本發(fā)明屬于白血病檢測領(lǐng)域，特別涉及一種急性淋巴細(xì)胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、白血病是一類造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，因白血病細(xì)胞自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。白血病細(xì)胞大量增生累積，使正常造血受抑制并浸潤其他器官和組織。急性白血病的細(xì)胞分化停滯在較早階段，多為原始細(xì)胞及早期幼稚細(xì)胞，病情發(fā)展迅速。因此，迫切需要提高all的診斷和治療水平來改善患者的生存幾率。而對標(biāo)準(zhǔn)化療方案反應(yīng)差的all患者來說，盡管被分配到高風(fēng)險(xiǎn)組、采用高劑量的化療方案，這些患者的體內(nèi)依然可能殘存少量白血病細(xì)胞(mrd)。在all中，mrd的預(yù)后價(jià)值和臨床意義最早在1990年代在歐洲和美國的多家中心被提出，這一時(shí)期的相關(guān)研究已經(jīng)表明，殘留的白血病細(xì)胞水平對于疾病復(fù)發(fā)具有較強(qiáng)的預(yù)測作用，當(dāng)誘導(dǎo)治療結(jié)束時(shí)mrd水平若仍處于陽性水平，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。mrd細(xì)胞對化療藥物常呈現(xiàn)較強(qiáng)的耐受能力，且數(shù)量稀少，長期隱藏在患者體內(nèi)難于檢測，往往在化療之后再次大量增殖，引起疾病復(fù)發(fā)。而復(fù)發(fā)all患者的生存率一般僅不足30％。國際上，通常以萬分之一為界，超過萬分之一的mrd通常意味著更高的癌癥復(fù)發(fā)率。雖然對于mrd的檢測方法存在多樣性，但由于它們的靈敏度有限，真正的mrd陰性實(shí)際上難以達(dá)到，患者骨髓內(nèi)往往殘留著少量白血病細(xì)胞，這些白血病殘留細(xì)胞(mrd細(xì)胞)通常成為白血病復(fù)發(fā)的根源，因此，通過監(jiān)測mrd水平，可以在評估療效的同時(shí)，更早更準(zhǔn)確地預(yù)測疾病復(fù)發(fā)，從而在尚未復(fù)發(fā)時(shí)或復(fù)發(fā)早期提示采取介入治療手段，以提高患者的存活機(jī)率，改善患者的預(yù)后。

2、目前我國臨床mrd監(jiān)測以8-12流式檢測為主，通過檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，監(jiān)測疾病進(jìn)展中的mrd水平，精準(zhǔn)度可以達(dá)到10-3～-5。8色流式檢測技術(shù)作為目前臨床mrd檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，具有適用范圍廣、速度快等優(yōu)點(diǎn)，臨床上用于評估all的患者的早期治療反應(yīng)和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評估，其檢測的指標(biāo)主要包括cd10、cd19、cd20、cd33、cd34、cd38等發(fā)育階段相關(guān)的表面蛋白。cd10是存在于b前體細(xì)胞和成熟的中性粒細(xì)胞的一種表面蛋白；cd38是一種多功能的跨膜糖蛋白，它本身是胞膜受體，能夠影響b細(xì)胞的分化和增殖并在在b前體細(xì)胞中表達(dá)，然而，大多數(shù)b-all細(xì)胞的cd38表達(dá)減少。以上檢測指標(biāo)經(jīng)歷了長期的實(shí)驗(yàn)室以及臨床試驗(yàn)的探索和優(yōu)化，目前不同研究所所使用的組合仍不完全相同。另外，除了常見的檢測抗原以外，all細(xì)胞往往還表達(dá)其他重要且復(fù)雜的表面抗原，且在治療過程中all細(xì)胞表型往往會(huì)發(fā)生變化，骨髓移植后的患者通常幾乎沒有循環(huán)白細(xì)胞直至造血植入和重建，目前的流式檢測難以準(zhǔn)確評估免疫表型異變和精確檢測骨髓移植后患者的mrd水平，我們通常所說的“白血病相關(guān)免疫表型”(leukemia-associated?immunophenotype,laip)也僅是多個(gè)白血病亞克隆的組合。而復(fù)發(fā)難治患者的不良預(yù)后促使我們開發(fā)更加精準(zhǔn)的白血病鑒定方法，并有助于及時(shí)識別患者的早期復(fù)發(fā)。故目前的流式不足以評判all患者的預(yù)后。

