本發(fā)明涉及血液分析領(lǐng)域，特別涉及一種血液分析組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometryfcm)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析和分選的一門技術(shù)。在分析或分選過(guò)程中，包繞在流動(dòng)液體中處理過(guò)的單個(gè)細(xì)胞或微粒通過(guò)聚焦的光源，產(chǎn)生電信號(hào)，這些信號(hào)代表光散射、熒光等參數(shù)，以此測(cè)定出細(xì)胞或微粒的物理和化學(xué)性質(zhì)，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，以對(duì)其進(jìn)一步的培養(yǎng)或分析。包繞細(xì)胞的液流稱為鞘液。所用儀器稱為流式細(xì)胞儀(flowcytometerfcm)。流式細(xì)胞術(shù)綜合了光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫學(xué)、激光技術(shù)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多門學(xué)科和技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、精確、測(cè)量指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、方法靈活等特點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)作為一種定量分析技術(shù)，已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室常見的化驗(yàn)方法之一。血液分析儀試劑主要包括溶血素、染液。溶血素主要是嗜酸溶血素和嗜堿溶血素。血液分析儀試劑是一類強(qiáng)的表面活性劑，一個(gè)作用是溶解紅細(xì)胞，釋放出血紅蛋白(hgb)，形成穩(wěn)定的血紅蛋白衍生物，進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定。它的另一方面是溶解紅細(xì)胞，進(jìn)行白細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)。溶血素(hemolysin/haemolysin)，又稱細(xì)胞溶素(cy-totoxin)。確切的說(shuō)它是細(xì)胞溶素中的一部分，細(xì)胞溶素是指細(xì)菌分泌的能夠使細(xì)胞溶解的毒素。溶血素屬于穿孔毒素(pore-formingtoxin)，又名攻膜毒素(mem-branedisruptingtype)，是指任何能使紅細(xì)胞溶解并釋放出血紅蛋白的物質(zhì)。溶血素的作用和原理：1、溶血素用于流式細(xì)胞術(shù)hla-b27抗原篩查實(shí)驗(yàn)，其作用是溶解全血中的紅細(xì)胞。hla-b27是i型人類主要組織相容性抗原，在外周血主要表達(dá)在白細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞表面。用熒光素標(biāo)記抗hla-b27與淋巴細(xì)胞結(jié)合，即可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2、溶解紅細(xì)胞：以利于對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的熒光素標(biāo)記。在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，紅細(xì)胞體積和白細(xì)胞體積有重合的區(qū)域，而且紅細(xì)胞的個(gè)數(shù)是白細(xì)胞個(gè)數(shù)的近一千倍，影響對(duì)有意義的細(xì)胞(白細(xì)胞)的熒光抗體標(biāo)記和分選，因此在行流式細(xì)胞術(shù)時(shí)，必須加入溶血素，破壞掉紅細(xì)胞，才能準(zhǔn)確地對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行熒光素標(biāo)記。目前常用的溶血素成本為每瓶約1400元，科研成本較高；溶血需要約10～15min，溶血時(shí)間長(zhǎng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種血液分析組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明為做流式常規(guī)項(xiàng)目hla-b27抗原篩查提供一種了溶血?jiǎng)┘捌渑渲梅椒?，該溶血素溶解紅細(xì)胞速度快，成本低廉。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種血液分析組合物，包括甲酸、表面活性劑和穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述血液分析組合物中所述穩(wěn)定劑為鹽。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述血液分析組合物的ph值為7.4。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述血液分析組合物中所述鹽選自碳酸鈉、氯化鈉或硫酸鈉。