本發(fā)明涉及骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體屬于中藥檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

骨痛藥酒是由制草烏、桑寄生、七葉蓮、威靈仙、虎杖、絡(luò)石藤、菝葜、蒼術(shù)(麩炒)、油松節(jié)、制何首烏、紅藤、丹參、接骨木、伸筋草、木瓜、川芎、牛膝、麻黃、香加皮、紅花、續(xù)斷和干姜制成的。骨痛藥酒具有祛風定痛，舒筋活絡(luò)作用，藥借酒勢，酒助藥威，可快速打通愈阻，暢通血管，經(jīng)絡(luò)，化解軟骨上的瘀血，分割粘連組織，就像溶解冰塊一樣，逐漸分解鈣化變形的增生骨刺。方中制何首烏為主藥，起祛風止痛之效?，F(xiàn)有的骨痛藥酒的質(zhì)量標準中，其內(nèi)容只有酒劑常規(guī)檢查項目，難以有效地控制藥品質(zhì)量。骨痛藥酒方中制何首烏為主藥，對其進行鑒別，有利于骨痛藥酒的質(zhì)量控制。因此，研究一種鑒別骨痛藥酒中制何首烏的方法，顯得尤為必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，能夠高效的鑒別骨痛藥酒中制何首烏成分，準確度高，分離度好。

本發(fā)明中骨痛藥酒，是由制草烏50g、桑寄生50g、七葉蓮50g、絡(luò)石藤25g、丹參25g、油松節(jié)37.5g、木瓜25g、麻黃12.5g、威靈仙25g、虎杖37.5g、菝葜25g、干姜6.25g、制何首烏25g、大血藤37.5g、接骨木50g、伸筋草12.5g、川芎12.5g、牛膝50g、香加皮50g、紅花12.5g、續(xù)斷50g和蒼術(shù)(麩炒)12.5g制成的。以上二十二味，粉碎成粗粉，照流浸膏劑與浸膏劑項下的滲漉法(《中國藥典》2015年版通則0189)，用酒糖液作溶劑(取砂糖430g，溶解于白酒4300g中)，浸漬48小時后，以每分鐘每公斤生藥1～3ml的速度緩緩滲漉，收集滲漉液，靜置，濾過，即得。

為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，是以何首烏對照藥材和2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品為對照，以體積濃度為40％～60％的醋酸為展開劑的薄層色譜法。

前述骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取，濾過，合并濾液，濾液濃縮，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材，加乙醇，加熱回流提取，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液、對照品溶液、供試品溶液，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為40％～60％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

進一步地，前述骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品80～120ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取3～6次，每次10ml～20ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至2～4ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.2g～0.3g，加乙醇15ml～30ml，加熱回流提取1～2h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至2～4ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液2～4μl、對照品溶液2～4μl、供試品溶液2～4μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為50％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

優(yōu)選地，前述骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品100ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取4次，每次10ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至2ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.25g，加乙醇20ml，加熱回流提取1h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至2ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液2μl、對照品溶液2μl、供試品溶液2μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為50％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

何首烏為蓼科植物何首烏polygonummultiflorumthunb.的干燥塊根。葉枯萎時采挖，削去兩端，洗凈，個大的切成塊，干燥，稱何首烏；炮制加工品，稱制何首烏。何首烏的炮制加工品，制成品為不規(guī)則皺縮狀的塊片，厚約1cm。表面黑褐色或棕褐色，凹凸不平。質(zhì)堅硬，斷面角質(zhì)樣，棕褐色或黑色。氣微，味微甘而苦澀。苦、甘、澀，溫。歸肝、心、腎經(jīng)。具有補肝腎，益精血，烏須發(fā)，強筋骨功效。用于血虛萎黃，眩暈耳鳴，須發(fā)早白，腰膝酸軟，肢體麻木，崩漏帶下，久瘧體虛；高血脂。主要適宜人群是脂肪肝，三高，肥胖癥，失眠，脫發(fā)，少白頭及亞健康人群。

本發(fā)明實驗將選取何首烏對照藥材和2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品作為雙對照，通過無水乙醇提取本品中活性成分，對制何首烏進行薄層鑒別，并考察不同點樣量、不同廠家薄層板、不同溫度、不同濕度對本品中制何首烏薄層色譜的影響。試驗結(jié)果表明：以何首烏對照藥材和2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品作為雙對照，以體積濃度為40％～60％的醋酸為展開劑，對制何首烏進行鑒別的薄層色譜法特征明顯，專屬性強，可作為本品中制何首烏的鑒別方法。

為了確保本發(fā)明鑒別方法科學(xué)、合理、有效，對本發(fā)明的鑒別方法進行了研究和考察。

1、儀器與試劑

ms304s/01電子天平，mettlertoledo(梅特勒-托利多)，醋酸(川江化學(xué))，氨水(重慶川江化學(xué)試劑廠)，乙醚(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)，正丁醇(西隴化工股份有限公司，分析純)，氫氧化鈣(西隴化工股份有限公司)，p-1型薄層色譜展開缸(上海信誼儀器廠有限公司)，聚酰胺薄膜(四甲生化)，硅膠g薄層板(青島海洋化工)，5μl點樣毛細管(天津市思利達科技有限公司)，sld-1薄層色譜攝影儀(天津思利達色譜技術(shù)開發(fā)公司)。

骨痛藥酒(批號20170201、20170202、20170203，貴州信邦制藥股份有限公司)，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)。

2、專屬性考察

吸取供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各2μl。按供試品溶液、陰性對照溶液、何首烏對照藥材溶液、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品溶液順序點于同一聚酰胺薄膜上，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視。色譜圖如圖1所示。供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，陰性對照色譜中相應(yīng)位置上無斑點。表明該方法的專屬性良好。

