疊度。

11、進(jìn)一步地，步驟s3中，原始圖像轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制圖像使用軟件的二進(jìn)制量化功能，將16bit的共聚焦圖像轉(zhuǎn)換為8bit圖像，使灰度圖像轉(zhuǎn)換為黑白圖像，其中全黑或全白的點(diǎn)可表示蛋白的表達(dá)和未表達(dá)情況。

12、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用fiji軟件可在神經(jīng)元細(xì)胞的熒光染色原始圖片上迅速獲得突觸細(xì)胞膜蛋白上的共定位、計(jì)數(shù)和大小信息。從而在研究分析相關(guān)蛋白時(shí)可更加高效、便捷、準(zhǔn)確。

技術(shù)特征：

1.一種針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，其特征在于，適用于抑制性突觸，包括突觸前膜蛋白viaat、glyt2以及突觸后膜蛋白gephyrin、gabaars以及glyr簇。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，其特征在于，選擇感興趣區(qū)域圖像時(shí)，應(yīng)選擇同時(shí)具有突觸前膜和突觸后膜的免疫染色陽性熒光點(diǎn)，并避開非特異性的免疫熒光雜點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，其特征在于，在檢測(cè)膜蛋白大小時(shí)，設(shè)定膜蛋白大小的下限值，以排除假陽性結(jié)果。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，其特征在于，共定位時(shí)，共定位的熒光點(diǎn)大小的算法為size>30％·kμm2，其中k為膜蛋白大小的下限值，30％定義為成熟突觸，即突觸前膜和突觸后膜上的熒光點(diǎn)存在至少30％的重疊度。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)軸突-胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，其特征在于，步驟s3中，原始圖像轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制圖像使用軟件的二進(jìn)制量化功能，將16bit的共聚焦圖像轉(zhuǎn)換為8bit圖像，使灰度圖像轉(zhuǎn)換為黑白圖像，其中全黑或全白的點(diǎn)可表示蛋白的表達(dá)和未表達(dá)情況。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種針對(duì)軸突?胞體突觸細(xì)胞膜蛋白的定量分析方法，通過對(duì)免疫熒光染色的神經(jīng)元細(xì)胞層掃獲得共聚焦圖片；通過Fiji軟件選取細(xì)胞膜上的感興趣區(qū)域圖像并拉直，獲得RGB三通道的線型細(xì)胞膜蛋白分布圖像；將獲得的原始圖像轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制圖像，再將兩張二進(jìn)制圖像重疊在一起形成合成圖像，合成圖像上顯示不同膜蛋白的分布和共定位信息；通過Fiji軟件對(duì)合成圖像上的膜蛋白進(jìn)行計(jì)數(shù)和大小標(biāo)記。本發(fā)明利用Fiji軟件可在神經(jīng)元細(xì)胞的熒光染色原始圖片上迅速獲得突觸細(xì)胞膜蛋白上的共定位、計(jì)數(shù)和大小信息。從而在研究分析相關(guān)蛋白時(shí)可更加高效、便捷、準(zhǔn)確。

技術(shù)研發(fā)人員：朱紅梅,陳艷英,趙一靈,吉勒斯·庫爾唐,帕斯卡爾·布朗謝羅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)紹興研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19