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述血液分析組合物還包括固定劑。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述血液分析組合物還包括緩沖液和/或ph值調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以ml/g/g計(jì)，所述血液分析組合物中所述表面活性劑、所述穩(wěn)定劑與所述固定劑的質(zhì)量比為：(1～2):(1～2):(0.5～1)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述血液分析組合物中所述穩(wěn)定劑中碳酸鈉、氯化鈉和硫酸鈉的質(zhì)量比為：1:(2～5):(5～10)。本發(fā)明還提供了所述的血液分析組合物在溶血中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種溶血素，包括所述的血液分析組合物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述溶血素包括a、b、c三個(gè)組分：a組分由甲酸和水組成，甲酸和水的體積比為1:(800～1000)。作為優(yōu)選，甲酸和水的體積比為1:800。b組分由鹽和水組成；鹽由碳酸銨、氯化鈉和硫酸鈉組成；以g/g/g/ml計(jì)，碳酸銨、氯化鈉和硫酸鈉與水的質(zhì)量/質(zhì)量/質(zhì)量/體積為1:(2～5):(5～10):(150～200)。作為優(yōu)選，以g/g/g/ml計(jì)，碳酸銨、氯化鈉和硫酸鈉與水的質(zhì)量/質(zhì)量/質(zhì)量/體積為1:2:5:170。c組分由多聚甲醛和pbs緩沖液組成，以g/ml計(jì)，多聚甲醛與pbs緩沖液的質(zhì)量體積比為1:(100～150)。作為優(yōu)選，以g/ml計(jì)，多聚甲醛與pbs緩沖液的質(zhì)量體積比為1:100。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述a、b、c三個(gè)組分的體積比為(1～2):(1～2):(0.5～1)。作為優(yōu)選，所述a、b、c三個(gè)組分的體積比為1:1:0.5。本發(fā)明還提供了溶血素的配制方法。包括如下步驟：a液：以ml/g計(jì)，甲酸與蒸餾水的體積質(zhì)量比為1：(800～1000)；室溫保存；b液：碳酸銨、氯化鈉和硫酸鈉組成；以g/g/g/ml計(jì)，碳酸銨、氯化鈉和硫酸鈉與水的質(zhì)量/質(zhì)量/質(zhì)量/體積為1:(2～5):(5～10):(150～200)；c液：多聚甲醛與緩沖液的質(zhì)量比為1:(100～150)；加入ph值調(diào)節(jié)劑(如1mol/l的氫氧化鈉)，使ph值偏堿可以助溶解，充分?jǐn)嚢?；再用ph值調(diào)節(jié)劑(1mol/l的鹽酸)調(diào)ph值至7.4即可。溶血素的操作步驟：先加a液，震蕩觀察至透亮(約5～10s)，立即加入b液，震蕩后加入c液體。a液：b液：c液的體積比為(1～2):(1～2):(0.5～1)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述溶血素的配制方法如下：a液：甲酸0.6ml+500ml蒸餾水；室溫保存。b液：碳酸鈉(na2co3)：3g、氯化鈉：7.25g、硫酸鈉：15.65g；溶解于300ml蒸餾水；完全溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足至500ml。c液：多聚甲醛3g加入到300ml鞘液(pbs)中；加入氫氧化鈉(naoh)，使ph值偏堿可以助溶解，充分?jǐn)嚢?，待多聚甲醛完全溶解后再用鞘液補(bǔ)足至500ml。先加a液1.0ml，震蕩觀察至透亮(約5～10s)，立即加入b液2ml，震蕩后加入c液體0.5ml。再用1mol/l的鹽酸(hcl)調(diào)ph值至7.4即可。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，水優(yōu)選蒸餾水、雙蒸水或超純水。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括所述的血液分析組合物或所述的溶血素。本發(fā)明提供一種血液分析組合物及其應(yīng)用。該血液分析組合物包括甲酸、表面活性劑和穩(wěn)定劑，為做流式常規(guī)項(xiàng)目hla-b27提供一種了溶血?jiǎng)┘捌渑渲梅椒?，該溶血素溶解紅細(xì)胞速度快，成本低廉。本發(fā)明提供的血液分析組合物具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、成本節(jié)約：自配溶血素成本：按照自配溶血素的規(guī)格算，每瓶固體成品原料可夠配置溶血素33次，每次可配置溶血素體積為500ml，總共可供配置溶血素容積為33*500＝16500ml。自配溶血素價(jià)格每套(多聚甲醛、碳酸鈉等全部原料)約100元左右。廠家溶血素成本：溶血素規(guī)格：100ml，按1:9的比例用蒸餾水稀釋后用于實(shí)驗(yàn)，即每瓶可配置成溶血素溶劑為1000ml。每瓶廠家溶血素價(jià)格約為1400元。換算成自配溶血素每瓶可配置的體積16500ml，成本約為16500/1000*1400＝23100元。