3、最佳點樣量的考察

分別吸取步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液1、2、3、4、5、6、8μl，分別點于不同聚酰胺薄膜上，進行考察，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視。其中，供試品溶液2μl點樣量效果最佳，當點樣量大于4μl時，供試品溶液位置斑點出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，點樣量低于2μl時，供試品溶液位置斑點不明顯；對照藥材溶液點樣量2～4μl時效果好，尤其是在2μl時效果最佳；對照品溶液點樣量2～4μl時效果好，尤其是在2μl時效果最佳，故選擇供試品溶液點樣量為2～4μl，最佳點樣量2μl；對照藥材溶液點樣量2～4μl，最佳點樣量2μl；對照品溶液點樣量2～4μl，最佳點樣量2μl。

4、耐用性考察

4.1、不同品牌聚酰胺薄膜

吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各2μl，按供試品溶液、何首烏對照藥材溶液、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品溶液點樣，更換不同品牌的聚酰胺薄膜，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。色譜圖如圖2所示，供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍色熒光斑點。且更換不同品牌薄膜后，各薄膜之間無顯著差異，表明更換不同品牌聚酰胺薄膜對制何首烏的薄層鑒別無影響。

4.2、濕度

吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各2μl，按供試品溶液、何首烏對照藥材溶液、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品溶液點樣，更換不同濕度，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。色譜圖如圖3所示，供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍色熒光斑點。且變換不同濕度后，各薄膜之間無顯著差異，表明變換不同濕度對制何首烏的薄層鑒別無影響。

4.3、溫度

吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各2μl，按供試品溶液、何首烏對照藥材溶液、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品溶液點樣，更換不同溫度，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。色譜圖如圖4所示，供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，且變換不同溫度后，各薄膜之間無顯著差異，表明變換不同溫度對制何首烏的薄層鑒別無影響。

現(xiàn)有技術(shù)中，骨痛藥酒標準中并未涉及2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷鑒別項目，本發(fā)明中使用體積分數(shù)為40％～60％的醋酸作為展開劑，優(yōu)選采用體積分數(shù)為50％的醋酸作為展開劑，保證最終的展開效果良好且沒有拖尾，達到了最佳的分離效果。

本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提供的一種骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，能夠高效的鑒別骨痛藥酒中制何首烏成分，準確度高，分離度好。本發(fā)明的方法可控性更高，操作簡單、分離度高、重現(xiàn)性好，并且陰性對照無干擾，不同廠家聚酰胺薄膜和溫度、濕度條件均不影響。本發(fā)明鑒別方法能夠?qū)峭此幘浦兄坪问诪醭煞诌M行準確、全面、科學(xué)有效的鑒別，提升了質(zhì)量檢測標準，進一步確保了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定、安全、有效。

附圖說明

圖1是本發(fā)明骨痛藥酒中制何首烏的專屬性鑒別色譜圖；

圖2是骨痛藥酒中制何首烏鑒別時不同品牌聚酰胺薄膜色譜圖；

圖3是骨痛藥酒中制何首烏鑒別時不同濕度條件下色譜圖；

圖4是骨痛藥酒中制何首烏鑒別時不同溫度條件下色譜圖；

圖中附圖標記的含義：圖1:1-供試品批號20170201，2-供試品批號20170202，3-供試品批號20170203，4-陰性對照，5-何首烏對照藥材，6-2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品；圖2：a-國藥集團化學(xué)試劑薄膜(薄膜規(guī)格：100×200mm)，b-上海鼓臣生物技術(shù)薄膜(薄膜規(guī)格：100×200mm)；圖3：a-濕度32％，b-濕度72％；圖4：a-溫度25℃，b-溫度8℃；圖2～圖4：1-供試品批號20170201，2-供試品批號20170202，3-供試品批號20170203，4-何首烏對照藥材，5-2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的介紹。

實施例1

骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品80ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取3次，每次20ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至3ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.2g，加乙醇15ml，加熱回流提取1.5h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至3ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液3μl、對照品溶液4μl、供試品溶液4μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為40％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

實施例2

骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品120ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取6次，每次15ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至4ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.3g，加乙醇30ml，加熱回流提取2h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至4ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液4μl、對照品溶液3μl、供試品溶液3μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為60％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

實施例3

骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品100ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取4次，每次10ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至2ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.25g，加乙醇20ml，加熱回流提取1h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至2ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液2μl、對照品溶液2μl、供試品溶液2μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為50％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

實施例4

骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品90ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取5次，每次20ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至3ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.28g，加乙醇20ml，加熱回流提取2h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至2ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液2μl、對照品溶液3μl、供試品溶液3μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為45％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。

實施例5

骨痛藥酒中制何首烏的鑒別方法，具體鑒別方法包括以下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取本品110ml置蒸發(fā)皿中，水浴上蒸至稠膏狀，加無水乙醇攪拌提取3次，每次10ml，濾過，合并濾液，濾液濃縮至2ml，作為供試品溶液；

(2)對照藥材溶液的制備：取何首烏對照藥材0.22g，加乙醇25ml，加熱回流提取1h，室溫自然冷卻，過濾，濾液濃縮至3ml，作為對照藥材溶液；

(3)對照品溶液的制備：取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品，加乙醇制成每1ml中含有1mg2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-o-β-d-葡萄糖苷對照品的溶液，作為對照品溶液；

(4)鑒別：照《中國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液2μl、對照品溶液3μl、供試品溶液2μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以體積濃度為50％的醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍色熒光斑點。