3、白血病分化相關(guān)的表面抗原和胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平和患者的預(yù)后具有非常重要的相關(guān)性。國際上已有課題組采用單細(xì)胞質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對同一細(xì)胞中上述蛋白因子的平行檢測，證明這些“與復(fù)發(fā)相關(guān)的發(fā)育依賴性預(yù)測因子(ddpr)”具有重要的臨床價(jià)值，并根據(jù)ddpr建立了急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)預(yù)測模型，顯著改善了目前已有的風(fēng)險(xiǎn)分層方法。且ddpr鑒定的細(xì)胞表型也可為復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者提供合理的藥物靶點(diǎn)，對臨床具有重要的指導(dǎo)意義。但單細(xì)胞質(zhì)譜檢測(cytof)存在價(jià)格昂貴(數(shù)萬元/樣本)、檢測時(shí)間長(超過12小時(shí))等諸多問題，不適合臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是all細(xì)胞往往表達(dá)大量重要且復(fù)雜的表面抗原，且在治療過程中all細(xì)胞表型往往會(huì)發(fā)生變化，8色流式不足以準(zhǔn)確評估免疫表型異變和骨髓移植后患者的mrd水平，本發(fā)明可以同時(shí)檢測同一細(xì)胞的24種表面和胞內(nèi)抗原，不僅可以顯著提高mrd檢測精準(zhǔn)度，并通過將all細(xì)胞分為12個(gè)發(fā)育階段。研究白血病細(xì)胞的發(fā)育階段具有意義，主要在于其耐藥性往往與發(fā)育階段具有密切關(guān)系。許多研究表明，相對于成人all患者，兒童all患者具有更好的治療反應(yīng)和更長的無病生存期。其中一個(gè)可能的解釋是兒童all患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞通常處于較早的發(fā)育階段，比如前b細(xì)胞或者t細(xì)胞，這些細(xì)胞對化療藥物的敏感性更高。相比之下，成人all患者通常具有更成熟的b細(xì)胞表型，因而腫瘤細(xì)胞可能已經(jīng)發(fā)育到對化療藥物的耐藥性較高的階段。因此，針對24種抗原的檢測可以更精確識別初診時(shí)的免疫分型，以及骨髓移植后和car-t細(xì)胞治療后的免疫表型異變，這對患者的預(yù)后評估有非常重要的指導(dǎo)意義。此外，本發(fā)明納入了國際上已被驗(yàn)證的與白血病預(yù)后相關(guān)的白血病分化相關(guān)的表面抗原和胞內(nèi)蛋白的磷酸化水平相關(guān)抗原，這對于患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層和藥物靶點(diǎn)選擇具有重要的指導(dǎo)意義。

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種急性淋巴細(xì)胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒，所述試劑盒基于流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，其組成包括細(xì)胞懸液處理液、細(xì)胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液、固化處理液和細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液；其中，所述細(xì)胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液包括：抗cd19抗體、抗cd10抗體、抗cd73抗體、抗cd58抗體、抗ighs抗體、抗cd45rb抗體、抗cd95抗體、抗cd24抗體、抗cd33抗體、抗cd22抗體、抗cd38抗體、抗cd45抗體、抗cd127抗體、抗cd20抗體、抗cd34抗體和抗fvs620抗體。本發(fā)明通過精確的表面抗體比例用量，可以實(shí)現(xiàn)信號補(bǔ)償平衡，從而實(shí)現(xiàn)24色信號的同時(shí)獲取。

3、進(jìn)一步的，所述細(xì)胞懸液處理液包括stain?buffer和brilliant?stain?buffer。

4、進(jìn)一步的，所述固化處理液包括fix/perm和perm/wash。

5、進(jìn)一步的，所述細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液包括：抗p4ebp1抗體、抗zap70抗體、抗ighi抗體、抗cd179a抗體、抗cd179b抗體、抗tdt抗體、抗ps6抗體和抗pcreb抗體。

6、在第二方面，本發(fā)明提供了一種急性淋巴細(xì)胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

7、(1)采用stain?buffer和brilliant?stain?buffer處理細(xì)胞懸液；

8、(2)利用細(xì)胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液對步驟(1)的細(xì)胞懸液進(jìn)行染色；