綜上，如果換成自配的溶血素，等體積的廠家成品溶血素成本是自配的溶血素成本的23100/100＝231倍。2、時(shí)間節(jié)約：用廠家提供的商品化溶血素，溶血時(shí)間為15分鐘，而用自配溶血素溶血時(shí)間僅為10秒，縮短了實(shí)驗(yàn)的等待時(shí)間和儀器的等待時(shí)間。3、本發(fā)明對(duì)溶血素和市售溶血素用于b27項(xiàng)目臨床樣本做了比對(duì)實(shí)驗(yàn)。從b27項(xiàng)目的樣本中挑選了陰性和陽(yáng)性兩個(gè)水平的樣本各20例，用本發(fā)明提供的溶血素嚴(yán)格把控時(shí)間進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果和用市售溶血素實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致(臨床靈敏度和特異性均為100％，正確度一致，攜帶污染率結(jié)果≤1％，儀器攜帶污染率≤1％)溶血性能良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示h1-1的攜帶污染率結(jié)果6347；圖2示h1-3的攜帶污染率結(jié)果6102；圖3示l1-1的攜帶污染率結(jié)果0；圖4示l1-3的攜帶污染率結(jié)果0；圖5示h2-1的攜帶污染率結(jié)果6581；圖6示h2-3的攜帶污染率結(jié)果6332；圖7示h2-1的攜帶污染率結(jié)果1；圖8示h2-3的攜帶污染率結(jié)果0；圖9示h3-1的攜帶污染率結(jié)果5968；圖10示h3-3的攜帶污染率結(jié)果6270；圖11示h3-1的攜帶污染率結(jié)果3；圖12示h3-3的攜帶污染率結(jié)果0。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種血液分析組合物及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的血液分析組合物及其應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1配置方法如下：a液：甲酸0.6ml+500ml蒸餾水；室溫保存。b液：碳酸鈉(na2co3)：3g、氯化鈉：7.25g、硫酸鈉：15.65g；溶解于300ml蒸餾水；完全溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足至500ml。c液：多聚甲醛3g加入到300ml鞘液(pbs)中；加入氫氧化鈉(naoh)，使ph值偏堿可以助溶解，充分?jǐn)嚢?，待多聚甲醛完全溶解后再用鞘液補(bǔ)足至500ml。再用1mol/l的鹽酸(hcl)調(diào)ph值至7.4即可。溶血素操作步驟：試管傾斜加入a液1.0ml振蕩至完全透亮(嚴(yán)格控制振蕩時(shí)間3～5s)：溶解時(shí)間過(guò)短，紅細(xì)胞破壞不完全，光散射分辨率降低，淋巴細(xì)胞門內(nèi)有紅細(xì)胞污染；溶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，碎片增加，干擾儀器對(duì)t淋巴細(xì)胞門的設(shè)置。立即加入b液1ml振蕩。隨后加入c液0.5ml。注意：(建議標(biāo)本量大時(shí)，溶血分若干工序進(jìn)行，每3管為一個(gè)工序，一個(gè)工序定義為：從加a液至加入c液結(jié)束)。實(shí)施例2配置方法如下：a液：甲酸0.6ml+480ml蒸餾水；室溫保存。b液：碳酸鈉(na2co3)：3g、氯化鈉：15g、硫酸鈉：15g；溶解于300ml蒸餾水；完全溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足至500ml。c液：多聚甲醛5g加入到750ml鞘液(pbs)中；加入氫氧化鈉(naoh)，使ph值偏堿可以助溶解，充分?jǐn)嚢瑁嗑奂兹┩耆芙夂笤儆们室貉a(bǔ)足至500ml。再用1mol/l的鹽酸(hcl)調(diào)ph值至7.4即可。溶血素操作步驟：先加a液2ml，震蕩觀察至透亮(約5～10s)，立即加入b液1.5ml，震蕩后加入c液體1ml。實(shí)施例3配置方法如下：a液：甲酸0.6ml+600ml蒸餾水；室溫保存。b液：碳酸鈉(na2co3)：3g、氯化鈉：6g、硫酸鈉：30g；溶解于300ml蒸餾水；完全溶解后再用蒸餾水補(bǔ)足至500ml。c液：多聚甲醛5g加入到750ml鞘液(pbs)中；加入氫氧化鈉(naoh)，使ph值偏堿可以助溶解，充分?jǐn)嚢瑁嗑奂兹┩耆芙夂笤儆们室貉a(bǔ)足至500ml。再用1mol/l的鹽酸(hcl)調(diào)ph值至7.4即可。溶血素操作步驟：先加a液1ml，震蕩觀察至透亮(約5～10s)，立即加入b液2ml，震蕩后加入c液體0.75ml。實(shí)施例4hla-b27抗原篩查(流式細(xì)胞術(shù))輔助溶血素試劑比對(duì)數(shù)據(jù)一、檢測(cè)系統(tǒng)信息：項(xiàng)目：hla-b27抗原篩查(流式細(xì)胞術(shù))儀器名稱：beckmancoulterfc500流式細(xì)胞儀儀器型號(hào)：cytomicsfc500mpl(sn:av08034)試劑及廠商：hla-b27kitbd公司hla-b27bdfacsbd公司檢測(cè)方法：流式細(xì)胞術(shù)對(duì)照組：bdfacs成品溶血素；實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明實(shí)施例1～3提供的溶血素。二、驗(yàn)證內(nèi)容及結(jié)果正確度：hla-b27運(yùn)用了beckmancoulterfc500mpl(序列號(hào)at08034)儀器進(jìn)行了bdfacs成品溶血素結(jié)果和本發(fā)明實(shí)施例1～3提供的溶血素結(jié)果檢測(cè)對(duì)比，分析的結(jié)果一致，故hla-b27實(shí)驗(yàn)通過(guò)了正確度驗(yàn)證。見表2。特異性：hla-b27運(yùn)用了cytomicsfc500mpl(序列號(hào)at08034)儀器進(jìn)行了bdfacs成品溶血素結(jié)果和本發(fā)明實(shí)施例1～3提供的溶血素結(jié)果檢測(cè)對(duì)比，分析的結(jié)果一致，故hla-b27實(shí)驗(yàn)特異性為100％。見表1。靈敏度：hla-b27運(yùn)用了cytomicsfc500mpl(序列號(hào)at08034)儀器進(jìn)行了bdfacs成品溶血素結(jié)果和本發(fā)明實(shí)施例1～3提供的溶血素結(jié)果檢測(cè)對(duì)比，分析的結(jié)果一致，故hla-b27實(shí)驗(yàn)靈敏度為100％。見表1。攜帶污染率：使用標(biāo)準(zhǔn)微球上機(jī)進(jìn)行測(cè)試，連續(xù)測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別計(jì)為h1-1，h1-2，h1-3，進(jìn)行一次樣品管反沖循環(huán)后，再進(jìn)行空白數(shù)量測(cè)試，連續(xù)測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別計(jì)為l1-1，l1-2，l1-3；按此程序循環(huán)3次，再按照以下公式計(jì)算攜帶污染率(ci)，取最大值。ci＝(l1-1-l1-3)/(h1-1-h1-3)*100％判定標(biāo)準(zhǔn)：ci≤1％檢測(cè)結(jié)果：如圖1～圖12所示。h1-1：6347；h1-3：6102；l1-1：0；l1-3：0；c1＝0％。h2-1：6581；h2-3：6332；l2-1：1；l2-3：0；c2＝0.04％。h3-1：5968；h3-3：6270；l3-1：3；l3-3：0；c3＝0.1％。比對(duì)實(shí)驗(yàn)前，對(duì)儀器進(jìn)行3次檢測(cè)的攜帶污染率結(jié)果≤1％，儀器攜帶污染率≤1％。符合要求。檢測(cè)時(shí)間為2015年5月。表1臨床特異度及臨床敏感度評(píng)估表表2正確度評(píng)價(jià)驗(yàn)證表(不同檢測(cè)系統(tǒng))綜合上述結(jié)果，本發(fā)明提供的溶血素hla-b27檢測(cè)項(xiàng)目正確度、特異性、靈敏性、攜帶污染率驗(yàn)證結(jié)果均可接受，可用于臨床標(biāo)本檢測(cè)。實(shí)施例5對(duì)照組：bdfacs成品溶血素；實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明實(shí)施例1～3提供的溶血素。生產(chǎn)、試驗(yàn)操作情況見表3。1、成本節(jié)約：(1)自配溶血素成本：按照自配溶血素的規(guī)格算，每瓶固體成品原料可夠配置溶血素33次，每次可配置溶血素體積為500ml,總共可供配置溶血素容積為33*500＝16500ml。自配溶血素價(jià)格每套(多聚甲醛、碳酸鈉等全部原料)約100元左右。(2)廠家溶血素成本：溶血素規(guī)格：100ml，按1:9的比例用蒸餾水稀釋后用于實(shí)驗(yàn)，即每瓶可配置成溶血素溶劑為1000ml。每瓶廠家溶血素價(jià)格約為1400元。換算成自配溶血素每瓶可配置的體積16500ml，成本約為16500/1000*1400＝23100元。(3)綜上，如果換成自配的溶血素，等體積的廠家成品溶血素成本是自配的溶血素成本的23100/100＝231倍。表3組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組生產(chǎn)成本(元)23100100#溶血時(shí)間15min10#s*示與對(duì)照組相比具有顯著差異(p＜0.05)，#示與對(duì)照組相比具有顯著差異(p＜0.01)。2、時(shí)間節(jié)約：用廠家提供的商品化溶血素，溶血時(shí)間為15min，而用自配溶血素溶血時(shí)間僅為10s，縮短了實(shí)驗(yàn)的等待時(shí)間和儀器的等待時(shí)間。實(shí)施例6對(duì)照組1：組分和配制方法同實(shí)施例1～3，ph值為7.2。對(duì)照組2：組分和配制方法同實(shí)施例1～3，ph值為7.3。對(duì)照組3：組分和配制方法同實(shí)施例1～3，ph值為7.5。對(duì)照組4：組分和配制方法同實(shí)施例1～3，ph值為7.6。實(shí)驗(yàn)組：實(shí)施例1～3，ph值為7.4。比較結(jié)果見表4。表4由表4可知，溶血素的ph值為7.4時(shí)，溶血時(shí)間較短，溶血效果較完全，細(xì)胞碎片較少，上機(jī)檢測(cè)效果較好，具有較好的靈敏度、特異性和正確度。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12