9、(3)采用fix/perm和perm/wash固定和透化懸浮液中的細(xì)胞；

10、(4)利用細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液對步驟(3)的細(xì)胞懸液進(jìn)行染色；

11、(5)使用流式細(xì)胞儀檢測分析。

12、進(jìn)一步的，所述步驟(1)中是向1x106細(xì)胞懸液中加入2ml?stain?buffer洗細(xì)胞兩次，加入50μl?brilliant?stain?buffer后再加入細(xì)胞膜表面抗原的抗體預(yù)混液。

13、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中向細(xì)胞懸液中1ml?fix/perm后4度孵育40-50min，用2mlperm/wash洗細(xì)胞2次，加入50μl?perm/wash后再加入細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體預(yù)混液。

14、進(jìn)一步的，所述步驟(5)中用facsymphony上機(jī)，先圈活性單核細(xì)胞，調(diào)節(jié)補(bǔ)償之后進(jìn)行圈門，可將急性淋巴細(xì)胞白血病中異常的b細(xì)胞分為12個(gè)發(fā)育階段。

15、在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第一方面所述的急性淋巴細(xì)胞白血病高通量24色流式檢測試劑盒在急性淋巴細(xì)胞白血病免疫分型和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層中的用途。本發(fā)明提供的24色流式檢測試劑盒可以實(shí)現(xiàn)同一細(xì)胞中24種表面抗原和胞內(nèi)蛋白的平行檢測，并將急性淋巴細(xì)胞白血病中異常的b細(xì)胞分為12個(gè)發(fā)育階段，在顯著提高mrd檢測精準(zhǔn)度的同時(shí)更精確識別初診時(shí)的免疫分型，以及骨髓移植后和car-t細(xì)胞治療后的免疫表型異變，并通過已建立的急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)預(yù)測模型精確指導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病的治療與預(yù)后。

16、有益效果

17、①本發(fā)明的24色流式檢測試劑盒可以顯著提高mrd檢測精準(zhǔn)度，該技術(shù)所提供的豐富數(shù)據(jù)可以與其他分子生物學(xué)技術(shù)(如pcr、二代測序)相結(jié)合，進(jìn)一步提高all診斷和治療的精準(zhǔn)度。通過整合多維度的數(shù)據(jù)，臨床上可以全面了解all患者的疾病特征，制定更加個(gè)性化的治療方案。例如，可以結(jié)合基因突變和表面標(biāo)志物表達(dá)數(shù)據(jù)，預(yù)測患者對特定藥物的反應(yīng)，從而選擇最合適的治療方案。此外，24色流式能夠在更低的檢測限度下識別白血病細(xì)胞，這對于發(fā)現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和評估治療效果非常重要。靈敏的mrd檢測可以對患者及時(shí)調(diào)整治療策略，改善患者生存。

18、②本發(fā)明開發(fā)的24色流式檢測試劑盒在原有8色流式的基礎(chǔ)上增加了all細(xì)胞表面抗原，通過將all細(xì)胞分為12個(gè)發(fā)育階段，能更好的評估免疫表型異變和精確檢測骨髓移植后患者的mrd水平，對患者的預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。另外，這種多參數(shù)的分析能力使得檢測平臺能夠更全面地描述all細(xì)胞，識別其異質(zhì)性，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。例如，通過同時(shí)檢測多個(gè)表面標(biāo)志物，可以更精準(zhǔn)地鑒定和區(qū)分不同的白血病亞型，這對于選擇合適的治療方案至關(guān)重要。

19、③本發(fā)明開發(fā)的24色流式檢測試劑盒，在原有8色流式的基礎(chǔ)上，加上了白血病分化相關(guān)的表面抗原和胞內(nèi)蛋白，可以實(shí)現(xiàn)了同一細(xì)胞中24種表面抗原和胞內(nèi)蛋白的快速、廉價(jià)的平行檢測，由于all是一種高度異質(zhì)性的疾病，不同患者之間的細(xì)胞特征可能存在顯著差異。24色流式能夠詳細(xì)分析白血病細(xì)胞的異質(zhì)性，提供更豐富的細(xì)胞表型信息。這有助于揭示不同患者的細(xì)胞群體特征，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。例如，可以識別出對特定治療方案敏感或耐藥的細(xì)胞群體，從而優(yōu)化治療方案，提高治療效果。